机械法与机械-酶消化法制备大鼠膈肌组织单细胞悬液的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1872

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (8): 1213-1217.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1872

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

机械法与机械-酶消化法制备大鼠膈肌组织单细胞悬液的比较

张远圆¹，张杉杉¹，常旭²，赵朋伟¹，余孝先¹，吴学东¹

¹大理大学第一附属医院暨临床医学研究中心小儿外科，云南省大理市 671000；²大理大学基础医学院，云南省大理市 671000

收稿日期:2019-04-24 修回日期:2019-04-30 接受日期:2019-06-22 出版日期:2020-03-18 发布日期:2020-01-22
通讯作者: 吴学东，博士，教授，大理大学第一附属医院暨临床医学研究中心小儿外科，云南省大理市 671000
作者简介:张远圆，女，1990年生，河南省安阳市滑县人，汉族，2017年大理大学小儿外科专业毕业，硕士，医师，主要从事小儿普通外科学研究，现在新乡医学院第一附属医院小儿外科工作。
基金资助:
国家自然科学基金(81260018)

Preparing single cell suspension of rat diaphragm tissues: mechanical grinding versus mechanical-enzymatic digestion

Zhang Yuanyuan¹, Zhang Shanshan¹, Chang Xu², Zhao Pengwei¹, Yu Xiaoxian¹, Wu Xuedong¹

¹Department of Pediatric Surgery, the First Affiliated Hospital & Clinical Medical Research Center of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China; ²School of Basic Medicine, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China

Received:2019-04-24 Revised:2019-04-30 Accepted:2019-06-22 Online:2020-03-18 Published:2020-01-22
Contact: Wu Xuedong, MD, Professor, Department of Pediatric Surgery, the First Affiliated Hospital & Clinical Medical Research Center of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
About author:Zhang Yuanyuan, Master, Physician, Department of Pediatric Surgery, the First Affiliated Hospital & Clinical Medical Research Center of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260018

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
流式细胞分析技术：简称流式细胞术，是20世纪70年代初发展起来的一种在功能水平上可以对单个细胞或其他生物离子进行快速定量的一项新型分析技术和分选技术。它能够在短时间内高速分析上万个细胞，可以同时测量如细胞或粒子的体积、内部结构以及膜电位变化等生物或化学性质，进行多信息分析，具有快速、高灵敏、准确、多参数等特点。
单细胞悬液：是进行细胞体外培养和流式细胞分析的基础，即将组织分散成单个游离细胞，使其悬浮在液体培养基中，当然如外周血及骨髓标本等本身即为天然的单细胞悬液，这些细胞经过简单处理，就可以应用于流式分析、细胞分选、细胞培养等实验。如果2个或多个细胞粘连在一起或细胞碎片过多都将影响流式分析结果，进而导致实验失败。

背景：流式细胞术作为目前先进的细胞分析技术，其研究基础是单细胞悬液，但目前尚无有关膈肌组织单细胞悬液制备方法的相关报道。

目的：探索应用机械法与机械-酶消化法分别制备大鼠膈肌单细胞悬液的可行性并比较2种方法获得单细胞的数量和活性。

方法：以SD大鼠的新鲜膈肌组织为标本，在机械法的基础上，选用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ及其不同组合进行消化制备膈肌单细胞悬液，观察细胞形态并经锥虫蓝染色后测定细胞活性，对活细胞、失活细胞和细胞团块进行计数并计算出细胞存活率和单细胞悬液浓度，结果进行统计学比较分析。

结果与结论：①机械-酶消化法所制得的单细胞悬液较机械研磨法细胞分散度好、形态完整、边界清楚、杂质及细胞碎片较少、背景较干净；②单纯机械研磨法制备的单细胞悬液活细胞数较低，失活细胞数较高，细胞存活率最低，团块较多；③在机械法的基础上，加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶所得单细胞悬液的活细胞数及悬液浓度最高，每0.1 g膈肌组织可获得(1.0-2.0)×10⁶个细胞，细胞存活率较高，与单纯机械法获得单细胞悬液比较，在活细胞、失活细胞、细胞团块、细胞存活率及悬液浓度方面差异均有显著性意义(P < 0.05)；其次是加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ这2种等体积混合酶消化法，所得单细胞悬液浓度、细胞成活率及细胞团块方面也均较为理想；④结果表明，机械法和机械-酶消化法均能成功制备出大鼠膈肌单细胞悬液，机械-酶消化法优于单纯机械法，其中加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶的机械-酶消化法所得单细胞悬液效果最佳，是较优选的膈肌单细胞悬液制作方法。

ORCID: 0000-0002-4486-5917(张远圆)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 单细胞悬液, 膈肌组织, 机械法, 机械-酶消化法, 流式细胞术, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Flow cytometry is currently the advanced cell analysis technique with single cell suspension as a research basis, but there is no report on the preparation method of single cell suspension of diaphragm tissue.

