羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (41): 7213-7220.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.005

• 皮肤粘膜组织构建 skin and mucosal tissue construction • 上一篇下一篇

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

徐彪¹，李芳¹，孙青¹，许云云²，赵娟¹，梁含思¹，马树立¹，陈永珍¹

¹苏州大学，江苏省苏州市 215006；²苏州市儿童医院，江苏省苏州市 215001

收稿日期:2013-02-28 修回日期:2013-07-21 出版日期:2013-10-08 发布日期:2013-11-01
通讯作者: 陈永珍，教授，苏州大学，江苏省苏州市 215006
作者简介:徐彪★，男，1988年生，山东省新泰市人，汉族，2013年苏州大学毕业，硕士，主要从事胎盘来源干细胞研究。 feibiao162@163.com
基金资助:
苏州大学省级重点实验室开放课题(JS1232)*；苏州市应用基础研究计划(SYS201311)*

Tissue-engineered skin construction with amniotic epithelial cells and amniotic mesenchymal stem cells

Xu Biao¹, Li Fang¹, Sun Qing¹, Xu Yun-yun², Zhao Juan¹, Liang Han-si¹, Ma Shu-li¹, Chen Yong-zhen¹

¹Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; ²Children’s Hospital of Suzhou, Suzhou 215001, Jiangsu Province, China

Received:2013-02-28 Revised:2013-07-21 Online:2013-10-08 Published:2013-11-01
Contact: Chen Yong-zhen, Professor, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Xu Biao★, Master, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China feibiao162@163.com
Supported by:
Open Topics of Provincial Key Laboratory of Soochow University, No. JS1232*; the Applied Basic Research of Suzhou City, No. SYS201311*

摘要/Abstract

摘要：

背景：由于人胎盘来源的间充质干细胞具有多方面的优点，近年来已成为干细胞研究的热点。
目的：分析鉴定羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的生物学特性，探讨其作为皮肤种子细胞在三维气液培养构建组织工程皮肤中的应用情况。
方法：用胰酶胶原酶多步消化法获取羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞，通过流式细胞术、反转录-聚合酶链反应和免疫荧光染色技术，鉴定两种细胞的表面分子标记、干细胞特性、与皮肤角质形成细胞的相似性，并利用两种细胞为种子细胞以鼠Ⅰ型胶原为基质进行三维气液培养。
结果与结论：①流式细胞术检测体外培养羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞均高表达CD90、CD73、CD105，不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。②反转录-聚合酶链反应检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和NANOG，羊膜上皮细胞表达干细胞特性基因CMCY和 KLF4，两种细胞均有干细胞特性。③反转录-聚合酶链反应检测羊膜间充质干细胞表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8，羊膜上皮细胞表达K19、β1-integrin、K5、K8，免疫荧光染色见羊膜上皮细胞表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白K14，说明羊膜上皮细胞与皮肤角质形成细胞更具相似性, 在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。④利用两种细胞成功构建组织工程皮肤，苏木精-伊红染色切片显示其具有一定的皮肤结构，且羊膜上皮细胞发生了初步分化。以上结果说明羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞通过三维培养构建人皮肤组织是可行的。

