三种人胎盘组织来源间充质干细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1600

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (9): 1377-1383.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1600

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三种人胎盘组织来源间充质干细胞的生物学特性

王留娣，刘威，谢园园，高天芸，黄霏霏，王斌

南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究室，江苏省南京市 210008

修回日期:2018-11-07 出版日期:2019-03-28 发布日期:2019-03-28
通讯作者: 王斌，博士，教授，研究员，南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究室，江苏省南京市 210008
作者简介:王留娣，女，1985年生，汉族，2008年南京医科大学毕业，主要从事干细胞相关研究。
基金资助:
科技部2017年重大研发计划干细胞专项(2017YFA0104300)，项目负责人：顾宁；国家自然科学基金面上项目(81571213)，项目负责人：王斌；江苏省第十三批“六大人才高峰”项目(WSN-155)，项目负责人：王斌；南京市“十三五”规划重点项目(ZDX16005)，项目负责人：王斌；南京市“十三五”青年人才项目(第一层次)(QRX17006)，项目负责人：王斌

Biological characteristics of three kinds of human placenta-derived mesenchymal stem cells

Wang Liudi, Liu Wei, Xie Yuanyuan, Gao Tianyun, Huang Feifei, Wang Bin

Department of Clinical Stem Cell Research, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China

Revised:2018-11-07 Online:2019-03-28 Published:2019-03-28
Contact: Wang Bin, MD, Professor, Researcher, Department of Clinical Stem Cell Research, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
About author:Wang Liudi, Department of Clinical Stem Cell Research, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Key Research & Development Program of China in 2017, No. 2017YFA0104300 (to GN); the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81571213 (to WB); the 13^th-Batch Jiangsu Province Six Talent Peaks Project, No. WSN-155 (to WB); Nanjing “13^th Five-Year Plan” Key Project, No. ZDX16005 (to WB); Nanjing “13^th Five-Year” Youth Talent Project (Level 1), No. QRX17006 (to WB)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胎盘：是母体与胎儿间进行物质交换的器官，是胚胎与母体组织的结合体，由羊膜、绒毛膜和蜕膜构成，也是获取间充质干细胞的理想来源，在干细胞治疗和再生医学中具有潜在广泛的用途。
调节性T细胞：简称Tregs，是一类机体具有负向免疫调节作用的T细胞亚群，其中CD4、CD25和Foxp3作为调节性T细胞的特异性标志分子，在维持免疫环境稳态，诱导免疫耐受中发挥重要作用。

摘要
背景：胎盘组织结构复杂，包括胎儿侧的羊膜、绒毛膜以及母体侧的蜕膜等。尽管一些文献已经报道这3种组织来源间充质干细胞具有一些共有的生物学特性，但是对于来自同一胎盘不同组织来源间充质干细胞是否存在不同的生物学特性，目前仍缺乏定量的研究分析。
目的：探讨人胎盘不同组织来源间充质干细胞的生物学特性，包括分化潜能和免疫调节功能。
方法：利用酶消化法从1例男婴胎盘组织分离羊膜来源间充质干细胞、绒毛膜来源间充质干细胞和蜕膜来源间充质干细胞。系统性研究这3种间充质干细胞的生物学特性，包括细胞形态、表面标志物表达、核型分析、成脂、成骨分化能力以及调节性T细胞的增殖能力。
结果与结论：①3种细胞均呈成纤维细胞形态，均表达间充质干细胞的表面标志物：高表达CD73、CD90和CD105，低表达CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR；②羊膜、绒毛膜间充质干细胞核型与胎儿相同，蜕膜间充质干细胞核型与母体相同；③3种间充质干细胞成脂分化能力存在显著性差异，依次为蜕膜间充质干细胞>绒毛膜间充质干细胞>羊膜间充质干细胞(P < 0.05)；相反，羊膜间充质干细胞的成骨分化能力明显高于蜕膜间充质干细胞(P < 0.05)；④羊膜间充质干细胞和绒毛膜间充质干细胞促进调节性T细胞增殖的能力显著高于蜕膜间充质干细胞；⑤结果表明，人胎盘羊膜、绒毛膜、蜕膜组织来源间充质干细胞具有不同的核型、成脂、成骨分化潜能和免疫调节能力，为不同种子细胞治疗相关疾病达到最佳效果提供了一定的参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3981-8849(王斌)

