大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前，对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。
目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。
方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠，无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓，用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞，通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化，在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。
结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞，经流式细胞仪分析，培养出的细胞CD34阳性率为17.5%，CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%，与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法，两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞，CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 细胞示踪, CM-DiI, CD34, CD44, CD90, 细胞增殖, 细胞培养

Abstract:

BACKGROUND: Currently, there is no uniform, standardized approach to isolate, purify and proliferate bone marrow mesenchymal stem cells. Chlormethylbenzamido-1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine (CM-Dil) is a stable, reliable, high marking and simple marker.
OBJECTIVE: To develop the methods for isolation, culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.
METHODS: Two male Sprague-Dawley rats, weighing 50-100 g were taken to collect the bilateral femur and tibia bone marrow under sterile conditions, and then, primary bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured using bone marrow adherent separation and density gradient centrifugation. Cells were amplified and purified through timely and repeated passage, and labeled at the third generation with fluorescent dyes CM-Dil in vitro as a source of donor cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured successfully in vitro using bone marrow adherent separation and density gradient centrifugation separation methods, but the former was superior to the latter in the number of cultured cells significantly, while the two methods were not different significantly in terms of cell viability and proliferation. Flow cytometry results showed that the positive rates of cultured cells were 17.5% for CD34, 97.9% for CD44, and 91% for CD90. CM-Dil can label bone marrow mesenchymal stem cells successfully, which is a stable, reliable, high marking and simple marker.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, cells, cultured, biological markers

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 两种方法培养的原代细胞形态 刚接种的细胞在光镜下呈圆形或类圆形，大小不一，数目较多，混有大量红细胞及其他杂细胞；24 h后，仍有数目较多的圆形细胞悬浮于培养液中，仅有少数类圆形细胞贴壁；48 h后半量换液，经72 h全量换液，见贴壁细胞呈类圆形或椭圆形、纺锤形、梭形，核浆分界清楚，胞核大多数为单核、圆形，位于细胞中心位置(图1A)；此后多次换液后，于五六天时梭形细胞逐渐增多，悬浮细胞逐渐减少(图1B)；八九天时大部分细胞变为梭形，少部分呈多角形，基本不见杂细胞，此期细胞生长迅速，12-14 d可覆盖瓶底90%-95%。

2.2 两种方法培养传代细胞形态 将原代细胞或上一代细胞的单细胞悬液传代接种，光镜下见刚传代接种的细胞变为圆形，接种后6-8 h贴壁，而后逐渐又变为梭形，少量呈多角形。传代细胞生长迅速，三四天即可达80%以上融合。经两三次传代后，细胞呈单一梭形成纤维样，细胞突起增长增粗，彼此联系，细胞排列成旋涡状、网状或鱼群状(图1C)。

2.3 骨髓间充质干细胞的鉴定经流式细胞仪分析，培养出的细胞CD34阳性率为17.5%，CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%，与骨髓间充质干细胞表面抗原一致，证明为骨髓间充质干细胞(图2)。

2.4 CM-DiI荧光标记骨髓间充质干细胞 荧光显微镜下观察，CM-DiI荧光标记后全部细胞均显红色荧光(图3A)。

2.5 观察移植后CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞结果 经微量注射器心肌内移植CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞后4周，用荧光显微镜在心肌组织冰冻切片中可找到发红色荧光的骨髓间充质干细胞，这些细胞向心肌损伤区域迁移(图3B)。

2.6 全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养骨髓间充质干细胞比较 全骨髓贴壁分离法培养出的第3代骨髓间充质干细胞细胞计数为1.5×10⁷，而密度梯度离心法培养出的第3代骨髓间充质干细胞细胞计数为1.1×10⁷，说明两种方法培养的细胞数量前者明显多于后者(P < 0.05)，而两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力则无明显差异(P > 0.05)(图4)。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：实验于2013年1至5月在昆明医科大学第一附属医院细胞培养实验室完成。

材料：

实验动物：1月龄雄性SPF级SD大鼠4只，体质量50-100 g，由昆明医学院实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准^[7]。

实验方法：

全骨髓贴壁分离法^[2]：原代培养选用100 g左右，雄性清洁级SD大鼠2只，颈椎脱臼法处死后在体积分数为体积分数75%的乙醇中浸泡5 min。准备好两套已消毒的手术器械，用第1套器械除去大鼠双下肢腿部的皮肤，然后在尽量保持大鼠双股骨和胫骨完整性的条件下，将大鼠双下肢剪下，将剪下的股骨胫骨置于已消毒并盛有含双抗的PBS平皿中浸泡5 min，转移置于超净工作台上。然后在无菌条件下，用第2套器械处理股骨胫骨上残留的肌肉。

