体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.013

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (1): 75-80.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.013

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

李伟伟¹，姚星宇²，杨丽敏³，赵鹏伟³，张国华⁴

内蒙古医科大学，¹研究生学院，³病原生物与免疫学研究中心，内蒙古自治区呼和浩特市 010059；²满洲里南区医院内科，内蒙古自治区满洲里市 021400；⁴内蒙古医科大学附属医院神经内科，内蒙古自治区呼和浩特市 010059

修回日期:2013-11-19 出版日期:2014-01-01 发布日期:2014-01-01
通讯作者: 张国华，主任医师，硕士研究生导师，内蒙古医科大学附属医院神经内科，内蒙古自治区呼和浩特市 010059
作者简介:李伟伟，男，1987年生，汉族，山西省临汾市人，内蒙古医科大学在读硕士，主要从事脑血管疾病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81360189)；内蒙古医科大学附属医院重大科研项目(NYFY ZD 2012004)

Induced differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into neural stem cells in vitro

Li Wei-wei¹, Yao Xing-yu², Yang Li-min³, Zhao Peng-wei³, Zhang Guo-hua⁴

¹Inner Mongolia Medical University Graduate School, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ²Department of Internal Medicine, Manzhouli Southern District Hospital, Manzhouli 021400, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ³Pathogenic Organisms and Immunology Laboratory of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ⁴Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Revised:2013-11-19 Online:2014-01-01 Published:2014-01-01
Contact: Zhang Guo-hua, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Li Wei-wei, Studying for master’s degree, Inner Mongolia Medical University Graduate School, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360189; the Major Scientific Research Program of the First Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, No. NYFY ZD 2012004

摘要/Abstract

摘要：

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始，并不受伦理、法律的限制，是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。
目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。
方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂，体外诱导人脐带间充质干细胞；在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化，并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况，实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。
结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变；免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白，并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2 以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脐带干细胞, 碱性成纤维生长因子, 表皮生长因子, 诱导分化, 神经干细胞, 巢蛋白, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Compared with mesenchymal stem cells from bone marrow and fat, human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, as one of the most potential cell sources to repair the central nervous system, are easy-based, more primitive, and not limited by ethical and legal.
OBJECTIVE: To explore differentiation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells into neural stem cells induced by the recombinant human basic fibroblast growth factor and recombinant human epidermal growth factor.
METHODS: The human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were induced by basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor in vitro. The cell morphology was observed by invert microscope. The
differentiation status was detected by immunofluorescence. The Nestin expression in mRNA level before and after induction was detected by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The neural stem cell balls were observed after induction. And the Nestin was detected by immunofluorescence and real-time PCR. Nestin could further differentiate to the neuronal markproteins neuron-specific enolase, microtubule-associated protein 2 protein and glial fibrillary acidic protein. Results from this study show that basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor can induce human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells to differentiate to neural stem cells, neurons and glial cells.

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, umbilical cord, neural stem cells, epidermal growth factor, fibroblast growth factors

中图分类号:

R394.2

李伟伟，姚星宇，杨丽敏，赵鹏伟，张国华. 体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(1): 75-80.

Li Wei-wei, Yao Xing-yu, Yang Li-min, Zhao Peng-wei, Zhang Guo-hua . Induced differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into neural stem cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(1): 75-80.

图/表（结果） 4

2.1 细胞形态学观察

诱导前人脐带间充质干细胞形态观察：人脐带间充质干细胞呈类纤维细胞贴壁生长，10-15 d可铺满瓶底；传代后的细胞生长速度加快，且细胞形态均一，呈梭形，并有一定方向性，漩涡状生长(图1)。

