柚皮甙干预鼠颅顶骨破骨细胞的形成及功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.37.004

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (37): 6561-6566.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.37.004

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柚皮甙干预鼠颅顶骨破骨细胞的形成及功能

游涛^{1, 2}，王璐^{1, 2}，纪艳^{1, 2}，吴小红^{1, 2}

1重庆医科大学附属口腔医院修复科，重庆市 401147
2口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 401147

收稿日期:2013-03-02 修回日期:2013-04-14 出版日期:2013-09-10 发布日期:2013-09-10
通讯作者: 吴小红，博士，主治医师，重庆医科大学附属口腔医院修复科,口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 401147 296079748@qq.com
作者简介:游涛★，男，1978年生，四川省成都市人，汉族，重庆医科大学在读硕士，医师，主要从事组织工程骨材料的研究。 625862366@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金( 81200767/H1402)*；重庆市科委基金(CSTC 2010BB5102)*；重庆市卫生局基金(2012-2-8)*

Naringin intervention influences the formation and function of osteoclasts from mouse calvarial bone

You Tao^{1, 2}, Wang Lu^{1, 2}, Ji Yan^{1, 2}, Wu Xiao-hong^{1, 2}

1Department of Prosthodontics, the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China
2Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical, Chongqing 401147, China

Received:2013-03-02 Revised:2013-04-14 Online:2013-09-10 Published:2013-09-10
Contact: Wu Xiao-hong, M.D., Attending physician, Department of Prosthodontics, the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical, Chongqing 401147, China 296079748@qq.com
About author:You Tao★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Prosthodontics, the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical, Chongqing 401147, China 625862366@qq.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81200767/H1402*; Chongqing Science & Technology Commission, No. CSTC 2010BB5102*; Chongqing Municipal Health Bureau, No. 2012-2-8*

摘要/Abstract

摘要：

背景：柚皮甙能诱导骨形态发生蛋白2的基因表达，促进成骨细胞系的增殖和分化。体外细胞实验提示柚皮甙有抑制破骨细胞的形成及抗骨质疏松的作用。
目的：建立含有柚皮甙的鼠颅顶骨培养模型，观察不同剂量下柚皮甙对破骨细胞增殖分化的影响。
方法：实验选取出生4 d的SD乳鼠颅顶骨，在分别含有0，1，10，100 mg/L 的柚皮甙的培养基中培养，于培养的第1，3，7，10天测定柚皮甙对鼠颅顶骨中破骨细胞标志酶抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数及培养基中钙离子浓度的影响。
结果与结论：第1天各组间抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数及培养基中钙离子浓度无明显变化，第3，7天各组间抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数随柚皮甙质量浓度增加而减少，而培养基中钙离子浓度变化明显增加，到第10天这种变化趋势最为明显。说明柚皮甙能影响鼠颅顶骨中抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数量及其功能，并且这种作用成明显的时间剂量相关性。提示柚皮甙不仅能促进成骨细胞的增殖，同时也能减少破骨细胞的分化或加速其凋亡。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 柚皮甙, 抗酒石酸酸性磷酸酶, 破骨细胞, 成骨细胞, 骨组织培养, 钙离子, 颅顶骨, 细胞增殖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Naringin can increase bonemorphogeneticprotein 2 gene expression and promote the proliferation and differentiation of multipotential stem cell line. In vitro cell experiment indicates that naringin can suppress osteoclast formation and anti-osteoporosis activity.
OBJECTIVE: To prepare a mouse calvarial bone culture model containing naringin and to observe the effect of naringin with different concentrations on the formation and function of osteoclasts.
METHODS: Calvarial bone was dissected out aseptically from the 4-day-old Sprague Dawley mice, and cultured in the culture medium containing 0, 1, 10 and 100 mg/L naringin. The effects of naringin on the number of tartrate-resistant acid phosphatase-positive osteoclast marker enzyme in calvarial bone and the concentration of calcium in the culture medium were detected after cultured for 1, 3, 7 and 10 days.
RESULTS AND CONCLUSION: After cultured for 1 day, the number of tartrate-resistant acid phosphatase-positive cells in calvarial bones and the calcium concentration in the culture medium had no difference between the groups. After cultured for 3 and 7 days, the number of tartrate-resistant acid phosphatase-positive cells was decreased and the calcium concentration was increased with the increasing concentration of naringin. At 10 days after culturing, this trend was most obvious. It showed that naringin could affect the number and function of tartrate-resistant acid phosphatase-positive cells in calvarial bones, and this effect showed a significant time- and dose-depend manner. The results show that naringin can not only promote the proliferation of osteroclasts, but also reduce the differentiation of osteoclasts or accelerate the apoptosis.

Key words: osteoclasts, osteoblasts, skull, tissue culture techniques

中图分类号:

R318

游涛，王璐，纪艳，吴小红. 柚皮甙干预鼠颅顶骨破骨细胞的形成及功能[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(37): 6561-6566.

You Tao, Wang Lu, Ji Yan, Wu Xiao-hong . Naringin intervention influences the formation and function of osteoclasts from mouse calvarial bone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(37): 6561-6566.

