黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.021

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6515-6520.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.021

• 干细胞与中医药 stem cells and traditional Chinese medicine • 上一篇下一篇

黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

宋雪云¹，龙云¹，谭超¹，郑景辉^1，2

¹湖南中医药大学第一附属医院，湖南省长沙市 410007；²广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011

收稿日期:2013-01-14 修回日期:2013-01-21 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 郑景辉，博士，副教授，广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011 zhengjinghui@hotmail.com
作者简介:宋雪云★，女，1978年生，内蒙古自治区赤峰市人，汉族，2005年湖南中医药大学毕业，硕士，主治医师，从事中西医结合心血管疾病的临床研究。 songxueyun3721@126.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(81102595)*《养心通脉有效部位方对BMSCs作用靶点及信号转导通路的研究》；广西自然科学基金项目(2012GXNSFAA053113) *《心血瘀阻证心肌微环境变化及对骨髓间充质干细胞移植的影响》

Combination of tanshinone IIa and astragaloside induces bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into myocardium-like cells

Song Xue-yun¹, Long Yun¹, Tan Chao¹, Zheng Jing-hui^1,2

¹The First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; ²Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicining, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2013-01-14 Revised:2013-01-21 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Zheng Jing-hui, M.D., Associate professor, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China zhengjinghui@hotmail.com
About author:Song Xue-yun★, Master, Attending physician, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China songxueyun3721@126.com
Supported by:
he National Natural Science Foundation of China, No. 81102595*; the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2012GXNSFAA-053113*

摘要/Abstract

摘要：

背景：黄芪甲苷和丹参酮Ⅱa是传统中医药治疗心肌缺血的有效成分，是否可参与骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的过程呢？
目的：观察黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化作用的影响。
方法：应用MTT法分别测定黄芪甲苷和丹参酮Ⅱa的最大无毒浓度，确定两者联合诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的剂量。将分离纯化的骨髓间充质干细胞分5组进行诱导：黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa组、丹参酮Ⅱa+黄芪甲苷组、5-氮胞苷组、空白对照组，ELISA方法观察体外诱导后骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43和肌钙蛋白表达变化。
结果与结论：诱导后丹参酮Ⅱa+黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷、5-氮胞苷组肌钙蛋白、缝隙连接蛋白43表达水平均高于正常对照组(P < 0.01)，丹参酮Ⅱa+黄芪甲苷组高于丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷组(P < 0.01)。丹参酮Ⅱa+黄芪甲苷组与5-氮胞苷组缝隙连接蛋白43表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)。结果提示黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞方向转化，而其联合作用高于单一成分的作用。

关键词: 干细胞, 丹参, 黄芪, 心肌缺血, 细胞分化, 肌钙蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Astragaloside and tanshinone IIa are the effective components of traditional Chinese medicine treatment of myocardial ischemia, and its role in bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into myocardium-like cells remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of tanshinone IIa and astragaloside on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into myocardium-like cells. METHODS: The maximal non-toxic concentrations of tanshinone IIa and astragaloside were measured using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay, to define the dose of the two in the induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into myocardium-like cells. The isolated and purified bone marrow mesenchymal stem cells were divided into five groups: astragaloside group, tanshinone IIa group, astragaloside + tanshinone IIa group, 5-azacitidine group, and blank control group. The expression of gap junction connexin 43 and troponin was determined with enzyme-linked immunosorbent assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of gap junction connexin 43 and troponin in astragaloside group, tanshinone IIa group, astragaloside + tanshinone IIa group, 5-azacitidine group was higher than that in blank control group (P < 0.01). The astragaloside + tanshinone IIa group showed a higher expression of gap junction connexin 43 and troponin than astragaloside group and tanshinone IIa group (P < 0.01). There was no significant difference in the expression of gap junction connexin 43 and troponin between astragaloside + tanshinone IIa group and 5-azacitidine group (P > 0.05). A combined use of astragaloside and tanshinone IIa can induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into myocardium-like cells, and their joint role is better than the role of a single ingredient.

Key words: stem cells, Salvia miltiorrhiza, Astragalus membranaceus, myocardial ischemia, cell

中图分类号:

R394.2

宋雪云，龙云，谭超，郑景辉. 黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6515-6520.

Song Xue-yun, Long Yun, Tan Chao, Zheng Jing-hui. Combination of tanshinone IIa and astragaloside induces bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into myocardium-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6515-6520.