关键词: 胎盘组织, 间充质干细胞, 羊膜, 绒毛膜, 蜕膜, 羊膜间充质干细胞, 绒毛膜间充质干细胞, 蜕膜间充质干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The placental tissue structure is complex, including the amniotic membrane, chorion, and decidua from the mother. Mesenchymal stem cells derived from different tissues of the same placenta have been reported to have similar biological characteristics. To date, there is no study regarding quantitative comparison of differentiation potential and immunomodulatory function of mesenchymal stem cells derived from different tissues of human placenta.
OBJECTIVE: To investigate the biological characteristics including differentiation potential and immunomodulatory function of mesenchymal stem cells derived from different tissues of human placenta.
METHODS: The amnion-, chorion-, and decidua-derived mesenchymal stem cells were isolated from the placental tissue of a baby boy by enzymatic digestion method. The biological characteristics of these three kinds of mesenchymal stem cells were systematically investigated including cell morphology, immunophenotypes, karyotypeanalysis, adipogenic and osteogenic differentiation potential, and Treg cells proliferation capacity.
RESULTS AND CONCLUSION: All three kinds of mesenchymal stem cells showed fibroblast-like morphology and expressed the surface markers of mesenchymal stem cells with high expressions of CD73, CD90 and CD105, as well as low expressions of CD14, CD19, CD34, CD45 and HLA-DR. The karyotypes of the amnion- and chorion-derived mesenchymal stem cells were the same as the fetus, and decidua-derived mesenchymal stem cells had the same karyotype as the mother. There were significant differences in adipogenic differentiation capacity between three kinds of mesenchymal stem cells (amnion-derived mesenchymal stem cells > chorion-derived mesenchymal stem cells > decidua-derived mesenchymal stem cells; P < 0.05). In contrast, the osteogenic differentiation capacity of amnion-derived mesenchymal stem cells was remarkably higher than that of decidua-derived mesenchymal stem cells (P < 0.05). The amnion- and chorion-derived mesenchymal stem cells had the higher potential of Treg cell proliferation induction than decidua-derived mesenchymal stem cells. These findings indicate that three sources of human placenta-derived mesenchymal stem cells have different karyotypes, adipogenic and osteogenic differentiation potential, and immunomodulatory capability, providing a variety of ideal seed cell sources for disease treatment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Placenta, Mesenchymal Stem Cells, Amnion, Chorion, Decidua, Immunomodulation, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

王留娣，刘威，谢园园，高天芸，黄霏霏，王斌. 三种人胎盘组织来源间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1377-1383.

Wang Liudi, Liu Wei, Xie Yuanyuan, Gao Tianyun, Huang Feifei, Wang Bin. Biological characteristics of three kinds of human placenta-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1377-1383.

图/表（结果） 1

2.1 不同胎盘组织来源间充质干细胞的形态 接种48 h后，大部分细胞贴壁，72 h换液时可见少量细胞集落。细胞呈梭形或多角形，3-5 d后增殖加快，呈平行或漩涡状排列。培养5-7 d细胞可铺满瓶底80%以上。多次传代后细胞形态较为均一，均呈现成纤维形态，符合间充质干细胞形态特点，见图1。

2.2 不同胎盘组织来源间充质干细胞的表面标志物 流式细胞仪分析结果显示，羊膜、绒毛膜以及蜕膜来源细胞均高表达CD73、CD90和CD105，大于95%；低表达CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，小于2%，与间充质干细胞表面标志物通用标准一致，见图2。

2.3 不同胎盘组织来源间充质干细胞的核型分析 G-带染色结果显示3种细胞染色体结构正常。羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞的核型为46，XY，表明细胞来源于男性胎儿组织；蜕膜来源间充质干细胞的核型为46，XX，表明细胞来源于母体组织，见图3。