关键词: 组织构建, 皮肤组织构建, 皮肤黏膜组织构建, 羊膜间充质干细胞, 羊膜上皮细胞, 组织工程皮肤, 流式细胞术, 反转录聚合酶链式反应, 免疫荧光染色, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Placenta mesenchymal stem cells have become hot spots in stem cells study in recent years because of its advantages.
OBJECTIVE: To analyze the biological characteristics of amniotic mesenchymal stem cells and amnion epithelial cells, and to explore the feasibility of amniotic mesenchymal stem cells and amnion epithelial cells applied as seed cells in three-dimensional liquid culture to construct the tissue-engineered skin.
METHODS: The amniotic mesenchymal stem cells and amnion epithelial cells were obtained by using multi-step digestion with trypsin and collagenase; then the flow cytometry, reverse transcription-PCR and immunofluorescent staining techniques were adopted to identify the surface molecular markers, stem cell characteristics and keratinocytes similarity respectively. Based on these data, amniotic mesenchymal stem cells and amnion epithelial cells used as seed cells together with rat type Ⅰ collagen matrix were adopted for three-dimensional liquid culture.
RESULTS AND CONCLUSION: Flow cytometry test showed that amniotic mesenchymal stem cells and amnion epithelial cells cultured in vitro could highly express CD90, CD73 and CD105, and could not express the hemopoietic stem cell marker of CD34 and MHC-class Ⅱ molecular HLA-DR. Reverse transcription-PCR results detected that amniotic mesenchymal stem cells could express stem cell characteristic genes CMCY and NANOG; amnion epithelial cells could express stem cell characteristic genes CMCY and KLF4, showing that both amniotic mesenchymal stem cells and amnion epithelial cells have stem cell properties. Reverse transcription-PCR results showed that amniotic mesenchymal stem cells could express keratinocytes characteristic genes K19, β1-integrin and K8; amnion epithelial cells could express K19, β1-integrin, K5 and K8. Immunofluorescence staining results showed amnion epithelial cells could express keratinocytes proliferation related protein K14, which revealed that there was certain similarity in the mRNA expression between keratinocytes and amnion epithelial cells, and indicating that it has the potential to differentiate into keratinocytes. Tissue-engineered skin was successfully constructed by using amniotic mesenchymal stem cells and amnion epithelial cells, hematoxylin-eosin staining section showed that it has certain skin structure, and amnion epithelial cells had a preliminary differentiation. All these prove that it is feasible to construct human skin tissues with amniotic mesenchymal stem cells and amniotic epithelial cells through the three-dimensional culture.

Key words: skin, artificial, amnion, epithelial cells, mesenchymal stem cells

中图分类号:

R318

徐彪，李芳，孙青，许云云，赵娟，梁含思，马树立，陈永珍. 羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(41): 7213-7220.

Xu Biao, Li Fang, Sun Qing, Xu Yun-yun, Zhao Juan, Liang Han-si, Ma Shu-li, Chen Yong-zhen . Tissue-engineered skin construction with amniotic epithelial cells and amniotic mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(41): 7213-7220.

图/表（结果） 5

2.1 羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞的分离培养 在10 μg/L表皮生长因子、5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM中培养1周后，通过全量换液不断去除死细胞，羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞均有从组织块爬出。羊膜上皮细胞为大核铺路石状细胞，形成成片的巨大克隆，羊膜间充质干细胞为成纤维细胞样细胞，长梭形，见图1，2。10 d左右分别进行传代培养，传代后羊膜上皮细胞变大，贴壁性增强，羊膜间充质干细胞生长速度加快，漩涡状排列生长，见图3，4。

2.2 流式细胞术检测羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞的免疫表型 按常规培养条件体外培养的羊膜间充质干细胞高表达CD90、CD73、CD105，不表达造血干细胞标志CD34、HLA-DR，见图5，与国际会议提出的表面标记相同。羊膜上皮细胞与之类似高表达CD90、CD73、CD105，不表达造血干细胞标志CD34、HLA-DR，见图6，与相关文献报道一致，说明羊膜上皮细胞具有一定的间充质干细胞特性。
2.3 羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞表达胚胎干细胞及角质形成细胞特异性基因 通过RT-PCR技术检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和 NANOG，羊膜上皮细胞表达干细胞特性基因CMCY和 KLF4，说明2种细胞都具有一定的干细胞特性。羊膜间充质干细胞明显表达K19、β1-integrin、K8，而羊膜上皮细胞明显表达K19、β1-integrin、K5、K8，这些都是皮肤角质形成细胞的特性基因，这说明2种细胞在基因表达上跟皮肤角质形成细胞有很强的相似性，见图7，8。

2.5 气液培养构建组织工程皮肤 成功利用羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞通过气液培养构建了组织工程皮肤，具有一定的皮肤结构，构建的皮肤分为2层，上层为表皮层，含有两三层的羊膜上皮细胞，生长状态良好，复层化明显，并有角质层形成；下层为真皮层，含有羊膜间充质细胞，有一定的厚度且细胞有序排列，见图10。

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引言

近几年研究发现干细胞在皮肤创面愈合中发挥着巨大的作用，因此构建含有干细胞的皮肤替代物是组织工程皮肤发展的新方向。干细胞的自我复制和多向分化潜能使其在细胞再生、组织工程实验研究及临床应用中体现了重要价值。干细胞按照生存阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞又包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等。胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发的肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等，都给胚胎干细胞实际临床应用带来了局限性，而成体干细胞中的间充质干细胞凭借其低免疫原性和一定的分化潜能^[1-5]，在临床应用方面体现出重要的优势，近年来已成为干细胞领域的研究热点。

胎盘绒毛、羊膜作为孕妇分娩后的废弃物，其来源广泛、易于获取且无伦理道德争议，是近年的研究热点。胎盘上羊膜部分为半透明膜，其表面没有血管、神经、肌肉和淋巴组织，其中可分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞。其中羊膜间充质干细胞来自于原条期的胚外中胚层^[6-7]，羊膜间充质干细胞具有广泛的分化能力，在一定的条件下可以分化为多种成熟体细胞如成骨细胞、成脂细胞、肝脏细胞、神经细胞以及心血管内皮细胞等^[8]。而且通过对人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖能力比较发现，培养人羊膜间充质干细胞的细胞数量在各时间点均明显高于骨髓间充质干细胞^[8-9]，这说明羊膜间充质干细胞将成为更为可靠的细胞来源。

羊膜上皮细胞在受精后第8天由外胚层发育而来，衬于羊膜内表面，大部分为单层立方和柱状细胞，参与羊水形成和传递，还可合成、分泌和形成基底膜细胞外间质成分。研究显示，羊膜上皮细胞同样具有一定三胚层分化潜能^[10-11]，在体外特定的诱导条件下可分化成肝细胞、心肌样细胞、神经细胞、成骨及软骨细胞^[12-17]，而且免疫原性低，具有抗炎作用，说明在组织修复领域羊膜上皮细胞具有重要的医疗价值。

羊膜细胞还分泌生理水平的与损伤修复有关的细胞因子，如血小板源性生长因子、血管内皮细胞生长因子、血管生成因子、转化生长因子β2、金属蛋白酶组织抑制剂1和金属蛋白酶组织抑制剂2。这些细胞因子能够促进种细胞增殖，减少炎症反应，调节损伤修复的许多关键步骤^[18-19]。通过一定的手段将其应用于修复治疗前景广阔。在体外培养中细胞独立生存于人工模拟的体内环境，但该环境与真实的体内环境相比仍有很大差异，因而细胞实验结果不能完全等同于体内实验结果。为了能够建立更类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外环境与体内环境相吻合，从而使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖^[20]，本实验从人足月胎盘中提取羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞建立体外培养体系，并以两种羊膜细胞为种子细胞，进行三维气液培养，模拟皮肤结构，构建组织工程皮肤，为未来进行大规模生产皮肤替代物提供理论基础。

材料方法

设计：分子水平、细胞水平体外观察。

时间及地点：实验于2011年9月至2012年12月在苏州大学生物技术研究所完成。

材料：

胎盘组织：在产妇知情同意的情况下，经医院伦理委员会批准，获取正常健康孕妇剖宫产之足月胎儿的新鲜胎盘组织。大小及质量在正常范围内，胎盘脐带附着点均在胎盘中央稍偏位。