图/表（结果） 4

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引言

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中除造血干细胞外的另一种干细胞，能够自我复制、自我更新并具有多向分化潜能。由于骨髓间充质干细胞具有取材方便、易于分离和体外培养扩增，免疫原性低，能分化为心肌细胞，内皮细胞和血管平滑肌细胞等多种终末细胞等诸多优势，成为治疗心脏疾患极有前景的种子细胞^[1-2]。因此，研究骨髓间充质干细胞在特定条件下定向分化为心肌样细胞对细胞移植治疗心肌梗死具有重要的理论及临床意义。近年有很多文献报道中药方剂有效部位群可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化^[3]，如养心通脉有效部位方、加味丹参饮、心复康等^[4-7]。中医药治疗此类疾病基本原则是益气养心、活血化瘀，代表方剂如加味丹参饮、养心通脉方等。丹参酮Ⅱa和黄芪甲苷正是这类方剂中的有效部位代表。中国传统中药丹参主要用于临床上冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗^[8]。丹参酮Ⅱa是丹参的脂溶性有效单体，具有抑制血小板聚集及平滑肌细胞增殖、抗氧化、扩张冠脉血管及抗炎作用，是一种天然的抗氧化药物。前期研究显示丹参酮Ⅱa与丹参注射液相比在控制心绞痛、改善脂肪代谢、扩张血管、对出凝血时间及凝血酶的影响都具有优势^[9-12]。同时近几年发现丹参酮Ⅱa对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用、能够抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡^[13]。在分子生物学水平发现其可以上调的NADPH氧化酶活性及亚单位p47 phox表达，通过上调miR-133水平抗心力衰竭心肌凋亡的^[14]，选择性的开放ATP敏感性K⁺通道，使细胞内的K⁺扩散到细胞外，导致电压依赖性钙通道关闭使膜超级化，至使胞内[Ca²⁺]i降低，最终产生血管舒张，而对SKCa、LKCa、KIR和KV通道均无作用^[15-16]，并且可以激活Wnt/β-catenin信号转导通路等。黄芪是用于防治心脑血管疾病的传统中药，黄芪甲苷是从黄芪中分离提纯的一种皂苷，实验研究发现，黄芪具有一定的抗心肌缺血、心肌保护作用。张川等^[17]研究证实黄芪甲苷除影响血管生成和发育基因外，还可促进心肌发育、细胞骨架蛋白α-actin基因表达和细胞收缩功能的基因上调，从而能增强心肌的收缩力。柴丽娟等^[18]证实其可能通过上调与细胞增殖相关基因Hes1、Hes5、cyclinD1表达而诱导神经干细胞的增殖，但也可能调节与其他增殖通路有关。关凤英等^[19]证实黄芪甲苷通过诱导一氧化氮的生成对大鼠心肌缺血再灌注损伤产生保护作用，PKCε的激活可能是黄芪甲苷保护心肌细胞信号传导通路的组成部分。代表益气活血的这两个有效成分组合对骨髓间充质干细胞向心肌分化的影响如何？本实验对此展开研究。

材料方法

设计：体外细胞诱导分化实验。

时间及地点：于2010年10月至2012年6月在湖南中医药大学完成。

材料：

黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化实验的主要试剂与仪器：

动物：6-8周龄清洁级雄性SD大鼠10只，体质量(130±20) g，购自上海动物实验中心，动物许可证号：SCXK(沪)2009-0004。动物房温度25 ℃，湿度60%。大鼠实验中对动物的操作符合伦理学标准^[20]。

方法：

骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定：雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下快速取胫骨和股骨，抽吸DMEM液反复冲洗骨髓腔，收集细胞。加入含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基，反复吹打，细胞计数后以1×10¹² L^-¹浓度接种于底面积50 cm²培养瓶中，37 ℃、饱和湿度、含体积分数5%的CO₂孵育箱中培养。48 h后弃悬浮液，首次换液。以后每2 d换液1次，悬浮生长的造血细胞随换液被弃去，留下贴壁生长的骨髓间充质干细胞。约待细胞在瓶底融合基本达到80%左右，0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞。重复上述操作，反复传至P₃代^[21]。取第3代骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶消化后配制成细胞悬液，1%BSA封闭液10 min，PBS洗涤3次，加入FITC荧光标记的抗CD11b、CD45、CD90抗体(1∶1 000) 0.5 mL，对照组加PBS，4 ℃孵育30 min，1 500 r/min离心5 min，PBS冲洗3次，以10 g/L多聚甲醛固定，采用FACScan流式细胞仪检查细胞表面抗原。以CD45，CD11b阳性率低于5%，CD90阳性率高于95%鉴定所得细胞为高纯度的骨髓间充质干细胞^[22]。