2.4 不同人胎盘组织来源间充质干细胞的成脂、成骨分化能力比较 成脂诱导培养21 d后，油红O染色可见红色的脂滴，见图4；成骨诱导培养21 d后，茜素红染色均出现深红色的钙盐结节，见图5。统计分析结果表明：3种细胞都具有成脂成骨分化潜能，其中蜕膜来源间充质干细胞的成脂分化能力最强，依次为蜕膜来源间充质干细胞>绒毛膜来源间充质干细胞>羊膜来源间充质干细胞，各组间差异有显著性意义；而这3种细胞的成骨分化能力与成脂分化相反，成骨分化能力依次为羊膜来源间充质干细胞>绒毛膜来源间充质干细胞>蜕膜来源间充质干细胞，但仅羊膜来源间充质干细胞与蜕膜来源间充质干细胞的成骨分化能力差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 不同人胎盘组织来源间充质干细胞对调节性T细胞增殖能力的影响 3种间充质干细胞与外周血单个核细胞在重组人白细胞介素2刺激下体外共培养5 d，均促进CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞增殖，见图6。羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞高于蜕膜来源间充质干细胞，差异有显著性意义。绒毛膜来源间充质干细胞稍高于羊膜来源间充质干细胞，但是差异无显著性意义。

参考文献

[1] Pop DM, Sori??u O, ?u?man S, et al. Potential of placental-derived human mesenchymal stem cells for osteogenesis and neurogenesis. Rom J Morphol Embryol. 2015;56(3):989-996.

[2] Sardesai VS, Shafiee A, Fisk NM, et al. Avoidance of Maternal Cell Contamination and Overgrowth in Isolating Fetal Chorionic Villi Mesenchymal Stem Cells from Human Term Placenta. Stem Cells Transl Med. 2017;6(4):1070-1084.

[3] Consentius C, Reinke P, Volk HD. Immunogenicity of allogeneic mesenchymal stromal cells: what has been seen in vitro and in vivo. Regen Med. 2015;10(3):305-315.

[4] Bellavia M, Altomare R, Cacciabaudo F, et al. Towards an ideal source of mesenchymal stem cell isolation for possible therapeutic application in regenerative medicine. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2014;158(3): 356-360.

[5] Li M, Zhao Y, Hao H, et al. Mesenchymal stem cell-based therapy for nonhealing wounds: today and tomorrow. Wound Repair Regen. 2015;23(4):465-482.

[6] Kim R, Park SI, Lee CY, et al. Alternative new mesenchymal stem cell source exerts tumor tropism through ALCAM and N-cadherin via regulation of microRNA-192 and -218. Mol Cell Biochem. 2017;427(1-2):177-185.

[7] Ruan H, Xiao R, Jiang X, et al. Biofunctionalized self-assembly of peptide amphiphile induces the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural cells. Mol Cell Biochem. 2018 Jun 21. doi: 10.1007/s11010-018-3386-9. [Epub ahead of print]

[8] Dezawa M. Muse Cells Provide the Pluripotency of Mesenchymal Stem Cells: Direct Contribution of Muse Cells to Tissue Regeneration. Cell Transplant. 2016;25(5):849-861.

[9] Faghihi F, Mirzaei E, Ai J, et al. Erratum to: Differentiation Potential of Human Chorion-Derived Mesenchymal Stem Cells into Motor Neuron-Like Cells in Two- and Three-Dimensional Culture Systems. Mol Neurobiol. 2016;53(3):1873.

[10] Wang X, Lazorchak AS, Song L, et al. Immune modulatory mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells through a trophoblast-like stage. Stem Cells. 2016;34(2): 380-391.

[11] Valencia J, Blanco B, Yáñez R, et al. Comparative analysis of the immunomodulatory capacities of human bone marrow- and adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells from the same donor. Cytotherapy. 2016;18(10):1297-1311.

[12] Lim JY, Im KI, Lee ES, et al. Enhanced immunoregulation of mesenchymal stem cells by IL-10-producing type 1 regulatory T cells in collagen-induced arthritis. Sci Rep. 2016;6:26851.

[13] Ma OK, Chan KH. Immunomodulation by mesenchymal stem cells: Interplay between mesenchymal stem cells and regulatory lymphocytes. World J Stem Cells. 2016;8(9):268-278.

[14] Wu M, Zhang R, Zou Q, et al. Comparison of the Biological Characteristics of Mesenchymal Stem Cells Derived from the Human Placenta and Umbilical Cord. Sci Rep. 2018;8(1):5014.

[15] Timmins NE, Kiel M, Günther M, et al. Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells. Biotechnol Bioeng. 2012;109(7):1817-1826.

[16] Du L, Lv R, Yang X, et al. Hypoxic conditioned medium of placenta-derived mesenchymal stem cells protects against scar formation. Life Sci. 2016;149:51-57.