加入诱导剂后观察人脐带间充质干细胞形态学变化：各诱导组人脐带间充质干细胞经诱导12 h可见个别细胞形态发生变化，细胞变小折光性开始增强，24 h时可见部分细胞向胞核收缩、变短、折光性好；碱性成纤维生长因子组及混合诱导组48-72 h可见细胞进一步缩小、折光性增强，呈现出三角形、圆形及不规则形，个别细胞呈半漂浮状，且细胞数量逐渐增多聚集成球形，呈神经干细胞球样生长(图2A)；第7天时可见细胞球体积增大，数目增多，半悬浮状态(图2B)；继续培养可见在其周围逐渐爬出神经样细胞，细胞向一侧或两侧伸出较长的突起，呈简单的单极或双极神经样改变，突起逐渐伸长，并出现分支；第14天，可见细胞伸出较长的突起，且突起及其分支数量增多，并可见邻近细胞间相互连接成网状，呈现出典型神经细胞样改变(图2C)；有部分细胞形态未改变或呈碎片状，可见有少量细胞漂浮。表皮生长因子组仅可见简单的单极、双极细胞，而对照组人脐带间充质干细胞形态无明显变化，罕见类似的细胞。

2.2 人脐带间充质干细胞分化的鉴定

免疫荧光技术检测结果：4组细胞在第0天均可见极少量细胞巢蛋白染色阳性，神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、神经胶质原纤维酸性蛋白染色为阴性；3个因子诱导组在诱导第7天可见细胞胞浆呈现绿色荧光的巢蛋白阳性细胞均高于对照组，且碱性成纤维生长因子组、混合因子诱导组高于表皮生长因子组，混合因子诱导组高于碱性成纤维生长因子组；并开始出现细胞胞浆呈现绿色荧光的神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2及神经胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞，其趋势与巢蛋白的表达类似，而对照组在第7天时偶可见单个神经元特异性烯醇化酶、神经胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞，巢蛋白、微管相关蛋白2表达阴性。3个因子诱导组细胞在诱导第14天时巢蛋白阳性细胞有下降趋势，而神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2及神经胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞则不断增多，其所占比例持续升高；碱性成纤维生长因子组、混合因子诱导组高于表皮生长因子组，且混合因子诱导组高于碱性成纤维生长因子组(图3)；对照组在第14天时巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、神经胶质原纤维酸性蛋白均无阳性表达。

实时荧光定量PCR技术检测结果：实时荧光定量PCR结果显示4组细胞巢蛋白 mRNA在第0天时少量表达，3个因子诱导组在第7天时巢蛋白 mRNA表达均高于对照组，且碱性成纤维生长因子组、混合因子诱导组表达高于表皮生长因子组，混合因子诱导组表达高于碱性成纤维生长因子组(P < 0.05)，其趋势与免疫荧光检测技术结果类似。并随着时间的延长其表达逐渐降低，而对照组第7，14天时呈逐渐降低的趋势(图4，5)。

参考文献

[1] McMahon SS, Albermann S, Rooney GE, et al. Engraftment, migration and differentiation of neural stem cells in the rat spinal cord following contusion injury. Cytotherapy. 2010;12(3):313-325.

[2] 姚星宇,杨丽敏,张国华.不同途径移植HUBMNCs对脑出血大鼠神经功能的影响[J].中国卒中杂志,2012,7(10):786-797.

[3] Cao Q, Whittemore SR. Cell transplantation: stem cells and precursor cells. Handb Clin Neurol. 2012;109:551-561.

[4] Xiong N, Zhang Z, Huang J, et al. VEGF-expressing human umbilical cord mesenchymal stem cells, an improved therapy strategy for Parkinson’s diease. Gene therapy. 2011;18(4): 394-402.

[5] 李志营,步星耀,张圣旭,等.自体骨髓干细胞动员移植与手术移植治疗脊髓损伤的实验研究[J].中华临床医师杂志,2010,4(9): 1587-1594.

[6] Chen L, Zhang ZG, Chen B, et al. Brain-derived neurotrophic factor induces neuron-like cellular differentiation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood cells in vitro. Neural Regen Res. 2011;6(13):972-977.