实验药品对骨髓间充质干细胞的无毒剂量：取对数生长期的第4代骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶消化后成细胞悬液，调整细胞浓度至1×10⁷ L^-¹，加入96孔板，每孔0.2 mL，37 ℃、饱和湿度、含体积分数5%的CO₂孵育箱中诱导培养液孵育24 h后，去培养液及未贴壁的细胞。实验组分别加入终浓度含补阳还五汤有效部位方为10，5，2.5，1.25，0.625，0.312，0.156，0.078，0.039，0.019，0.01 g/L(pH 7.2-7.4)的诱导培养液各20 µL，然后加入体积分数10%的胎牛血清培养液180 µL，细胞对照孔不加药物，只加200 µL细胞培养液，并设空白对照。每个浓度设4个复孔。在37 ℃、饱和湿度、含体积分数5%的CO₂孵育箱中培养分别培养72 h后，加入5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，上酶标仪在570 nm处检测吸光度(A)值。用统计学软件SPSS 13.0对所测A值进行显著性检验，最后取4个平行孔的平均值，计算细胞破坏百分率。选取细胞破坏率小于5%的药物浓度为该药的无毒剂量。

丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷对骨髓间充质干细胞的诱导分化：将传至第4代的骨髓间充质干细胞进行实验。实验分5组：①黄芪甲苷+丹参酮Ⅱa组：骨髓间充质干细胞培养液中加入黄芪甲苷和丹参酮Ⅱa二者最大无毒浓度的半数量混合。②丹参酮Ⅱa组：大鼠骨髓间充质干细胞：培养液中加入丹参酮Ⅱa最大无毒浓度。③黄芪甲苷组：大鼠骨髓间充质干细胞培养液中加入黄芪甲苷最大无毒浓度。④5-氮胞苷组：大鼠骨髓间充质干细胞培养液中加入10 μmol/L 5-氮胞苷^[24]。⑤正常对照组：大鼠骨髓间充质干细胞培养液中加入含10%胎牛血清DMEM。5组均置培养箱中孵育24 h后，去掉各组的培养液，以DMEM培养基洗涤2次，再按上述培养条件继续培养，每3 d换液1次。诱导分化72 h后，分别取出各组骨髓间充质干细胞，用ELISA方法作心肌样细胞的鉴定，测定肌钙蛋白和缝隙连接蛋白43水平。

主要观察指标：

ELISA方法测定肌钙蛋白和缝隙连接蛋白43表达：按试剂盒说明书操作，细胞诱导结束后，裂解，离心，取上清，除空白孔外，加入生物素化肌钙蛋白和缝隙连接蛋白43抗体工作液37 ℃孵箱孵育30 min。加入酶结合物工作液37 ℃箱孵育30 min。加入底物显色剂，37 ℃孵箱孵育15 min。加入终止液50 µL，混匀后即刻测量A值(5 min之内)，绘制标准曲线，读取数据。

统计学分析：统计学处理者为宋雪云、郑景辉，连续变量以x(_)±s表示，多组数据采用单因素方差分析，方差齐性检验和正态分布评估后进行方差分析，组间两两比较用LSD法检验，当P < 0.05时，差异有显著性意义。所有数据使用SPSS 17.0软件进行统计分析。

讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌梗死等缺血性心脏病导致心肌细胞的坏死，而心肌细胞为终末不可再分化细胞，组织只能通过瘢痕形成来替代修复，以至发生顽固心力衰竭乃至死亡并伴有大量炎症细胞浸润和瘢痕组织生成。近几年发展起来的心脏移植却是费用高昂、心脏供体难得及免疫排异反应需终生服用昂贵的药物，以致临床应用受限。Wakitani等^[25]在上世纪末首次发现大鼠的骨髓间充质干细胞，当在培养基中加入5-氮胞苷后，可见有心肌细胞样超微结构，有心肌细胞特异性基因表达，并观察到细胞动作电位。近几年国内很多学者研究证明中药或中药提取成分也能有效地诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化^[26-29]。