OBJECTIVE: To explore the feasibility of preparing single cell suspension of rat diaphragm tissue by mechanical grinding method and mechanical-enzymatic digestion method and to compare cell number and viability of the cells obtained using different methods.

METHODS: The fresh diaphragm tissues of Sprague-Dawley rats were harvested. Based on the mechanical method, trypsin, collagenase I, collagenase II, collagenase IV and their different combinations were used to digest and prepare the single cell suspension of diaphragm tissues. Cell morphology was observed; cell number and viability were determined by trypan blue staining. The living cells, inactivated cells, and cell aggregates were counted, and cell survival rate and concentration of the single cell suspension were calculated. Statistical analyses were performed thereafter.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The single cell suspension with better cell dispersion, more complete morphology, clearer boundary, fewer impurities and cell debris, and cleaner background were obtained by mechanical-enzymatic digestion compared with mechanical grinding method. (2) The single cell suspension prepared by simple mechanical grinding method has low number of living cells, high number of inactivated cells, low survival rate and many cell aggregates. (3) The number of living cells and concentration of single cell suspension obtained by same-volume addition of trypsin, collagenase I and collagenase IV mixed enzymes based on the mechanical grinding method were the highest, with (1.0-2.0)×10⁶ cells per 0.1 g diaphragm tissue. There were significant differences between mechanical-enzymatic digestion and mechanical grinding method in terms of living cells, inactivated cells, cell aggregates, cell survival rate and suspension concentration (P < 0.05). Moreover, the single cell suspension prepared by the same-volume addition of trypsin and collagenase IV had higher suspension concentration, higher cell survival rate, and less inactivated cells and cell aggregates. To conclude, the single cell suspension of diaphragm tissues could be prepared successful by both mechanical and mechanical-enzyme digestion methods. Mechanical-enzyme digestion is superior to simple mechanical grinding method, with the best single cell suspension after same-volume addition of trypsin, collagenase I and collagenase IV. This is the preferred method for preparation of single cell suspension of the diaphragm tissue.

Key words: single cell suspension, diaphragm tissue, mechanical method, mechanical-enzyme digestion, flow cytometry, rat

中图分类号:

张远圆, 张杉杉, 常旭, 赵朋伟, 余孝先, 吴学东. 机械法与机械-酶消化法制备大鼠膈肌组织单细胞悬液的比较[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1213-1217.

Zhang Yuanyuan, Zhang Shanshan, Chang Xu, Zhao Pengwei, Yu Xiaoxian, Wu Xuedong.

Preparing single cell suspension of rat diaphragm tissues: mechanical grinding versus mechanical-enzymatic digestion [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(8): 1213-1217.

图/表（结果） 4

2.1 细胞形态观察结果光镜下观察，1-15号机械-酶消化法所得大鼠膈肌组织细胞普遍较16号机械研磨法细胞分散度好、形态完整、边界清楚、杂质及细胞碎片较少、背景较干净，而16号机械研磨法镜下可见视野中充满细胞碎片，见图1。

2.2 细胞计数结果不同方法制备所得的大鼠膈肌组织单细胞悬液在显微镜下(每一大方格)观察计数活细胞、失活细胞、团块、存活率和悬液浓度，见表2和图2。

应用不同方法制备所得的大鼠膈肌组织单细胞悬液在活细胞、失活细胞、细胞团块、细胞存活率及细胞悬液浓度计数上存在不同程度的差异。16号用单纯机械研磨法制备的单细胞悬液表现并不理想，活细胞数仅为(58.00± 11.53)个，失活细胞数最高为(38.33±3.79)个，细胞存活率最低为(59.93±3.01)%，与其他各组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，细胞团块较多为(13.33±8.14)个，单细胞浓度较低仅为(11.60±2.31)×10⁵。6号加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶，采用机械-酶消化法所得大鼠膈肌组织单细胞悬液表现较为突出，其活细胞数(177.33±24.44)个及悬液浓度(35.47±4.89)×10⁵均最高，与其他各组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，计算得每0.1 g膈肌组织可获得(1.0-2.0)×10⁶个细胞，细胞存活率较高为(92.67±0.76)%，死细胞数及团块个数均较低；其次是4号加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ这2种等体积混合酶，采用机械-酶消化法所得单细胞悬液浓度为(30.67±1.90)×10⁵，且细胞成活率及细胞团块方面也均较为理想。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞形态学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年6至10月在大理大学基础实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠6只，四五个月龄，体质量250-350 g，雌雄兼用，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SPF级，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。