置于体积分数15%胎牛血清的DMEM中，用剪刀将双侧股骨、胫骨、腓骨剪成小块，后用血管钳将小块骨组织咬成更细小的组织反复冲洗混匀。经200目细胞筛过滤，制成单细胞悬液，离心，1 000 r/min 10 min，弃上清液，再加入体积分数15%胎牛血清DMEM，反复吹打成单细胞悬液，均匀接种于6孔培养板中。置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿度孵箱内孵育。48 h半量换液，经72 h全量换液，待贴壁率达80%-90%融合后，按1∶2消化传代。

密度梯度离心法^[3]：原代培养大鼠取材同全骨髓贴壁分离法步骤。用剪刀分别剪去股骨、胫骨两端的骨骺，暴露骨髓腔，用5 mL注射器吸取4 mL含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM冲出骨髓，收集全部骨髓细胞于离心管，反复吹打成单细胞悬液。吸管将平皿中的细胞悬液吹打混匀，然后将悬液贴壁轻轻加入到预置等体积Percoll分离液(1.073 g/mL)的离心管中，悬于上层，离心，2 500 r/min，30 min，离心后液体分为3层：上层为上清液；中层为云雾状白膜层；下层为红细胞。用吸管小心吸取中层的云雾状白膜层并置于另一离心管中，此分层液富含所分离的单个核细胞，LG-DMEM洗涤2次(1 000 r/min，5 min)，弃上清液，用含体积分数15%胎牛血清LG-DMEM重悬细胞，以1.5×10⁵/cm²接种细胞于25 cm²培养瓶中，置于饱和湿度、37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱。首次换液分2种情况：24 h或48 h换液，用未贴壁的细胞继续培养，以后每3 d换液1次，换液后在倒置显微镜下观察细胞形态，作标记为原代(Passage 0，P0代)。

骨髓间充质干细胞鉴定^[8]：流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞的CD34、CD44、CD90表面标志。取第3代骨髓间充质干细胞，待细胞长到近90%融合时，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3-5 min，制成单细胞悬液并计数，分别取1×10⁶个骨髓间充质干细胞用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原CD34、CD44、CD90的表达情况。

CM-DiI荧光标记骨髓间充质干细胞^[9]：按照试剂盒说明书上超作，将第3代骨髓间充质干细胞消化后稀释成1×10⁹ L^-¹，每1 mL细胞液加入CM-DiI标记液5 μL，吹打成细胞悬液。在37 ℃的细胞培养箱孵育20 min，孵育结束后，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗2次。取少量细胞进行细胞爬片，荧光显微镜观察。

主要观察指标：①两种方法培养的原代细胞形态。②两种方法培养传代细胞形态。③骨髓间充质干细胞的鉴定。④观察移植后CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞结果。⑤两种方法分离培养骨髓间充质干细胞数量、活性及细胞增殖比较。

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讨论

目前，对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法^[1]。常用从骨髓细胞中分离骨髓间充质干细胞的方法主要有：①全骨髓贴壁分离法^[2-3]：又称贴壁筛选法，该方法直接从骨髓中取出既保持了体外骨髓间充质干细胞的活性，又避免了多次离心造成细胞活力的降低，使其细胞活力和增殖能力更强，贴壁可以去除骨髓单个核细胞中不贴壁生长的造血干细胞和红细胞等，得到比较纯化的骨髓间充质干细胞。②密度梯度离心法^[4]：根据骨髓单个核细胞的密度较骨髓中其他细胞的密度低的特性，应用密度梯度离心法分离，去除大部分红细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等，得到较纯的骨髓单个核细胞。常用分离液为Percoll分离液(密度为1.073 g/mL)或淋巴细胞分离液(密度为1.077 g/mL)。③红细胞溶解法^[5]：加入饱和NH₄C1溶液或4%乙酸溶液，使红细胞溶解破坏，达到去除红细胞的目的，得到比较纯化的骨髓单个核细胞。④流式细胞仪或免疫磁珠分选法^[6]：该方法利用细胞大小不同或细胞表面特殊标志抗原不同，采用流式细胞仪或免疫磁珠分选。