[17] Araújo AB, Salton GD, Furlan JM, et al. Comparison of human mesenchymal stromal cells from four neonatal tissues: Amniotic membrane, chorionic membrane, placental decidua and umbilical cord. Cytotherapy. 2017;19(5):577-585.

[18] Eidem HR, Ackerman WE 4th, McGary KL, et al. Gestational tissue transcriptomics in term and preterm human pregnancies: a systematic review and meta-analysis. BMC Med Genomics. 2015;8:27.

[19] Gan WT, Sun X, Lu Y. Comparison of Biological Characteristics between Human Amnion Epithelial Cells and Human Amnion Mesenchymal Stem Cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2015;23(4):1120-1124.

[20] Kwon A, Kim Y, Kim M, et al. Tissue-specific Differentiation Potency of Mesenchymal Stromal Cells from Perinatal Tissues. Sci Rep. 2016;6:23544.

[21] Abumaree MH, Abomaray FM, Alshehri NA, et al. Phenotypic and Functional Characterization of Mesenchymal Stem/Multipotent Stromal Cells From Decidua Parietalis of Human Term Placenta. Reprod Sci. 2016;23(9):1193-1207.

[22] Lobo SE, Leonel LC, Miranda CM, et al. The Placenta as an Organ and a Source of Stem Cells and Extracellular Matrix: A Review. Cells Tissues Organs. 2016;201(4):239-252.

[23] James JL, Srinivasan S, Alexander M, et al. Can we fix it? Evaluating the potential of placental stem cells for the treatment of pregnancy disorders. Placenta. 2014;35(2):77-84.

[24] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.

[25] Liu W, Xie Y, Gao T, et al. Reflection and observation: cell-based screening failing to detect HBV in HUMSCs derived from HBV-infected mothers underscores the importance of more stringent donor eligibility to reduce risk of transmission of infectious diseases for stem cell-based medical products. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):177.

[26] Hong JQ, Gao Y, Song J, et al. Comparison of Biological Characteristics and Immunosuppressive Activity between Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells and Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2016;24(3):858-864.

[27] Yi JZ, Chen ZH, Xu FH, et al. Interferon-γ suppresses the proliferation and migration of human placenta-derived mesenchmal stromal cells and enhances their ability to induce the generation of CD4+CXCR5+Foxp3+Treg subset. Cell Immunol. 2018;326:42-51.

[28] Zhu Y, Yang Y, Zhang Y, et al. Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials. Stem Cell Res Ther. 2014;5(2):48.

[29] Ding C, Zou Q, Wang F, et al. Human amniotic mesenchymal stem cells improve ovarian function in natural aging through secreting hepatocyte growth factor and epidermal growth factor. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):55.

[30] Beegle JR, Magner NL, Kalomoiris S, et al. Preclinical evaluation of mesenchymal stem cells overexpressing VEGF to treat critical limb ischemia. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016;3: 16053.

[31] Liang L, Li Z, Ma T, et al. Transplantation of Human Placenta-Derived Mesenchymal Stem Cells Alleviates Critical Limb Ischemia in Diabetic Nude Rats. Cell Transplant. 2017; 26(1):45-61.

[32] Gan L, Duan H, Xu Q, et al. Human amniotic mesenchymal stromal cell transplantation improves endometrial regeneration in rodent models of intrauterine adhesions. Cytotherapy. 2017;19(5):603-616.

[33] Li J, Yu Q, Huang H, et al. Human chorionic plate-derived mesenchymal stem cells transplantation restores ovarian function in a chemotherapy-induced mouse model of premature ovarian failure. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):81.

[34] Fu Q, Man X, Yu M, et al. Human decidua mesenchymal stem cells regulate decidual natural killer cell function via interactions between collagen and leukocyte?associated immunoglobulin?like receptor 1. Mol Med Rep. 2017;16(3):2791-2798.

[35] Kawai M, Rosen CJ. PPARγ: a circadian transcription factor in adipogenesis and osteogenesis. Nat Rev Endocrinol. 2010; 6(11):629-636.

[36] Ye L, Fan Z, Yu B, et al. Histone demethylases KDM4B and KDM6B promotes osteogenic differentiation of human MSCs. Cell Stem Cell. 2012;11(1):50-61.