图/表（结果） 3

参考文献

引言

骨是人体内一种由多种细胞参与构成的高度动态，在人的一生中能不断更新和修复的硬组织。在其主要的细胞成分中，成骨细胞能不断合成分泌骨基质，随后基质矿化，形成新骨，而破骨细胞在旧骨吸收中发挥重要作用。成骨细胞和破骨细胞的功能受到激素(甲状旁腺激素、钙三醇、降钙素、性激素)、局部因子(前列腺素，生长因子，细胞因子)等多种因素影响^[1]。正常的骨组织代谢依赖于成骨细胞和破骨细胞功能间的动态平衡状态^[2]。当旧骨吸收和新骨形成不协调，如骨吸收速度大于新骨形成速度时就可能出现骨质疏松症。

骨质疏松症是临床常见的骨代谢疾病，以骨量减少、骨组织显微结构退化，骨脆性增加为典型病理特征，多发于老年人和绝经后的妇女^[3]。增加新骨形成量或减少旧骨吸收量，纠正失衡是治疗骨质疏松症的重要方法。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要有两大类，一类是主要作用于成骨细胞，增加其骨形态发生蛋白基因表达的他汀类药物^[4]，降钙素类药物和雌激素类药物；另一类是主要抑制破骨细胞对骨基质的吸收从而延缓骨质疏松的形成和进展的二膦酸盐类药物^[5]。然而他汀类药物明显的副作用如胃肠道反应，头痛，严重的肌肉病变等^[6]；雌激素替代疗法增加绝经后妇女患乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌的风险^[7-8]；二膦酸盐类等药物的低效能，其增加或恢复骨量每年不超过2%^[5]，促使人们继续寻找一种既能刺激骨形成又能减少骨吸收的高效新药。

传统中医药学是中国的国宝，在骨科疾病治疗中有很长的应用历史。其中，骨碎补是伤科基药，其使用频率较高。中医认为骨碎补有补肾强骨、促进骨折愈合、续伤阵痛等功效，适用于牙齿松动、跌打闪挫、筋骨折伤、骨质疏松等症^[9]。骨碎补的主要活性物质柚皮甙是一种类黄酮物质，广泛存在于柑橘类水果如葡萄柚中。经大量研究证实，柚皮甙有类似他汀类药物的作用，能促进成骨细胞系的增殖和分化^[10-11]，诱导骨形态发生蛋白2的表达^[12]；同时，体外细胞实验也提示了其抑制破骨细胞的形成的作用^[13]。然而，直到现在，关于柚皮甙在组织器官培养中对破骨细胞的形成和功能影响还没有被报道。抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞的标志酶，为破骨细胞所特有。课题将骨碎补主要活性物质柚皮甙与骨培养技术相结合，制备出不同质量浓度的柚皮甙与鼠颅顶骨共同培养模型，进一步研究柚皮甙对破骨细胞形成及功能的影响，为临床上寻找理想的治疗骨质疏松类疾病的药物提供实验数据参考。

材料方法

设计：对比观察。

时间及地点：2011年11月至2012年5月在重庆医科大学附属口腔医院实验完成。

材料：

柚皮甙对鼠颅顶骨破骨细胞形成及功能影响实验所需试剂及仪器：

实验方法：

骨组织培养：实验选取出生4 d的SD乳鼠(由重庆医科大学实验动物中心提供)，麻醉条件下颈椎脱位处死后用体积分数75%的乙醇浸泡10 min，在无菌条件下剥离取出颅顶骨，解剖时保留其外表面的骨膜和内表面的硬脑膜。用α-MEM培养液冲洗3次后放入含体积分数15%胎牛血清、20 mmol/L HEPES、1 000 U/mL青霉素、 1 000 mg/L链霉素的α-MEM培养基的玻璃培养皿内，将每一个颅顶骨修剪分成4块(2片颞骨、1片额骨和1片枕骨)。骨片放入24孔培养板中，随机分为4个含骨片的实验组及1个不含骨片的空白组，每孔分别加入含体积分数10%胎牛血清，20 mmol/L HEPES，100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的α-MEM培养基2 mL，置于 37 ℃体积分数为5%的CO₂培养箱中培养24 h。第2日换液，并加入含 0，1，10，100 mg/L柚皮甙的α-MEM培养基，按不同时间间隔分别培养1，3，7，10 d，每3 d换液1次。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色：抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色是破骨细胞的特征性标志, 采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒对骨片染色，步骤如下：在培养的第1，3，7，10天取出培养的颅顶骨，用体积分数95%的乙醇和5%冰醋酸4 ℃固定10 min。PBS冲洗3次后，将骨片浸入染色孵育液中(六偶氮副品红1 mL，0.2 mol/L醋酸缓冲液18 mL, 萘酚AS-BI磷酸盐20 mg, 酒石酸盐 50 mmol)37 ℃ 避光孵育30 min，双蒸水冲洗3次，立即用中性树胶封固，光镜下观察并计数红色或紫红色的抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞。