丹参酮Ⅱa是从丹参中提取的脂溶性有效活性成分，这种脂质结构对由脂质双层结构的细胞膜具有较好的穿透性和亲和性。在作者的研究中，丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞以后，表达相关的心肌蛋白，提示丹参酮Ⅱa在体外细胞培养的环境中，作为第一信使直接与细胞膜上的锚定分子结合能力增强，激活相关的信号转导通路从而使细胞向心肌方向转化。许多研究表明，干细胞修复的过程是首先先寡集并停留在受损心脏的缺血部位^[30]。也说明在这些受损组织中可能会表达一些特异性的受体或者配体，释放相关信号动员骨髓间充质干细胞向受损部位的趋化、黏附和浸润^[31]，直至归巢为心肌组织。其中基质细胞衍生因子1在干细胞的募集过程中起到了关键作用^[32-33]。上调的基质细胞衍生因子1/CXCR4通路是一个增加干细胞在受损组织的植入数量，促进心功能恢复的重要途径。当然这样的黏附因子趋化因子及信号转导通路已知的还有很多。具体丹参酮Ⅱa作用于细胞膜后激活的通路等还有待于当前各种组学的研究来探明，并且进一步研究信号转导通路的串扰也是很大的课题。黄芪甲苷属于溶解惰性物质，口服吸收差，而黄芪传统上多为口服用药。研究表明大部分糖苷类天然产物口服后经肠道菌群的代谢转化，其代谢产物吸收入血发挥药理作用^[34-36]。在黄芪甲苷活性体内代谢产物的研究过程中发现环黄芪醇-6-O-β-D-葡萄糖苷为黄芪甲苷的主要代谢产物之一^[37]。本实验中以黄芪甲苷作用于骨髓间充质干细胞，调高其作用的浓度，当然是在无毒浓度范围之内。这种药量的增加使得骨髓间充质干细胞表达相关的心肌功能和机构蛋白。对于黄芪甲苷的前期研究显示，对大鼠心肌基因表达谱的影响72个上调基因，其中39个基因生物学特性明确^[17]。经基因功能分析，黄芪甲苷对血管发育功能的影响最大；其次是对心肌发育功能和与细胞骨架表达及细胞收缩相关功能有影响。提示黄芪甲苷对促进血管和心肌发育、增强心肌功能等基因上调的作用最为明显。这项研究是不是提示黄芪甲苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化也是通过这些基因的表达来实现的。

肌钙蛋白T是肌钙蛋白的原肌球蛋白的黏合亚型，由于肌钙蛋白T在心肌与骨骼肌上的氨基酸排列顺序是不相同的，因而免疫方面也有很大的区别，是鉴定心肌细胞比较特异性的蛋白^[38-39]。因此，作者这次实验选其作为鉴定骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的重要检测指标。结果显示白丹参酮Ⅱa+黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷各组均表达肌钙蛋白T，说明骨髓间充质干细胞在特定的诱导环境下启动向心肌方向转化的机制，表达心肌的结构蛋白。尤其丹参酮Ⅱa和黄芪甲苷联合组高于单一药物组，且其差异与5-氮胞苷无显著性意义，说明两者联合诱导效果优于单一成分，体现了中药配伍多因多效多靶点的效应。

心肌细胞间通过缝隙连接蛋白的六聚体偶联在一起，在电反应中形成整体。所以心肌细胞间缝隙连接蛋白43是本实验的另一个重要的检测指标^[40-41]。本实验结果发现，丹参酮Ⅱa和黄芪甲苷联合组高于单一药物组，但是差异与5-氮胞苷比较表达较低，说明两者联合诱导效果由于使用单一药物诱导。

中医药治疗此类疾病基本原则是益气养心、活血化瘀，代表方剂如加味丹参饮、养心通脉方等。丹参酮Ⅱa和黄芪甲苷正是这类方剂中的有效部位代表。前期很多文献研究表明丹参的有效成分丹参酮Ⅱa、黄芪的有效成分黄芪甲苷分别能够定向诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞，免疫组织化学鉴定和心肌特异性抗体肌钙蛋白I表达阳性，且诱导率与5-氮胞苷比较差异无显著性意义。为进一步研究两个有效部位群(丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷)的联合效应，这次实验设立5组(黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa组、丹参酮Ⅱa+黄芪甲苷组、5-氮胞苷组、空白对照组)进行比较，并用ELISA鉴定经过诱导后的骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43、心肌特异性表达蛋白，从而得出丹参酮Ⅱa联合黄芪甲苷诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用最强。

至于丹参酮Ⅱa和黄芪甲苷联合作用疗效优于单独使用，是作用不同的细胞膜靶点候，激活相关的信号转到通路后发生信号的串扰，增强了对骨髓间充质干细胞转录的表达，从而翻译相关的蛋白增多。具体信号作用的途径和干扰的方式需要更进一步的明确。但这这是说明了中医药作用特点“多因、多效、多靶点、级联反应”^[42]，也体现了中医药传统方剂组方的合理性及值得挖掘的价值。这无疑为中医药治疗心肌梗死提供理论依据，为进一步研究加味丹参饮的作用机制打下基础。

这次研究中只是使用了其中较为研究成熟的丹参酮Ⅱa和黄芪甲苷，是不是还有其他成分的协同作用，值得进一步探讨。另外本文是在体外环境对骨髓间充质干细胞进行干预，其在体内对骨髓间充质干细胞向心肌方向分化的作用及其具体机制值得进一步探讨。

黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

Combination of tanshinone IIa and astragaloside induces bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into myocardium-like cells

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