1.3.2 实验试剂 0.25%胰蛋白酶、0.1%胶原酶Ⅰ型、0.1%胶原酶Ⅱ型、0.1%胶原酶Ⅳ型和体积分数为2%胎牛血清、PBS均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；0.4%锥虫蓝购自Sigma公司。

1.3.3 实验仪器电子天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司，JA2003)；恒温水浴锅(上海圣科仪器设备有限公司，HWS-12)；台式离心机(美国贝克曼库尔特公司，TGL-16G)；普通光学显微镜(厦门Motic公司，Motic-AE21)；200目滤网(生工生物工程股份有限公司)；小手术器械及鼠台(大理大学外科实验室提供)。

1.4 实验方法

1.4.1 膈肌组织标本的取材对实验大鼠进行称质量，按3 mL/kg剂量腹腔内注射10%水合氯醛溶液，麻醉生效后将大鼠仰卧位固定于手术台上，用脱毛膏脱去胸腹部毛，消毒后取上腹部正中纵行切口，长约4 cm，打开腹腔，暴露膈肌，迅速完整取出膈肌组织，放入在冰上预冷的平皿中，用预冷的PBS反复冲洗，去除血渍，清洗干净膈肌组织，移入EP管中。

1.4.2 大鼠膈肌组织单细胞悬液的制备用电子天平准确称取1.6 g膈肌组织，将其平均分成16份，分别放入预冷的EP管中并进行编号。按表1加入配置好的消化酶液及PBS。完成加液后，用眼科剪迅速将膈肌组织剪碎呈糊状(为保持细胞活性，在冰上进行操作)。将1-15号EP管放入37 ℃的恒温水浴锅中震荡消化30 min，期间每隔5 min用吸管将管中的细胞轻柔吹打均匀并观察消化情况，将消化好的细胞悬液经200目滤网至离心管中；将16号膈肌组织放在200目滤网上，缓慢转动研磨棒研磨至匀浆，用PBS冲洗滤网，收集细胞悬液至离心管中。将1-16号各组离心管均放入离心机中，1 000 r/min低速离心5 min，弃上清液，分别加入PBS漂洗2次再次离心弃上清液，等体积加入含体积分数2%胎牛血清的PBS终止消化。每组最终均得到 0.5 mL单细胞悬液。

1.4.3 细胞活性测定及形态观察取10 μL过滤后的单细胞悬液，经锥虫蓝染色后放入计数板对活细胞、失活细胞及细胞团块进行计数并观察细胞形态。

1.5 主要观察指标应用机械-酶消化法和机械研磨法分别制备大鼠膈肌组织单细胞悬液，通过观察不同实验组单细胞悬液细胞形态及经锥虫蓝染色后的细胞活性，对2种方法获得的结果进行比较分析。

1.6 统计学分析实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0 统计软件进行组间t 检验，设定α=0.05为检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

膈肌位于胸腹联合部位，是机体重要的呼吸肌，占所有呼吸机功能的60%-80%，同时还参与机体如咳嗽、呕吐及分娩等功能，不仅参与胸腹部的功能，也可受到胸腹部疾病的影响^[4]。由于膈肌位于胸腹腔之间，在人体不能以直接方式进行相关测定和实验研究，因此目前对膈肌的研究主要通过动物实验进行对比^[5]。尽管在生物医学研究中大鼠是较为常用的实验动物，也常见大鼠膈肌的研究报道^[6-8]，但多为宏观的测定。流式细胞分析是现代最先进的定量分析细胞学技术^[9]，由于目前尚无有关大鼠膈肌组织单细胞悬液制备方面的文献报道，这限制了流式细胞分析在膈肌组织细胞研究中的应用，也难以对膈肌组织细胞、亚细胞结构以及生物离子等进行客观检测。然而，流式细胞分析仅能对单细胞进行计数和分选，且需在制备单细胞悬液的基础上进行，因此为了从细胞层面展开对膈肌的深入研究，制作膈肌单细胞悬液的重要性不言而喻。

实体组织单细胞悬液的制备目前尚缺乏通用的方法，不同组织所适用的方法也不尽相同，甚至同一组织由于实验目的的不同，所用方法也不尽相同。目前主要有机械法和酶消化法，以及近年来一些研究者常用的机械-酶消化法^[10-11]。用酶消化组织时要根据不同组织类型选择相应的酶及作用条件，如有报道小鼠心脏组织单细胞悬液的制备选用胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ和胰蛋白酶^[12]，小鼠主动脉组织单细胞悬液的制备选用胶原酶Ⅺ、透明质酸酶1-s和胶原酶Ⅰ^[13]，也有报道选用胶原酶Ⅴ应用酶消化法成功制备出小鼠肺单细胞悬液等^[14]。由于膈肌组织单细胞悬液的制备目前未见相关报道，因此对制作方法的选择上存在一定困难。