[37] Yamahara K, Harada K, Ohshima M, et al. Comparison of angiogenic, cytoprotective, and immunosuppressive properties of human amnion- and chorion-derived mesenchymal stem cells. PLoS One. 2014;9(2):e88319.

[38] Pianta S, Bonassi Signoroni P, Muradore I, et al. Amniotic membrane mesenchymal cells-derived factors skew T cell polarization toward Treg and downregulate Th1 and Th17 cells subsets. Stem Cell Rev. 2015;11(3):394-407.

[39] Ohshima M, Yamahara K, Ishikane S, et al. Systemic transplantation of allogenic fetal membrane-derived mesenchymal stem cells suppresses Th1 and Th17 T cell responses in experimental autoimmune myocarditis. J Mol Cell Cardiol. 2012;53(3):420-428.

[40] Luz-Crawford P, Kurte M, Bravo-Alegría J, et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Res Ther. 2013;4(3):65.

[41] Suzuki M, Jagger AL, Konya C, et al. CD8+CD45RA+CCR7+ FOXP3+ T cells with immunosuppressive properties: a novel subset of inducible human regulatory T cells. J Immunol. 2012; 189(5):2118-2130.

[42] Pelekanos RA, Sardesai VS, Futrega K, et al. Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue. J Vis Exp. 2016;(112): 54204.

引言

间充质干细胞是来源于中胚层的一类成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能^[1-3]。间充质干细胞可以从骨髓、脂肪、脐带、羊膜和胎盘等组织中分离培养^[4-6]，很多研究已经证实不同组织来源的间充质干细胞可以分化成3个胚层(内胚层、外胚层和中胚层)谱系的细胞，例如成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肝细胞和神经细胞等^[7-9]。间充质干细胞还具有显著的免疫调节能力^[10-12]，能抑制T细胞、B细胞和NK细胞增殖，能诱导产生调节性T细胞。因此，间充质干细胞在治疗多种自身免疫性疾病和炎症性疾病方面有广泛的应用前景^[13]。

胎盘是母体与胎儿间进行物质交换的器官，是胚胎与母体组织的结合体，在胎儿的发育、营养摄取和免疫耐受方面起着关键作用^[14]。足月胎盘是一个较大的组织(500-750 g)^[15]，可在胎儿分娩后无菌采集，对供者无风险，易于获得。与骨髓间充质干细胞相比，胎盘间充质干细胞来源广泛、采集方便、免疫原性低、无侵入性操作以及无伦理争议等^[16]，具有广阔的临床应用前景。胎盘组织结构复杂，包括胎儿侧的羊膜、绒毛膜以及母体侧的蜕膜等^[17-18]。尽管一些文献已经报道胎盘这3种组织均可以制备获得间充质干细胞^[19-21]，并具有间充质干细胞的一些共有生物学特性，但是对于来自同一胎盘不同组织来源的间充质干细胞是否存在不同的生物学特性，目前仍缺乏定量的研究分析。这3种组织来源间充质干细胞的成脂、成骨分化能力的强弱以及免疫调控能力的高低，目前都没有研究报道。

该研究利用酶消化法分别从胎盘的羊膜、绒毛膜和蜕膜组织中获得不同组织特性的间充质干细胞，观察细胞形态，检测细胞表面标志物，并对3种间充质干细胞体外成脂、成骨分化能力以及诱导产生调节性T细胞的潜能进行定量比较分析。研究结果表明这3种间充质干细胞具有不同的分化潜能和免疫调节能力，为组织工程、再生医学及细胞治疗领域选择种子细胞提供新的理论基础和实践指导。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年2至8月在南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究室完成。

1.3 材料 胎盘组织来源于南京鼓楼医院妇产科正常足月顺产男婴，与产妇及其家属签署知情同意书后，在产房无菌条件下获取胎盘，放至无菌袋中，4 ℃运输至研究室。

实验试剂：DMEM基础培养基、胎牛血清、细胞消化裂解液(Tryple)、DPBS及青链霉素、Percoll淋巴细胞分离液、Ⅰ型胶原酶、Dispase分散酶、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、吲哚美辛、β-甘油磷酸钠、油红O、茜素红(GIBCO，美国)；秋水仙素、枸橼酸钠和多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司，中国)；抗人CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和HLA-DR抗体(BD，美国)；调节性T细胞检测试剂盒(Invitrogen，美国)。