[7] in’t Anker PS, Noort WA, Scherjon SA, et al. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogeneous multilineage differentiation potential. Haematologica. 2003;88(8):845-852.

[8] Zhou J, Tian GP, Wang JE, et al. In vitro differentiation of adipose-derived stem cells and bone marrow-derived stromal stem cells into neuronal-like cells. Neural Regen Res. 2011; 6(19):1467-1472.

[9] Pang KM, Sung MA, Alrash-dan MS, et al. Trans-plantation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord versus human umbilical cord blood for peripheral nerve regenera-tion. Neural Regen Res. 2010;5(11):838-845.

[10] Nekanti U, Mohanty L, Venugopal P, et al. Optimization andScale-up of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells for clinical applications. Stem Cell Res.2010;5(3):244-254.

[11] 姚星宇,杨丽敏,张国华. HUBMNCs中的神经样细胞研究[J].临床神经病学杂志,2013,26(1):41-43.

[12] Ma K, Fox L, Shi G, et al. Generation of neural stem cell-like cellsFrom bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Neurol Res. 2011;33(10):1083-1093．

[13] 张建富,孟庆海,金澎,等.全骨髓贴壁法获得纯化骨髓间充质干细胞向神经干细胞的诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(12):2240-2244.

[14] Scuteri A, Miloso M, Foudah D, et al. Mesenchymal stem cells neuronal differentiation ability: a real perspective for nervous system repair. Curr Stem Cell Res Ther. 2011;6(2):82-92.

[15] Rismanchi N, Floyd CL, Berman RF, et al. Cell death and long-term maintenance of neuron-like state after differentiation of rat bone marrow stromal cells: a comparison of protocols. Brain Res. 2003;991(1-2):46-55.

[16] Goldberg JL, Barres BA. The relationship between neuronal survival and regeneration. Annu Rev Neurosci. 2000;23: 579-612.

[17] 张毅敏,唐纯志,程少冰,等.针刺对创伤性脑损伤大鼠脑组织EGF和bFGF表达的影响[J].中国病理生理杂志,2012,28(6): 1132-1134.

[18] 吴晓娟,魏明发,柴成伟,等.胶质细胞源神经营养因子在大鼠骨髓间充质干细胞神经分化中的表达[J].实用儿科临床杂志,2009, 24(23):1806-1808.

[19] 王丰,屠冠军,朱悦. bFGF对神经干细胞分化为星形胶质细胞的影响[J].中国医科大学学报,2012,41(3):193-197.

[20] Brewer GJ. Regeneration and proliferation of embryonic and adult rat hippocampal neurons in culture. Exp Neurol. 1999; 159(1):237-247.

[21] Liu Y, Dulchavsky DS, Gao X, et al.Wound repair by bone marrow stromal cells through growth factor production. J Surg Res.2006:136(2):336-341.

[22] Fuse K, Tinner B. Zoli M, et al. Computer assisted mapping of basic fibroblast growth factor immunore active nerve cell population in the rat brain. J Chem Neuroanal. 1996; 11(1): 13-35.

[23] Li JS, Zhou YL, Liu K, et al. angiogenesis of brain after ischemia/reperfusion injury of brain in aged rats and changes in expressions of basic fibroblast growth factor factor and transformation growth factor-β1. Chin crit care med. 2010; 22(10):583-586.

[24] 石旺清,郑关毅,陈晓东,等.大鼠脑缺血/再灌注后bFGF和GAP-43的表达与神经再生[J].中国应用生理学杂志,2013,29(1): 63-67.

[25] Sanalkumar R, Vidyanand S, Lalitha Indulekha C, et al. Neuronal vs. glial fate of embryonic stem cell-derived neural progenitors(ES-NPs)is determined by FGF2/EGF during proliferation. J Mol Neurosci. 2010;42(1):17-27.

[26] Ciccolini F, Svendsen CN. Fibroblast growth factor2(FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. J Neurosci. 1998;18(19):7869-7880.

