自体骨髓间充质干细胞肝动脉移植治疗失代偿期肝硬化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6455-6461.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.012

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自体骨髓间充质干细胞肝动脉移植治疗失代偿期肝硬化

欧阳石¹，刘树人¹，程涛¹，陈阳述¹，孔祥平¹，周赤龙¹，穆良静²

¹解放军458医院全军肝病中心感染内科，广东省广州市 510602；²解放军广州军区联勤部第21分部卫生所，广东省广州市 510055

收稿日期:2012-12-06 修回日期:2012-12-25 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
作者简介:欧阳石★，女，1979年生，湖南省新化市人，汉族，2005年解放军第一军医大学毕业，硕士，主治医师，主要从事病毒性肝炎及终末期肝病研究。 ouyangshi2005@163.com
基金资助:
总后勤部卫生部科研专项2009年174号“肝干细胞的基础与临床应用研究”*

Hepatic arterial transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in treatment of decompensated liver cirrhosis

Ouyang Shi¹, Liu Shu-ren¹, Cheng Tao¹, Chen Yang-shu¹, Kong Xiang-ping¹, Zhou Chi-long¹, Mu Liang-jing²

¹Department of Infectious Diseases, Institute of Hepatology, the 458 Hospital of PLA, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China; ²Health Center, No. 21 Division, Department of Joint Logistics, Guangzhou Military Command Area of PLA, Guangzhou 510063, Guangdong Province, China

Received:2012-12-06 Revised:2012-12-25 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
About author:Ouyang Shi★, Master, Attending physician, Department of Infectious Diseases, Institute of Hepatology, the 458 Hospital of PLA, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China ouyangshi2005@163.com
Supported by:
Science and Technology Project of the State Health Ministry of General Logistics Department, No. 2009-174*

摘要/Abstract

摘要：

背景：国内外研究均表明自体骨髓干细胞对失代偿期肝硬化具有一定治疗作用，但针对失代偿期乙肝肝硬化患者缺乏系统有对照的临床研究。
目的：观察自体骨髓间充质干细胞移植对乙肝肝硬化失代偿期患者的临床疗效及安全性。
方法：将67例乙肝肝硬化失代偿期患者按照是否同意进行干细胞移植治疗分为2组，对照组34例采用常规口服核苷类似物抗病毒并对症支持治疗；治疗组33例在对照组常规治疗基础上，行自体骨髓间充质干细胞经肝动脉移植。分别在治疗前、治疗后4，12，24周观察肝功指标、症状、体征以及不良反应情况，并行2组对比。
结果与结论：治疗后所有患者症状均有不同程度改善；至治疗后4周部分肝功指标指标均较治疗前有明显改善，治疗组谷丙转氨酶、凝血酶原活动度、胆碱酯酶水平与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；至治疗后12，24周，两组患者谷丙转氨酶、白蛋白、总胆红素、凝血酶原活动度、胆碱酯酶水平较治疗前均有显著改善(P < 0.05)，且在同一时间点2组相比，各项指标差异均有显著性意义(P < 0.05)。治疗后4，12，24周2组患者Child-Pugh计分及终末期肝病模型评分均有所下降，与治疗前相比差异有显著性意义；且同一时间点2组相比，差异有显著性意义。结果提示，在传统口服核苷类似物抗病毒等综合治疗乙肝肝硬化基础上联合自体骨髓间充质干细胞经肝动脉移植治疗失代偿期肝硬化，能更有效地改善肝功和凝血功能，患者症状好转，相对安全，风险较低。

关键词: 干细胞, 移植, 自体, 肝硬化, 肝炎, 乙型

Abstract:

BACKGROUND: Autologous bone marrow mesenchymal stem cells can treat decompensated liver cirrhosis, however, little evidence has addressed the controlled clinical research in hepatitis B patients with decompensated live cirrhosis.
OBJECTIVE: To evaluate the clinical efficacy and safety of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of hepatitis B with decompensated live cirrhosis.
METHODS: A total of 67 hepatitis B patients with decompensated live cirrhosis were divided into two groups according to their wishes to receive stem cell transplantation. The control group (34 patients) only received oral administration of nucleoside analog antivirus and supportive treatment. The treatment group (33 patients) received autologous bone marrow mesenchymal stem cells transplantation via hepatic artery plus antivirus and supportive treatment. The liver functional index, clinical signs and symptoms, adverse reactions were observed and compared at 4, 12, 24 weeks after treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: After treatment, all patients’ symptoms were improved to varying degrees. After 4 weeks of treatment, the liver functional indexes were all significantly improved compared with before treatment, the levels of alanme aminotransferase, cholinesterase and prothrombin activity in treatment group were significantly ameliorated compared with control group (P < 0.05). At 12 and 24 weeks of treatment, the alanme aminotransferase, albumin, total bilirubin, cholinesterase and prothrombin activity in control group and treatment group showed statistically significant differences compared with before treatment (P < 0.05). At the same time point, all the indicators in the treatment group were significantly ameliorated compared with control group (P < 0.05). The Child-pugh score and model for end-stage liver disease score declined at 4, 12, 24 weeks after treatment, showing significant differences compared with before treatment. The difference was also significant at the same time point between two groups. The treatment of nucleoside analogue antivirus combined with autologous bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on hepatitis B patients with decompensated liver cirrhosis is an effective method to improve liver function and blood coagulation function, with symptom improvement, safety and low risk.

Key words: stem cells, transplantation, autologous, liver cirrhosis, hepatitis B

中图分类号:

R394.2

欧阳石，刘树人，程涛，陈阳述，孔祥平，周赤龙，穆良静. 自体骨髓间充质干细胞肝动脉移植治疗失代偿期肝硬化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6455-6461.

Ouyang Shi, