骨髓间充质干细胞对肾病综合征大鼠CD4+CD25+调节性T细胞的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：CD4⁺CD25⁺调节性T细胞功能降低、数量下降已被公认为是肾病综合征患儿免疫失调的重要表现。骨髓间充质干细胞具有免疫调节功能，可上调CD4⁺CD25⁺调节性T细胞，抑制淋巴细胞增殖，并已在许多免疫性疾病方面成功应用。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植对原发性肾病综合征大鼠外周血CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的影响。
方法：自SD大鼠分离骨髓间充质干细胞，经体外传代培养及鉴定后制备细胞悬液。30只SD大鼠随机均分为3组，生理盐水组和干细胞移植组尾静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型，干细胞移植组注射阿霉素当日尾静脉射干细胞1×10⁷；正常组不做处理。
结果与结论：①与正常组比较，生理盐水组大鼠均出现肾病综合征表现，以腹水、大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症为特征；干细胞移植组较生理盐水移植组则有明显改善(P < 0.05)。②造模第28天，干细胞移植组和生理盐水组大鼠造模后外周血CD4⁺CD25⁺Treg/ CD4⁺ Treg均明显高于正常组(P < 0.05)；干细胞移植组与生理盐水组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。③造模第28天，干细胞移植组大鼠外周血单个核细胞FoxP3mRNA的表达显著高于生理盐水组和正常组(P < 0.05)。提示骨髓间充质干细胞移植对阿霉素肾病综合征模型有一定的治疗作用，其机制可能与上调FoxP3在组织局部的表达而诱导CD4⁺CD25⁺Treg产生有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 肾病综合征, 阿霉素, FoxP3, CD4⁺CD25⁺Treg, T细胞

Abstract:

BACKGROUND: Decreased function and reduced number of CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells have been considered the major manifestation of immunity dysfunction in children with primary nephrotic syndrome. Bone marrow mesenchymal stem cells have immunoregulation effects, which up-regulate CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells, inhibit proliferation of lymphocytes, and have been widely used in many immune diseases.
OBJECTIVE: To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on the CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells of peripheral blood in rats with primary nephrotic syndrome.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from six Sprague-Dawley rats were isolated, passaged and utilized for cell suspension preparation. At the third passage, bone marrow mesenchymal stem cells were used for transplantation. The remaining 30 rats were randomly and equally divided into three groups: normal group, normal saline infusion group, and bone marrow mesenchymal stem cells group. The rat models of primary nephrotic syndrome were established by single injection of adriamycin intravenously through tail vein in the latter two groups. Rats were then treated with bone marrow mesenchymal stem cells (1×10⁷) (bone marrow mesenchymal stem cells group) or normal saline (normal saline infusion group) through tail vein at the same time after adriamycin administration. The normal group received no treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group, rats in the normal saline infusion group developed nephropathy characterized by ascites, proteinuria, hypoalbuminemia, hypercholastero-lnemia, and progressive renal injury. However, the proteinurine and clinical severity in bone marrow mesenchymal stem cells group were significantly ameliorated after treatment with bone marrow mesenchymal stem cells. CD4⁺CD25⁺Treg/ CD4⁺ Treg in the peripheral blood in the bone marrow mesenchymal stem cells group and normal saline infusion group were significantly higher than that in the normal group at 28 days after model establishment (P < 0.05), while there was no significant difference between bone marrow mesenchymal stem cells group and normal saline infusion group (P > 0.05). The expression of FoxP3 mRNA in the peripheral blood mononuclear cells of the bone marrow mesenchymal stem cells group was significantly higher than that in the normal saline infusion group and normal group (P < 0.05). The bone marrow mesenchymal stem cells play a protective effect in rats with primary nephrotic syndrome, which may be related to the increase of local expression of FoxP3 and generation of CD4⁺ CD25⁺Treg.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, nephrotic syndrome, Doxorubicin, T-lymphocytes

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养及纯化结果 原代培养的细胞在72 h首次换液去除未贴壁细胞，此时大部分细胞呈圆形，少数细胞形态呈梭形。经7-10 d传代时细胞呈现密集分布，呈漩涡状，并出现融合及重叠现象。经传代后，3代以上骨髓间充质干细胞形态上趋于一致，呈成纤维细胞样或辐射状排列(图1)。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的生长规律 骨髓间充质干细胞7代以前增殖速度较快，传代细胞一般7 d左右能达到80%以上融合。细胞传代后一两天为滞留期，3 d后达对数生长期，第6天进入平台期。

2.3 流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达 流式细胞仪结果显示细胞均一性较好，大鼠骨髓间充质干细胞的表面标记CD90表达呈阳性，而造血干细胞的表面标记CD45表达呈阴性，结合细胞的形态特性，说明传代贴壁生长的细胞为骨髓间充质干细胞(图2)。

2.4 各组大鼠24 h尿蛋白及血白蛋白、血胆固醇检测结果应用阿霉素造模后第28天，生理盐水组较正常组24 h尿蛋白明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，而干细胞移植组较生理盐水组24 h尿蛋白有所减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。血胆固醇也出现类似的规律。血白蛋白于造模第28天，生理盐水组与正常组比较明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，干细胞移植组与生理盐水组比较有明显回升，差异有显著性意义(P < 0.05) (表1，图3)。

2.5 各组别大鼠外周血CD4⁺CD25⁺ Treg/CD4⁺ Treg检测结果 流式细胞仪检测结果显示：造模后第28天，干细胞移植组和生理盐水组大鼠外周血CD4⁺CD25⁺Treg/CD4⁺ Treg均明显高于正常组(P < 0.05)，而干细胞移植组与生理盐水组比较差异无显著性意义(P > 0.05)(表2，图4)。

2.6 荧光定量PCR(R-T PCR)检测外周血单个核细胞FoxP3 mRNA的表达 结果显示，干细胞移植组大鼠外周血单个核细胞FoxP3的表达量显著高于生理盐水组和正常组，差异有显著性意义(P < 0.05)。而正常组和生理盐水组比较差异无显著性意义(P > 0.05)(表2，图5)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：2012年12月至2013年6月在徐州医学院附属医院中心实验室及徐州医学院神经生物学实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级五六周龄SD雄性大鼠36只，其中6只用于骨髓间充质干细胞的制备，剩余30只随机分为正常组、生理盐水组、干细胞移植组，每组10只。均由徐州医学院实验动物中心提供，各组大鼠体质量差异无显著性意义，饲养环境通风良好，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及扩增^[3-4]：无菌条件下取出大鼠的股骨和胫骨，剪去干骺端，暴露骨髓腔，以DMEM-F12培养基反复冲洗骨髓腔，直至腔内所有骨髓冲净，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬细胞，置于 37 ℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿培养箱内培养。72 h后首次换液，弃去未贴壁的细胞，加入培养基继续置上述培养箱中培养，以后每3 d换液1次，倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况，待90%融合时，加入胰酶及EDTA溶液消化细胞，按1∶3传代。

大鼠骨髓间充质干细胞鉴定：参考文献[5]方法采用流式细胞仪检测第3代细胞表面标记物。2.5 g/L胰酶消化细胞，PBS洗涤3次，细胞计数，取约1×10⁶个细胞2管分别加入FITC荧光标记的单克隆抗体CD45、CD90，室温避光孵育30 min，进行流式细胞仪鉴定。

阿霉素肾病模型制备与动物分组：剩余30只随机分为3组：正常对照组(正常组)、生理盐水注射组(生理盐水组)和骨髓间充质干细胞移植组(干细胞移植组)。参照Bertani 等^[6]在1982年创建的经典微小病变型动物模型。生理盐水组和干细胞移植组经尾静脉一次性注射速溶型阿霉素(按 5 mg/kg剂量，用生理盐水溶解)制备动物模型。造模即日，生理盐水组通过尾静脉给予注射1 mL生理盐水，而干细胞移植组则在造模即日经尾静脉注射1 mL骨髓间充质干细胞悬液(约含1×10⁷个细胞)。正常组不予以造模。各组大鼠分笼饲养，实验第28天取血及24 h尿蛋白进行相关检测。