[27] 何丁文,殷嫦嫦,顾玉荣. bFGF和EGF诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经样细胞[J].基础医学与临床,2013,33(4):444-449.

[28] Mckay R. Stem cells in the central nervous system. Science. 1997;276(5309):66-71.

[29] Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RD. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell. 1990;60(4):585-595.

[30] Chen N, Kamath S, Newcumb J, et al. Trophic factor induction of human umbilical cord blood cells in vitro and in vivo. J Neural Eng. 2007;4(2):130-145.

[31] Maslov AY, Barone TA Plunkett RJ. et al. Neural stem cell detection, characterization. and age-related changes in the subventricular zone of mice. J Neurosci.2004;24(7): 1726-1733.

[32] Zulewski H, Abraham EJ, Gerlach MJ, et al. Multipotential nestin-positive stem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivo into pancreatic endocrine, exocrine, and hepatic phenotypes. Diabetes. 2001;50(3):521-533.

[33] Piras F, Ionta MT, Lai S, et al. Nestin expression associates with poor prognosis and triple negative phenotype in locally advanced (T4) breast cancer. Eur J Histochem. 2011;55(4): e39.

引言

材料方法

设计：细胞形态学观察。

时间及地点：于2013年4至10月在内蒙古医科大学病原生物与免疫学研究中心完成。

材料：
脐带及脐血：取自内蒙古医科大学附属医院足月健康新生儿脐带及脐血，均经新生儿父母知情同意并签订协议书。并经医院伦理委员会同意，符合医学伦理学标准。

实验方法：

人脐带间充质干细胞的分离和培养：无菌条件下取足月健康新生儿脐带及脐血，收集脐血离心后取上层血清灭活后备用；采用含1%的双抗(青、链霉素)PBS反复冲洗脐带内外，并剥离脐血管，采用组织剪将其剪碎至0.1 cm³大小均匀平铺于培养皿中，加入含体积分数5%人脐血血清培养基，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养，静置7 d后可见组织块周围有细胞爬出，震荡并全量换液，之后每3 d半量换液，待细胞长满瓶底80%-90%融合时用0.25%的胰酶进行消化并传代计做P1代。

人脐带间充质干细胞的诱导分化：取P3代处于对数生长期的人脐带间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞数，按2×10⁹ L^-¹浓度接种于25 cm²培养瓶中，24 h后更换成含2% B27的DMEM/F12培养基；分别加入不同的诱导剂进行干预：表皮生长因子组加入20 µg/L的表皮生长因子；碱性成纤维生长因子组加入20 µg/L的碱性成纤维生长因子；混合因子诱导组分别加入20 µg/L的表皮生长因子和20 µg/L的碱性成纤维生长因子；对照组不加任何生长因子，余条件相同。

形态学观察：在倒置相差显微镜下动态的观察细胞的生长情况及其形态学变化，并拍照记录。

免疫荧光法对人脐带间充质干细胞分化的鉴定：分别收集4组第0，7，14天细胞并制备细胞爬片，行神经干细胞标记蛋白巢蛋白、神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2及神经胶质细胞标志蛋白神经胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞学鉴定；具体方法如下：40 g/L的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次；0.5%的Triton X-100室温通透20 min，浸洗3次并吸干；滴加牛血清白蛋白室温封闭30 min，吸干封闭液，分别滴加稀释好的一抗巢蛋白 (1∶50)、神经元特异性烯醇化酶(1∶200)、微管相关蛋白2 (1∶200)、神经胶质原纤维酸性蛋白(1∶400)，放入湿盒4 ℃孵育过夜；浸洗3次吸干，滴加1∶200稀释的荧光二抗，湿盒中37 ℃孵育1 h，浸洗3次，DAPI复染核，50%甘油封固，荧光显微镜下观察并采集图像。采用PBS代替一抗做阴性对照，余步骤相同。