实验仪器：生物安全柜、二氧化碳培养箱、离心机和电动移液器(Thermo Scientific，美国)；倒置相差显微镜(Leica，德国)；流式细胞仪(BD，美国)；核型分析仪(Leica，德国)；恒温振荡水浴锅(常州国华，中国)。

1.4 实验方法

1.4.1 不同胎盘组织来源间充质干细胞的分离、培养和扩增 将胎盘组织放置于无菌的不锈钢托盘里，分离方法如下：①使用无菌镊子和手术刀处理胎盘，确保羊膜和绒毛膜连接完好；②3种组织获得方法：羊膜—将羊膜与绒毛膜分离开，小心剥离羊膜组织，大小30 cm×30 cm；绒毛膜—从绒毛膜板切0.5 cm×1 cm的组织块；蜕膜—翻转胎盘使母体表面(蜕膜基底)朝上，蜕膜基底组织切下大小0.5 cm×1 cm的组织块；③组织处理：用含1%青链霉素的DPBS洗涤组织两三次，使用无菌手术刀将羊膜切成3 cm×3 cm片状；绒毛膜组织和蜕膜组织剪成碎末；然后将组织分别转移到 50 mL离心管，做好标记；④离心管中加入10 mL Ⅰ型胶原酶(含2.5 U/mL Dispase分散酶)，置于摇床上37 ℃、220 r/min振荡1.5-2.0 h；⑤加入含体积分数为10%胎牛血清的完全培养基终止消化，100目滤网过筛，1 500 r/min离心5 min；⑥细胞计数后，接种于培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养，进行传代。

细胞培养48 h后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每2 d或3 d换液1次。待细胞长至80%-90%时，加入Tryple消化，用倒置相差显微镜观察细胞消化情况，终止消化后，离心重悬接种在新的培养瓶，为第1代。传代培养过程中每2 d或3 d换液，直至贴壁细胞融合至大约80%时，再重复上述操作，传代培养记为第2代，其余类推。

1.4.2 不同胎盘组织来源间充质干细胞的表面标志物鉴定 ①制备细胞悬液：取第3代细胞，用Tryple消化后，加入完全培养基终止消化，1 500 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞，制备成2×10⁵/管的细胞悬液，共5管，标记为1，2，3，4，5号；②1号流式管为空白对照，不加入任何抗体；2号流式管加入1 μL CD14抗体和1 μL CD73抗体；3号流式管加入1 μL CD19抗体和1 μL CD90抗体；4号流式管加入1 μL CD34抗体和1 μL CD45抗体；5号流式管加入1 μL CD45抗体和1 μL HLA-DR抗体；③室温避光孵育30 min，DPBS洗涤2次，将每管细胞重悬于200 μL DPBS中，流式细胞仪检测。

1.4.3 不同胎盘组织来源间充质干细胞的成脂、成骨定向诱导分化 ①细胞接种：将第3代3种不同组织来源的细胞以1×10⁵/孔接种于6孔板内；②诱导培养：当细胞密度达到70%融合时，换成脂诱导分化液(基础培养基DMEM，含体积分数为5%胎牛血清、0.05 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和5 U/mL人胰岛素)或成骨诱导分化液(基础培养基DMEM，含体积分数为5%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 μmol/L维生素C)；③每隔3 d换液，诱导21 d；④分化鉴定：小心移去培养液，用PBS轻洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，成脂分化采用油红O染色，成骨分化采用茜素红染色鉴定，分别染色30 min后，PBS洗涤3次，显微镜下观察、拍照。

应用Image J软件对图片进行分析，打开软件：①点击“File”菜单选择“Open”选项；②进入“Image”菜单然后点击“Type”子菜单选择“RGB Stake”选项，将图片分割成红、绿和蓝3个通道后转换成3张灰度图像；③选定原图片为参照图片；④再次进入“Image”菜单点击“Adjust”子菜单，使用“Threshold”工具根据参照图片定位阳性染色区域，直到所有阳性染色区域被高亮成红色；⑤进入“Analyze”菜单“Set Measurement”子菜单，选择“Area”，“Area Fraction”，“Min＆Max gray value”，“Mean gray value”4个选项，点击“OK”进行保存；⑥点击“Analyze”菜单选中“Measure”选项，获得数据。