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤实验所需主要仪器与试剂：

实验方法：

羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的分离培养及体外扩增：

羊膜间充质干细胞的分离培养：选取剖宫产足月胎儿的胎盘，机械剥离胎盘羊膜组织，PBS反复冲洗，将羊膜组织剪成细碎小块，0.25%胰酶37 ℃消化10 min，100目筛网过滤。PBS充分清洗后收集经胰酶消化后的组织块，继续经0.1%Ⅳ型胶原酶37℃消化15 min。含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM终止反应后反复吹打，过100目筛网获得细胞液，1 000 r/min离心 10 min，弃上清液。收集羊膜来源的细胞按以下培养条件进行体外培养：添加有5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10 μg/L表皮生长因子的L-DMEM完全培养基，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂孵育箱内培养。每3 d全量换液1次，12-14 d后细胞按常规方法传代。

羊膜上皮细胞的分离培养：目前分离羊膜上皮细胞尚未建立标准化流程，主要方法为胰蛋白酶消化法，作者采用加有EDTA的低浓度胰蛋白酶进行多步消化分离提取，选取剖宫产足月胎儿胎盘，机械剥离胎盘羊膜组织，PBS反复加以冲洗，将羊膜组织剪成细碎小块，加入含有0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶溶液，37 ℃消化10 min，弃消化液。37 ℃、200 r/min旋转消化30 min，200目不锈钢网过滤。收集单细胞悬液，加含体积分数为10%胎牛血清的培养基终止消化。组织碎片用同样方法重复消化2次。合并3次收集的细胞悬液经200目不锈钢网过滤，滤液以1 500 r/min离心10 min，弃上清，再悬浮细胞。800 r/min离心6 min，弃上清，收获细胞即为人羊膜上皮细胞。用添加5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的L-DMEM完全培养基培养，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂孵育箱内培养。每3 d全量换液1次，六七天后细胞按常规方法传代。

流式细胞仪检测羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的细胞表型：取含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基培养2代后的细胞，0.25%胰酶/0.01%EDTA消化后，用含体积分数为1%胎牛血清的PBS调整为每50 μL含细胞5×10⁵个。然后分别加鼠抗人单克隆抗体CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-FITC、HLA-DR-PE。置于4 ℃冰箱中反应20 min后用PBS冲洗2次，流式细胞仪检测细胞表型。

RT-PCR检测胚胎干细胞与皮肤角质形成细胞特异性基因在羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞中的表达：

羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞RNA的提取：①将生长良好的羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞消化离心，分别加入1 mL TRIZOL试剂，混匀放于冰上 5 min。②TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 mL的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15 s后，15-30 ℃孵育两三分钟(冰上10 min)。4 ℃下12 000 r/min离心 15 min，离心后混合液体分为下层红色酚氯仿相，中间层及上层无色水相。RNA全部被分配于水相中，水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③将水相上层转移到1支干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA。混匀后15-30 ℃孵育(冰上)10 min后，于4 ℃下12 000 r/min离心10 min，此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④移去上清液，每1 mL TRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 mL的体积分数为75%乙醇(体积分数为75%乙醇用DEPCH₂O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后4 ℃下12 000 r/min离心5 min。⑤小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10 min。⑥溶解RNA沉淀。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水25 μL用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-20 ℃待用(测定mRNA浓度，调整总量为1 μg)。

总RNA反转录为cDNA：RNA模板总量1 μg，随机引物1 μL，dNTP 1 μL，总体积10 μL，65 ℃保温5 min，冰上冷却2 min，往10 μL体系中加入RNA抑制剂 0.5 μL，反转录酶0.5 μL，5×Buffer 4 μL，0.1%DEPC水5 μL，总体系20 μL，PCR仪设置为30 ℃ 10 min， 42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。

PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳：①PCR体系：10×PCR buffer 2.5 μL，cDNA 5 μL，Taq酶0.3 μL，前引物P1 0.75 μL，后引物P2 0.75 μL，dNTP 0.75 μL，ddH₂O 14.95 μL。②第1步1个循环为94 ℃ 5 min；第2步30个循环为94 ℃ 50 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s；第3步1个循环为72 ℃ 10 min。4 ℃冷却5 min后，取出行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统拍照。实验检测2种羊膜来源细胞的干性基因OCT4、NANOG、KLF4、CMYC的表达，以胚胎干细胞为阳性对照；检测角质形成细胞的特性基因K19、β-integrin、K5、K8的表达，以人皮肤角质形成细胞为阳性对照。引物序列见表1。