培养基钙离子浓度检测：用原子吸收分光光度计测定培养基钙离子浓度其步骤为：分别收集骨片在不同质量浓度柚皮甙中第0，1，3，7和10天的培养上清液0.5 mL。用电阻为18 MΩ的超纯水稀释20倍后，用原子吸收分光光度计测量总钙含量，并与不含骨片的对空白组中培养基钙离子浓度相减，计数出钙离子浓度的变化值。测量条件为：灯电流3 mA，狭缝0.5 nm、波长422.7 nm、阻尼常数2、乙炔流量1 L/min、空气流量3.5 L/min。

主要观察指标：①柚皮甙对抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞的抑制作用。②柚皮甙对骨培养过程中培养基钙离子浓度的变化。

统计学分析：使用美国SPSS 17.0软件进行统计分析。采用Krusklal-walis H test 统计法对各组的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞计数和钙离子浓度变化进行分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松是一种以全身性骨量减少和骨组织微细结构破坏为特征的疾病，早期的骨质疏松患者没有任何临床症状，而到了中晚期，骨质疏松的临床表现以疼痛为主，严重的可因骨质脆性增加而引起骨折^[14]。在世界范围内骨质疏松的防治和治疗已成为当前迫切需要解决的问题。

祖国传统医学对这类疾病已有数千年的治疗历史。目前，国内外对骨质疏松的病因及其临床防治研究正在不断深入中，鉴于现代医学对骨质疏松的病理病机以及治疗方法和治疗药物还有待进一步的研究和探讨，结合中国传统医学的优势，利用现代医学科研手段从细胞分子水平了解分析传统中医药方剂作用机体的途径和特异性，从而寻找到一种既经济又十分有效的治疗药物是非常有意义的。

在众多治疗骨质疏松的研究与临床应用中中药骨碎补已引起了广泛的关注，相关研究表明，骨碎补能刺激前成骨细胞、破骨细胞的分化、增殖^[15]。有学者发现骨碎补的主要活性成分柚皮甙有对抗氧自由基的抗氧化作用^[16]，能促进小鼠MC3T3-E1细胞、小鼠原代培养成骨细胞、人原代培养成骨细胞^[12]，人骨髓间充质干细胞等多种成骨样细胞的增殖和分化^[17], 下调成骨细胞中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，而羟甲基戊二酰辅酶A还原酶A的下调能够增强和促进成骨细胞骨形态发生蛋白2表达^[18]，从而提高成骨分化^[19]，近年来的研究也表明柚皮甙与破骨细胞的分化功能有明显相关性^[20]。体外细胞实验提示柚皮甙能够通过阻止RANK因子介导的NF-kappaB和ERK信号，抑制破骨细胞关键基因的表达，干扰破骨细胞的形成和减少骨吸收^[13]。

破骨细胞是一种高度分化的多核巨细胞，是骨吸收的主要效应细胞，其功能活性对骨量的变化具有重要意义，因此调节破骨细胞功能活性的相关药物成为研究的热点之一，由于原代破骨细胞的分离培养比较困难，且不能传代，生命周期短暂，虽然自20世纪80年代Chambers^[21]首次从新生兔长骨中分离并建立破骨细胞体外培养方法以来，人们对其不断改进，但到目前为止，尚不能大量获得完全纯化的破骨细胞。同是，由于对破骨细胞的起源任存在争议^[22]，体外诱导培养出的破骨细胞样细胞不能完全还原体内破骨细胞的形成过程和功能特性。

利用骨器官培养体系研究骨形成、钙化及吸收调节由来已久，是国外发展较快的一种快速体外实验方法。自Schwartz等对骨器官进行了体外培养以来，其技术得到了讯速发展和广泛的应用^[23]。该方法不仅可以方便的观察骨的形成和吸收, 而且能够观察药物对骨形成和吸收的动态过程,更便于研究了解药物对骨代谢机制作用和影响。它与细胞培养相比，保留了骨组织内各种细胞间及骨基质间的联系，更近似于体内的生长情况；与体内实验相比，体外骨器官培养具有快速、简便、经济, 能够准确控制受试物的剂量和作用时间，并能排除体内复杂因素的干扰，在研究单一因素对骨形成、钙化及吸收的调节作用方面，结果重现性好等优点^[24-26]。近年，有报道体外培养的颅盖骨能释放亲骨活性因子^[27]。因此，骨器官培养模型亦是研究骨代谢自分泌与旁分泌的必要方法。

实验是第1次用骨器官培养的方法研究柚皮甙在成骨及骨吸收过程中的作用。在实验中发现柚皮甙能明显抑制鼠颅顶骨中抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞的数量。这种变化有明显的剂量和时间依赖性，高质量浓度 (100 mg/L)的柚皮甙组中第10天抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数下降最为明显(76%)，其结果与培养基中钙离子浓度变化相吻合。实验结果提示柚皮甙不仅能促进成骨细胞的增殖^[28]，同时也能减少破骨细胞的分化或加速其凋亡。由于骨代谢过程是成骨细胞和破骨细胞的共同作用，柚皮甙能同时作用于成骨细胞和破骨细胞，应用骨组织培养技术能很好的观察和研究其作用过程，实验室今后将继续利用骨组织培养实验模型，进一步探讨柚皮甙对骨代谢的相关机制。

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