该研究结合不同消化酶的生物学特性及参考其他实体组织单细胞悬液成功制备的文献^[15-21]，以及膈肌为骨骼肌这一组织学特点，选用机械法与机械-酶消化法分别尝试制备大鼠膈肌组织单细胞悬液，选用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ及胶原酶Ⅳ作为实验所用的消化酶^[22-30]，在机械碎屑组织的基础上，通过不同酶的组合对糊状组织进行消化，而机械法仅作研磨，通过对细胞形态学观察和细胞计数，2种方法均能获得单细胞悬液，但单细胞数量、细胞碎片和细胞团块不仅在2种方法之间而且在不同酶组合方法之间均存在显著差异，其中机械-酶消化法采用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶(机械-酶三联消化法)消化获得的单细胞产率最高，细胞碎片和组织碎片及细胞团块相对少，其次是胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ组合获得的单细胞产率也较高，而仅用胰蛋白酶消化和单纯研磨法获得的单细胞悬液中细胞团块较多。

获得较高产率的单细胞是进行细胞学研究的前提，但这远远不够，需有较高比例的活细胞才能满足进一步实验的要求。该研究在获得单细胞悬液的基础上，经锥虫蓝染色后进行了细胞活性测定，并计算出细胞存活率。机械法所得单细胞悬液的细胞浓度虽不是很低，在1.0×10⁶以上，但细胞死亡较多，存活率最低；机械-酶消化法中，单纯加入胰蛋白酶进行消化后所得的单细胞悬液消化不够充分，团块较多，所得单细胞数量最少，因而认为单纯应用胰蛋白酶消化大鼠膈肌组织是远远不够的，需联合胶原酶。实验中加入胶原酶Ⅳ消化大鼠膈肌组织所得的单细胞悬液整体相对较好，活细胞数量相对较多，死细胞及细胞团块较少，所得单细胞悬液浓度相对偏高；加入胶原酶Ⅱ的消化作用相对过强，较容易造成细胞损伤。实验前推测认为同时加入4种消化酶对大鼠膈肌组织进行消化，所得的单细胞悬液可能效果较好，消化较充分，而从最终结果可以发现，其细胞存活率较低，仅次于单纯机械研磨法，推测认为可能因消化酶种类过多、消化能力过强导致大鼠膈肌组织细胞过度消化有关。通过对不同方法获得的结果进行比较，机械-酶三联消化法所制得的单细胞悬液活细胞最多，失活细胞数及细胞团块相对较少，单细胞悬液中活细胞百分率在92%以上，0.1 g膈肌组织可获得(1.0-2.0)×10⁶个细胞，其次是加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ这2种等体积混合酶消化法，所得单细胞悬液浓度同样在3×10⁶以上，且细胞成活率及细胞团块方面也均较为理想；单纯研磨法获得的单细胞悬液活细胞产率较低。

实验只选用较为常用的4种消化酶，即胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ及胶原酶Ⅳ作为机械-酶消化法所用的消化酶，其工作浓度分别按0.25%、0.1%、0.1%、0.1%进行初步探索应用，而除此以外还有一些其他的消化酶，如胃蛋白酶、透明质酸酶以及其他类型的胶原酶等，以及酶的生物学特性对浓度、温度及pH值等因素均非常敏感，因此在今后原有研究基础上尝试使用其他消化酶及不同酶浓度等进一步研究，探索更优的获取大鼠膈肌组织单细胞悬液的方法。

研究表明，不论是机械法还是机械-酶消化法均能成功制备出大鼠膈肌单细胞悬液，均获得不同浓度的单细胞，通过这2种方法制作膈肌单细胞悬液都是可供借鉴的可行制作方法，但不同方法和不同酶组合所获得的单细胞浓度、活细胞率有差异，整体上机械-酶消化法优于单纯机械法，通过不同酶的组合消化，机械-酶三联消化法和胰蛋白酶与胶原酶Ⅳ组合消化获得的单细胞浓度和活细胞产率均较高，均能够满足进行细胞层面的研究。但是，与诸多实体器官如肝脏、脾脏等相比，由于膈肌细胞形态的特殊性，也没有现成的制作膈肌单细胞悬液的成熟方法可以借鉴，最佳的方法有待通过多种酶的不同组合和不同酶浓度组合进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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