免疫荧光染色检测羊膜上皮细胞K14的表达：将第1代的羊膜上皮细胞种于24孔板，待其长满，吸走培养基后用PBS清洗2次，常温下加40 g/L的多聚甲醛(pH为7.4)固定15 min。吸走多聚甲醛，并用PBS清洗2次。加入3%的牛血清白蛋白溶液封闭20 min，PBS清洗2次，每孔加入300 μL鼠抗人K14一抗(用0.1%的牛血清白蛋白溶液稀释，1∶50稀释)，4 ℃过夜。第2天用PBS洗去一抗，加入用0.1%的牛血清白蛋白溶液稀释(1∶50)的二抗，避光反应1 h，PBS清洗3次后加入4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)反应15 min，荧光显微镜下观察。

以羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞为种子细胞构建组织工程皮肤：组织工程皮肤将分3层进行构建：第1层由鼠Ⅰ型胶原、10×MEM、胎牛血清、谷氨酰胺组成的非细胞胶铺于底部。本层在培养过程中始终浸没于培养基内，对上层中的羊膜间充质干细胞起到一个保护和缓冲的作用。第2层由鼠Ⅰ型胶原、10×MEM、胎牛血清、谷氨酰胺和人羊膜间充质干细胞组成的细胞胶。本层在培养的最后7 d里上表面露出于培养基外，其结构与功能类似于人体皮肤的真皮层，对生长其上的羊膜上皮细胞起到承载、营养的作用。第3层为直接种在第3层上的羊膜上皮细胞，在整个11 d的培养过程中逐渐将第2层覆盖起来。形成致密的多层结构，相当于皮肤表皮部分。

工程皮肤的构建过程如下(12孔板体系)：①首先配制无细胞胶，在333.3 μL Ⅰ型胶原内加入10×MEM 33.33 μL，混匀，用NaOH将pH调至7.2-7.6，然后加入谷氨酰胺3 μL，胎牛血清40 μL。将配制好的胶均匀铺满12孔细胞培养板内的底部。放于37℃培养箱，等待20 min使其凝固。②然后配制细胞胶，将准备使用的羊膜间充质干细胞消化，制成细胞悬液，计数出每孔3.33×10⁴个。吸取1 mLⅠ型胶原加入10×MEM 100 μL混匀，同样用NaOH将pH调至7.2-7.6，然后加入谷氨酰胺9 μL，胎牛血清113.3 μL，并加入羊膜间充质干细胞混匀。将配好的细胞胶轻轻加入到已凝固的非细胞胶之上，放于37 ℃培养箱内，待其凝固加入含有5 μg/L表皮生长因子的L-DMED完全培养基3 mL，将胶原浸没培养7 d，期间隔天换液。③7 d之后行羊膜上皮细胞的接种：接种羊膜上皮细胞之前将Transwell内的培养基吸掉，静止于37 ℃培养箱内15 min，使第2层细胞胶表面的培养基刚好蒸发干，将羊膜上皮细胞消化离心，计数并离心，将5×10⁵个(约50 μL)羊膜上皮细胞悬液放入胶原正中央，30 min静置。让羊膜上皮细胞尽量贴壁，然后每孔加入3 mL Epilife培养基，浸没培养。培养至第3天加入CaCl₂，浓度为1.8 mmol/L。在此基础上第5天开始加10 μL胎牛血清，并且将Epilife减至1 mL，使得胶体上表面刚好露出与空气接触，以仿真人体体内皮肤的表皮层和真皮层的生长环境。每天换液，培养1周后将组织工程皮肤取下放入到体积分数为4%的甲醛溶液中固定。④石蜡切片，苏木精-伊红染色观察组织工程皮肤的组织结构：体积分数为4%的甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇溶液脱水(体积分数为70%乙醇15 min、体积分数为80%乙醇15 min、体积分数为90%乙醇1 h、体积分数为95%乙醇2 h，无水乙醇2 h)，二甲苯透明(共2次，每次30 min)，浸蜡(共2次，第1次1 h，第2次2 h)，石蜡包埋后切 5 μm薄片，贴附于涂布多聚赖氨酸的玻片，切片脱蜡至水用于染色：切片入二级二甲苯各15 min，再入体积分数为100%乙醇(二级)→体积分数为95%乙醇→体积分数为75%乙醇→体积分数为50%乙醇→蒸馏水中各3-5 min；切片入苏木精染液染色10-30 min，用自来水流水冲洗约15 min。1%盐酸乙醇分化数秒，自来水洗1 min，0.2%氨水返蓝30 s，自来水洗1 min，伊红染色3-5 min，自来水洗，按之前过程脱水、透明，最后中性树胶封固。