各组大鼠24 h尿蛋白的检测：实验第28天处死大鼠前用代谢笼收集大鼠24 h尿液，磺基水杨酸-硫酸钠比浊法测24 h尿蛋白定量。

各组大鼠血生化指标的检测：实验第28天各组大鼠经尾静脉采血2 mL，离心保留血清，全自动生化分析仪测各组大鼠血白蛋白、胆固醇的变化。

流式细胞仪检测外周血CD4⁺CD25⁺Treg百分比：实验第28天各组大鼠经尾静脉采集外周血并分离出单个核细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，每管吸取100 μL加入FITC anti-mouse CD4⁺、PE anti-mouse CD25，混匀，避光孵育20 min，1 000 r/min离心5 mn，弃去上清，加入0.5 mL PBS重悬，用流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺Treg的比例。

外周血单个核细胞FoxP3 mRNA的表达：造模第28天处死大鼠，留取肾脏标本，分离单个核细胞，用Trizol提取总RNA，按相关PCR试剂盒说明测定FoxP3 mRNA表达。

主要观察指标：①大鼠骨髓间充质干细胞的培养及纯化结果。②各组大鼠24 h尿蛋白及血白蛋白、血胆固醇检测结果。③各组别大鼠外周血CD4⁺CD25⁺ Treg/CD4⁺ Treg检测结果。④荧光定量PCR(R-T PCR)检测外周血单个核细胞FoxP3 mRNA的表达。

统计学分析：实验数据应用SPSS 13.0软件进行分析处理，两组间比较应用独立样本，计量资料用x(_)±s表示，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

肾病综合征是一组由多种原因引起的肾小球基底膜通透性增加，导致血浆内大量蛋白质从尿中丢失的临床综合征，是儿童常见的肾脏疾病，由于本病易反复，且部分病儿病程迁延，严重影响小儿的健康。

微小病变型是儿童肾病综合征最常见的病理类型。阿霉素肾病大鼠模型是目前研究的较为成熟的一种微小病变型动物模型^[7-22]。

目前认为微小病变型肾病模型是由于肾小球毛细血管壁滤过膜电荷发生障碍而致病，静电屏障作用受损的原因可能与T细胞数量及功能异常有关，然而其确切机制有待进一步深入研究。

人的细胞免疫功能主要与T淋巴细胞有关，调节性T细胞(Treg细胞)是金几年来确定的体内存在的一类T细胞亚群，根据细胞来源的不同可将其分为天然型和诱生型两种^[23]。其中诱生型Treg细胞是外周血CD4⁺CD25⁺在受到特异性抗原刺激并在细胞因子的诱导性转化为具有Treg细胞功能特征的细胞亚群。具有免疫无能和免疫抑制两大功能^[24]。

CD4⁺CD25⁺调节性T细胞是近年来认识的一种调节性T细胞，由Sakaguchi等^[25]于1995年首次报道。目前认为在维持自身免疫耐受中发挥重要作用。其中免疫抑制和免疫无能是CD4⁺ CD25⁺ Treg的两大特异功能。

研究发现：CD4⁺CD25⁺Treg数量减少或功能失调可导致自身免疫病的发生^[26]。叉头/翼状螺旋转录因子FoxP3是forkhead/winged-helix转录因子家族中的一个新成员，能调控CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的分化，且FoxP3mRNA只特异性的表达于CD4⁺CD25⁺Treg细胞，是鉴别CD4⁺CD25⁺ Treg的特异性分子标志物，也是其发育成熟和实现生物学功能的关键转录因子^[27]。

关于CD4⁺CD25⁺Treg细胞与原发性肾病综合征之间的关系近年来已有报道，但报道结果不一。黄业华等^[28]研究认为CD4⁺CD25⁺Treg细胞与D二聚体负向关，使肾病综合征患者向避免出现凝血功能紊乱的方向发展，从减轻病情的进展。杨军等^[29]研究认为泼尼松等肾上腺糖皮质激素类药物可通过上调激素敏感型肾病综合征患儿CD4⁺CD25⁺Treg细胞的表达发挥免疫治疗作用。Benz等^[30]应用免疫组织化学技术检测肾病综合征肾脏病理组织切片中CD4⁺CD25⁺Treg细胞的数量，结果发现肾病综合征组中CD4⁺CD25⁺Treg的数量较对照组明显降低。但在既往的研究中对骨髓间充质干细胞与CD4⁺CD25⁺Treg细胞及原发性肾病综合征之间的关系则报道很少。