实时荧光定量PCR检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白 mRNA水平的相对表达量：

RNA的提取及反转录：根据TaKaRa公司的Trizol总RNA提取试剂盒提取RNA。将8 μL的RNA加入反转录体系合成cDNA，其中5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2 μL，总反应体系为10 μL。置入PCR仪中反转录，反转录条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

巢蛋白引物根据GenBank公布的基因序列，采用引物设计软件Primer5.0设计引物，上游引物5’-CTC CAA GAA TGG AGG CTG TAGG AA-3’，下游引物5’-CCT ATG AGA TGG AGC AGG CAA GA-3’，采用 SYBR Premix Ex TaqⅡ荧光染料法进行实时定量 PCR 扩增的检测。PCR反应体系为20 μL，其中SYBR premix Ex TaqⅡ(2×) 10 μL、PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Rrimer 0.8 μL、ROX Reference Dye(50×)or DyeⅡ(50×)0.4 μL、template 2 μL、dH₂O 6 μL；置于实时荧光定量PCR仪中扩增，反应条件为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，45个循环后，72 ℃延伸10 min。

主要观察指标：①体外诱导脐带间充质干细胞神经分化的形态特征变化。②各组细胞诱导的形态学变化。③免疫荧光法检测神经细胞标记蛋白巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、神经胶质原纤维酸性蛋白的表达情况。④实时荧光定量PCR检测神经干细胞标记巢蛋白的表达情况。
统计学分析：应用SPSS 13.0软件，计量资料用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。相同时间点不同组样本均数之间的比较经正态分布检验并且方差齐采用单因素方差分析；不同时间点相同组间多个样本均数之间的比较采用区组设计的方差分析；组间比较采用具有一个重复测量的两因素方差分析法。

全文链接：

讨论

人脐带间充质干细胞是否能向神经干细胞分化是临床应用的重要前提，目前体外诱导干细胞神经分化的方法有：化学制剂诱导法及细胞生长因子诱导法^[14]。前者诱导速度较细胞因子快，分化效果明显，但化学毒物导致细胞存活时间明显短于细胞因子诱导法^[15]。神经营养因子是常用的生物制剂，对神经细胞的存活、增殖、分化、凋亡有着重要的意义。目前已经发现碱性成纤维生长因子、表皮生长因子在脑损伤后在脑内的表达量升高^[16-17]，认为可能与神经再生及修复有关，且国内外已有研究发现碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞^[18]，而对人脐带间充质干细胞是否有同样的效果还鲜有报道。

碱性成纤维生长因子是一种广谱的神经营养因子和促有丝分裂因子，研究显示碱性成纤维生长因子除了促进干细胞增殖作用外^[19]，还可决定其分化方向，低浓度碱性成纤维生长因子是具有诱导干细胞向神经元样细胞分化的作用^[20]。表皮生长因子是一类结合酪氨酸激酶受体, 具有调节细胞生长、分化的蛋白多肽，同碱性成纤维生长因子一样具有丝裂原作用，并可协同碱性成纤维生长因子促进神经细胞的存活和分化，共同调节轴突和树突的生长^[21]，在神经系统的发育过程中具有重要作用。

碱性成纤维生长因子和表皮生长因子在胚胎与成体的中枢神经系统及周围神经系统发育中均有表达，其中碱性成纤维生长因子在胚胎期神经系统中表达更高^[22]，同时其在神经系统损伤时亦是高表达^[23-24]，因此认为碱性成纤维生长因子较表皮生长因子对神经系统的“生长发育”可能发挥更重要的作用；有研究报道碱性成纤维生长因子主要促进骨髓间充质干细胞向神经元方向分化，而表皮生长因子主要使其分化为神经胶质细胞^[25]。Ciceolini等^[26]研究发现碱性成纤维生长因子首先对大鼠脑内处于应激状态下的神经前体细胞发生作用，进而促进神经前体细胞对表皮生长因子的反应性，二者联合使用具有明显协同的作用，能发挥更强的增殖效应。亦有研究报道碱性成纤维生长因子、表皮生长因子联合应用较二者单独使用能使得骨髓间充质干细胞分化更多的神经元、神经胶质细胞^[27]。