1.4.4 不同胎盘组织来源间充质干细胞的核型分析 ①将第3代3种细胞加入100 mg/L秋水仙素60 μL，终质量浓度为1.5 mg/L，混匀，放入培养箱30 min；②弃上清，用DPBS洗细胞，加入Tryple消化细胞，加入完全培养基终止消化后，1 500 r/min离心8 min；③沿管壁缓慢加入1%的枸橼酸钠溶液5 mL，用一次性吸管轻轻吸打混匀细胞，置于37 ℃水浴箱10 min；④加入0.5-1.0 mL固定液，混匀，1 500 r/min离心8 min，去上清；⑤加入固定液，滴片，置Giema染液中染色4 min，将标本用水漂洗后晾干，上机扫描分析。

1.4.5 不同胎盘组织来源间充质干细胞对调节性T细胞增殖能力的影响 ①取外周血(来源于南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究室，与捐献者签署知情同意书)，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，细胞计数；②以1×10⁶/孔铺于6孔板中，实验分为5组：外周血单个核细胞组、外周血单个核细胞+刺激剂重组人白细胞介素2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)组、外周血单个核细胞+刺激剂重组人白细胞介素2+羊膜来源间充质干细胞(1×10⁵/孔)共培养组、外周血单个核细胞+刺激剂重组人白细胞介素2+绒毛膜来源间充质干细胞(1×10⁵/孔)共培养组、外周血单个核细胞+刺激剂重组人白细胞介素2+蜕膜来源间充质干细胞(1×10⁵/孔)共培养组；③每孔加入RPMI 1640完全培养基至终体积为2 mL，37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱培养；④培养5 d后，收集非贴壁细胞，离心，细胞沉淀内加入50 μL生理盐水重悬；⑤加入抗人CD4和CD25混合抗体，振荡混匀后室温避光孵育30 min；⑥加入固定剂室温避光孵育30 min；⑦再加入破膜剂振荡混匀，1 500 r/min离心5 min后弃上清；⑧加入抗人Foxp3抗体室温避光孵育30 min；⑨加入1 mL生理盐水振荡洗涤，1 500 r/min离心5 min后弃上清；⑩加入360 μL重悬液，上机检测。

1.5 主要观察指标 ①通过观察细胞形态、表面标记物以及成脂成骨分化能力，确定制备的细胞是否为间充质干细胞；②通过染色体核型判定细胞来源；③通过调节性T增殖能力分析细胞的免疫调节能力。

1.6 统计学分析 采用Image J软件(National Institute of Mental Health，美国)和GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software，美国)进行统计处理，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，数据表示为平均值(Mean) ±标准误(Standard Error of Mean，SEM)，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

胎盘组织可以分离制备多种类型的间充质干细胞，是再生医学重要的干细胞来源^[22-23]。在该研究中，作者系统性分析了同一胎盘组织羊膜、绒毛膜以及蜕膜来源间充质干细胞的生物学特性以及促进调节性T细胞增殖的能力。研究结果表明3种细胞均高表达CD73、CD90和CD105，低表达CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR；羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞核型与胎儿相同，蜕膜来源间充质干细胞核型与母体相同；成脂分化能力依次为蜕膜来源间充质干细胞>绒毛膜来源间充质干细胞>羊膜来源间充质干细胞；成骨分化能力依次为羊膜来源间充质干细胞>绒毛膜来源间充质干细胞>蜕膜来源间充质干细胞；对于促进调节性T细胞增殖能力，羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞显著高于蜕膜来源间充质干细胞。

基于间充质干细胞的众多研究成果，目前对间充质干细胞的通用标准基本达成共识。国际干细胞研究学会和国际细胞治疗协会均对间充质干细胞的通用标准进行了定义^[24-25]。研究表明来源于同一胎盘的羊膜、绒毛膜以及蜕膜来源细胞均满足间充质干细胞的通用生物学特性：表达间充质干细胞表面标志物，都具有成脂、成骨分化潜能，具有免疫调节能力。这些结果也与文献[26-27]研究结果相一致。