主要观察指标：倒置显微镜下观察组织工程皮肤的形成以及羊膜上皮细胞的分化情况，并与人皮肤组织切片和人皮肤角质形成细胞所构建的组织工程皮肤组织切片进行比较。

讨论

传统的二维细胞培养并不是细胞生长的天然状态，因而细胞的基因表达、信号传导和形态学都可能有天然差异^[21-23]。三维细胞培养技术则能在细胞培养过程中，为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境，在基础科学研究中极大地提高了细胞实验的准确性。作为近年来兴起的一门新兴学科，组织工程学是羊膜细胞用于皮肤组织损伤治疗的一个重要途径。它是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识组织正常及病理2种状态下结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物^[24]。

羊膜为胎盘胎儿面的一层半透明膜，其内没有血管、神经和淋巴组织，含有胶原、糖蛋白、蛋白多糖等多种成分，具有与皮肤表皮(分为角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底层)相类似的5层结构：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，其空隙孔径仅在0.3-3.4 μm之间，可以保护创面不受局部细菌的侵入、减少感染机会。所以近年来羊膜已被应用于临床皮肤创面的修复，具有促进上皮细胞生长，减少创面感染，排斥反应较小等优点。羊膜作为产后废弃物取材容易，其应用不会引起伦理学争议，经检测羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞都具有一定的干细胞性质，可在体外大量扩增培养，为组织工程的理想种子细胞，其在基因表达上与角质形成细胞具有相似性，表明用二者构建组织工程皮肤的可行性。

实验成功提取羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞，建立二者的体外培养体系，免疫表型检测结果符合相关文献报道。通过RT-PCR技术检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和 NANOG，羊膜上皮细胞表达CMCY和 KLF4，羊膜间充质干细胞表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8，羊膜上皮细胞表达K19、β1-integrin、K5、K8，同时免疫荧光染色结果表明羊膜上皮细胞表达角质形成细胞特异性蛋白K14，这些都说明了两者尤其是羊膜上皮细胞是构建组织工程皮肤的优选细胞。根据其特性的差异将二者用于组织工程皮肤构建中，模拟体内生理条件，采用细胞三维培养技术将羊膜间充质细胞接种到鼠Ⅰ型胶原内成使之在三维空间内生长。并以此为营养层在表面培养羊膜上皮细胞，为羊膜上皮细胞提供良好的生长环境。然后进行气液界面培养，既羊膜上皮细胞在空气与培养基的接触面生长，发挥其增殖和角质形成细胞方向分化潜能，从而形成一种具有表皮层和真皮层能应用于临床的人工皮肤。鉴于羊膜细胞的低免疫原性和损伤修复性，利用羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞所成功构建的组织工程皮肤，将是用于临床皮肤缺损修复的良好生物活性材料，并为未来进行大规模生产廉价皮肤替代物提供借鉴。

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

Tissue-engineered skin construction with amniotic epithelial cells and amniotic mesenchymal stem cells

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