神经干细胞是指具有自我增殖、更新能力，可分化为神经元及神经胶质细胞^[28]；其缺乏成熟神经元以及神经胶质细胞的特征性标志物，可表达巢蛋白，该蛋白早已作为神经干细胞的特征性标志蛋白^[29]。本实验采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂，对人脐带间充质干细胞进行神经分化，发现表皮生长因子组、碱性成纤维生长因子组以及表皮生长因子+碱性成纤维生长因子组在第7天时是巢蛋白表达显著升高，而对照组表达有下降趋势，说明生长因子对人脐带间充质干细胞发挥了促神经分化作用。其中以表皮生长因子+碱性成纤维生长因子组最显著，并碱性成纤维生长因子组高于表皮生长因子组，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明两种生长因子具有一定协同作用^[26]，共同促进了人脐带间充质干细胞的神经转化及细胞的增殖分裂，而碱性成纤维生长因子在神经干细胞的增殖及分化中发挥重要作用。在诱导14 d时3组细胞巢蛋白表达均有下降趋势，是由于巢蛋白是一种中间纤维蛋白，它在神经干细胞分化早期时呈阳性表达^[30]，而当神经干细胞向神经终末方向分化时，会随着神经元、神经胶质细胞的逐渐成熟，巢蛋白表达逐渐降低并转为阴性^[31]。

神经元特异性烯醇化酶是一种可溶性酸性蛋白，是烯醇酶的同工酶之一。神经元特异性烯醇化酶可作为神经元和神经内分泌细胞的标志酶，常被用于研究体内外神经元的分化发育过程；微管相关蛋白2是分布于神经元胞浆和神经突起中的细胞骨架蛋白，主要存在于成熟神经元的胞体以及树突中，亦可作为神经元的标志蛋；神经胶质原纤维酸性蛋白是神经胶质细胞内骨架蛋白的主要成分，可作为星形胶质细胞的特异性蛋白。在诱导第14天时免疫荧光及实时荧光定量PCT均检测到表皮生长因子组、碱性成纤维生长因子组以及表皮生长因子+碱性成纤维生长因子组细胞巢蛋白表达降低，且3组细胞行免疫荧光均检测到神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2以及神经胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞比例升高；而对照组巢蛋白在第14天时表达仍呈降低趋势，且罕见神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、神经胶质原纤维酸性蛋白的阳性表达，说明人脐带间充质干细胞可在体外被碱性成纤维生长因子、表皮生长因子诱导分化为神经干细胞。实验应用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子体外诱导，在人脐带间充质干细胞分化第7天时行免疫荧光及实时荧光定量PCR检测巢蛋白呈高表达，并结合细胞形态学及继续分化后神经细胞蛋白的表达可认为人脐带间充质干细胞转化为了神经干细胞。且以碱性成纤维生长因子+表皮生长因子组最为显著。

近几年研究发现巢蛋白并非是神经干细胞的专有标记物，在一些非神经干细胞中亦有巢蛋白的短暂表达，如胰岛祖细胞以及伴随内皮祖细胞增殖的肿瘤细胞等^[32-33]。因此下一步将继续采用新近报道的神经干细胞标记物，如sox-1、sox-2和pax-6等对诱导后的细胞进行鉴定及探讨。

综上，本研究从细胞形态学、表面特异性标志物巢蛋白以及mRNA水平均证明了人脐带间充质干细胞体外诱导后神经干细胞的形成，且可进一步分化表达神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2 、神经胶质原纤维酸性蛋白，有可能成为神经系统损伤后修复作用的理想细胞来源。但异基因脐带源性神经干细胞移植入生物体后是否可以同机体脑组织中的神经细胞之间发生突触连接、具有电生理功能及促进神经递质的释放仍有待进一步的深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

Induced differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into neural stem cells in vitro

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.