为了尽量避免对细胞活性的影响，本实验根据现有的实验条件，利用骨髓单个核细胞密度比较低和骨髓间充质干细胞容易贴壁生长的特点，采用了全骨髓贴壁分离法的方法，首先用血管钳将小块骨组织咬成更细小的组织反复冲洗混匀。经200目细胞筛过滤，制成单细胞悬液，再通过贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞，选用低糖DMEM培养液(含体积分数15%PBS)，培养后多次半量换液，便可获得较多贴壁生长的骨髓间充质干细胞，随着传代次数的增加，细胞得以纯化。

实验在应用密度梯度离心法培养骨髓间充质干细胞时，发现原代细胞贴壁数量较少，且细胞生长较慢，可能是因为密度梯度离心法所采用的多次离心操作，分离骨髓间充质干细胞时实验时间较长，以及Percoll分离液影响了细胞的活性和增殖能力，因此，实验采用全骨髓贴壁分离法而没有用密度梯度离心法来培养大量纯化的骨髓间充质干细胞。

杨丽等^[10]认为与密度梯度离心法相比，全骨髓贴壁法操作步骤简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，节省经费，且分离的骨髓间充质干细胞贴壁时间短，增殖快，细胞数量多，经传代后能够纯化，提示全骨髓贴壁法是一种更加简单有效的骨髓间充质干细胞分离方法。Polisetti等^[11]通过实验研究证实应用简单的黏附方法，可建立一种有效地富集相当纯度的骨髓间充质干细胞，其表型特征及多分化潜能具有干细胞的特征。

到目前为止，对于骨髓间充质干细胞的表面标志尚不确定。利用流式细胞仪的研究显示，骨髓间充质干细胞的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①黏附分子，如CD166、CD54、CDl02、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如白细胞介素1 受体、白细胞介素3受体、白细胞介素4受体、白细胞介素6受体、白细胞介素7受体、α-干扰索受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其他，如CD90、CDl05等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分了B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞抗原DR抗原等。目前，比较公认的骨髓间充质干细胞鉴定方法，检测细胞表面SH-2、SH-3、SH-4抗体，做成脂，成骨，成软骨等分化功能检测^[12-13]。本实验采用流式细胞仪检测培养出的细胞表面抗原CD34阳性率为17.5%，CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%，可以间接证明是骨髓间充质干细胞，而不是造血干细胞或其他细胞，为后续的细胞移植奠定基础。

为了鉴别细胞必须进行细胞标记，可选用多种方法：①Y染色体荧光原位杂交技术^[14]，以雄性动物作为干细胞的来源，移植入雌性动物体内，随后检测雌性受体动物靶区域是否含有Y染色体，如果有，则证明该细胞为移植进来的外源性供体细胞。②基因转染细胞标记技术，最常用的是p一半乳糖营酶，用该酶的基因转染待移植的干细胞，通过检测受体组织中p一半乳糖营酶的活性来定位移植的组织。③细胞核标记示踪技术，以Brdu或荧光染料如CM-DiI标记干细胞的细胞核，移植入体内后，通过免疫组织化学或荧光显色来识别干细胞。

DiI(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)是一种亲脂性荧光染料，不溶于水，易嵌入生物质膜的脂质双分子层内作侧向扩散运动而标记整个细胞膜。另外它还可以通过活细胞的胞饮作用进入胞质，标记整个细胞质^[15]。DiI标记技术简单，染色快，标记效率很高，不容易在标记与非标记细胞之间传递。以往研究显示，DiI标记对细胞的活性、发育或其他基本的生理特性无明显影响。DiI已用于神经干细胞、内皮细胞、成纤维细胞等标记。CM-DiI为DiI的衍生物，在DiI中加入了具有中度巯基反应特性的氯甲基取代物，后者能与细胞内含巯基的肽和蛋白结合，使得CM-DiI能够抵抗醛类的固定作用，因此较DiI更适于固定后标本的长期示踪^[16]，目前已广泛应用骨髓间充质干细胞体外体内的示踪^[17-37]。

实验用CM-DiI标记骨髓间充质干细胞，细胞生长状况良好。荧光倒置显微镜下整个细胞均呈现红色，能观察到完整的细胞形态，而且随着传代次数的增加，荧光强度未见减少，说明CM-DiI标记光稳定性好。将CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞经心肌移植到大鼠心肌梗死模型中，4周后作冰冻切片，在倒置荧光显微镜下观察心肌组织冰冻切片，可见发出红色荧光的标记细胞，呈条带状分布。说明用CM-DiI标记骨髓间充质干细胞稳定、可靠、标记率高、标记简便。

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