作者在前期试验中报道了移植骨髓间充质干细胞对阿霉素肾脏综合征大鼠有一定的治疗作用^[31-32]，但相关机制未予深一步的探讨。而Aggarwal等^[33]认为CD4⁺CD25⁺ Treg可能参与了骨髓间充质干细胞的免疫调节作用。因此本实验着重观察骨髓间充质干细胞对肾病综合征大鼠CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的影响和作用。

骨髓间充质干细胞是一种成体干细胞，具备干细胞的特征，并具有免疫调节功能。在既往的实验中，作者亦发现骨髓间充质干细胞具有许多明显的优势:容易提取、纯化，产量高、纯度高等，是细胞移植理想的种子细胞。目前从骨髓中分离骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓贴壁筛选法、密度梯度离心法等。

实验采用全骨髓法分离培养细胞，利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性，经过多次换液去除未贴壁细胞，传代时严格控制胰酶的量和消化时间，通过反复传代细胞形态趋于一致，从而使干细胞得到增殖和纯化。

实验中发现，骨髓间充质干细胞接种初期可见大量悬浮细胞，24 h后观察大部分细胞开始贴壁生长，贴壁生长的细胞呈单个分散存在或形成数个细胞克隆，开始伸角变形，呈圆形、多角形、长梭形等多种形态。传至3代，细胞纯化，形态较为单一，呈长梭形贴壁生长，以平行排列生长为主或呈漩涡状生长。流式细胞仪结果显示培养的细胞稳定表达CD90，而CD45阴性，说明实验培养的细胞既非造血干细胞，也非成纤维细胞，而符合间充质干细胞的特性。

另外，实验利用阿霉素制造经典微小病变型肾病综合征模型^[34-35]，该模型造模后6-14 d出现蛋白尿，28 d左右蛋白尿发展到高峰，常持续6-9个月，并伴有低蛋白血症、高脂血症及明显水肿。造模成功后，干细胞移植组通过尾静脉分别注射骨髓间充质干细胞，生理盐水组则通过尾静脉注射等量的生理盐水，并于正常大鼠作为对照。

实验结果发现干细胞移植组和生理盐注射组大鼠外周血淋巴细胞尤其是CD4⁺CD25⁺ Treg的数量与正常组比较有明显变化，差异有显著性意义，提示肾病综合征大鼠存在明显的细胞免疫功能紊乱。但干细胞移植组与生理盐水组比较差异却无显著性意义。

进一步的研究发现，在造模后28天，干细胞移植组大鼠外周血FoxP3mRNA的表达量明显高于生理盐水组和正常组，差异有显著性意义，而生理盐水组与正常组相比却无明显差异，提示骨髓间充质干细胞移植后对大鼠肾脏组织的修复，其机制可能为骨髓间充质干细胞上调FoxP3的表达而诱导CD4⁺CD25⁺ Treg的产生有关。

Mansour等^[36]研究亦发现，肾脏移植后，肾脏FoxP3mRNA表达水平与患者的肾功能呈现明显正相关，因此肾组织内FoxP3表达上调有益于肾功能的保护。

实验表明：阿霉素肾病综合征大鼠早期移植骨髓间充质干细胞可上调外周血CD4⁺CD25⁺ Treg的比例，表明CD4⁺CD25⁺ Treg可能是骨髓间充质干细胞对原发性肾病综合征大鼠起治疗作用的关键机制。但如何有效增强及维持Treg数量及抑制能力，肾病综合征患者免疫状态与CD4⁺CD25⁺ Treg的数量及功能关系，如何指导临床调节免疫抑制剂，以及体外扩增CD4⁺CD25⁺ Treg后如何应用于临床等仍需要进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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