研究表明同一胎盘不同组织来源间充质干细胞虽然具有相似的生物学特性，但还存在着一定的差异性，可能影响临床疾病的治疗效果。有文献报道同一胎盘中胎儿组织来源的间充质干细胞高表达人肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子，促进细胞增殖和抑制凋亡，加速伤口和溃疡面的愈合，治疗慢性创面和糖尿病溃疡疾病的效果更好，同时治疗卵巢早衰效果也很明显^[28-29]。母体组织来源的间充质干细胞高水平分泌血管内皮生长因子和血管生成素1，增加血管通透性，促进内皮细胞的增殖和新生血管的生成，治疗后肢缺血疾病更具有优势^[30-31]。如何选择最合适和最有效的间充质干细胞，作为治疗疾病的种子细胞，目前仍然是有待解决的关键问题。间充质干细胞在疾病治疗中最重要的两种生物学功能是细胞分化潜能和免疫调控作用。尽管有文献报道了这3种间充质干细胞具有成脂、成骨分化能力^[32-34]，但并未对分化潜能进行量化比较，因此对于治疗特定疾病时的种子细胞选择并没有参考作用。在该研究中，作者是首次对来源于同一胎盘的3种间充质干细胞进行定量分析比较它们的细胞分化潜能和免疫调控作用。成脂分化能力依次为蜕膜来源间充质干细胞>绒毛膜来源间充质干细胞>羊膜来源间充质干细胞，各组间差异有显著性意义；成骨分化能力依次为羊膜来源间充质干细胞>绒毛膜来源间充质干细胞>蜕膜来源间充质干细胞。显然羊膜来源间充质干细胞成脂分化能力弱，成骨分化能力最强，而蜕膜来源间充质干细胞成脂能力最强，成骨分化能力最弱。这一结果不仅表明同一胎盘不同组织来源间充质干细胞的成脂、成骨分化能力存在差异，还证实了同一种间充质干细胞成脂、成骨分化潜能成反向关系^[35-36]。在利用间充质干细胞成骨分化能力进行骨缺损修复、骨再生、骨质疏松症以及骨骼衰老等骨相关疾病的治疗时，采用羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞的效果比蜕膜来源间充质干细胞更好。如果拟采用胎盘来源间充质干细胞用于美容、脂肪分化填充则采用蜕膜来源间充质干细胞可能更为适宜。

间充质干细胞具有很强的免疫调控能力，能进行多种自身免疫系统疾病的治疗^[37-39]。间充质干细胞能够在体外促进活化的人外周血单个核细胞、小鼠脾细胞和CD4⁺T细胞中的调节性T细胞增殖^[40]。调节性T细胞是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群，在诱导免疫耐受、维持免疫微环境稳态和抑制自身免疫性疾病中发挥关键作用^[41]。该研究发现羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞对调节性T细胞的增殖促进能力显著，高于蜕膜来源间充质干细胞，这一结果表明羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞的免疫调节能力可能更优于蜕膜来源间充质干细胞。因此，在免疫抑制治疗相关疾病方面，羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞可能更适合用于治疗自身免疫性疾病，例如移植物抗宿主病和克罗恩病等。

G-带染色结果显示3种间充质干细胞染色体结构正常。羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞的核型为46，XY，表明细胞来源于男性胎儿组织；蜕膜来源间充质干细胞的核型为46，XX，表明细胞来源于母体组织，这也与一些文献研究结果相吻合^[14^，^42]。现在全球新生儿脐带和胎盘干细胞商业和公益储存已经达到相当大的规模，而且还在高速发展中。因此，大力发展胎盘间充质干细胞储存，将来可能自体应用治疗一些疾病，母亲和孩子都可能受益。如果孩子将来使用，使用羊膜、绒毛膜来源间充质干细胞为佳，而母亲使用的话，则以蜕膜来源间充质干细胞为最优先选择，这样不但可以避免伦理争议，而且还可能因为基因型相同从而避免免疫排斥反应等问题达到最佳治疗效果。

综上所述，3种间充质干细胞除具有通用的生物学特性和促进调节性T细胞增殖的能力，相互间也具有明显的差异性，针对不同的治疗用途可以采用不同的种子细胞达到最佳效果。胎儿来源羊膜、绒毛膜间充质干细胞的成骨分化能力和免疫调节能力显著强于母体来源蜕膜间充质干细胞，为组织工程和再生医学提供理想的种子细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

三种人胎盘组织来源间充质干细胞的生物学特性

Biological characteristics of three kinds of human placenta-derived mesenchymal stem cells

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[4]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[5]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[6]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[7]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[8]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[9]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[10]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[11]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[12]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[13]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[14]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
[15]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.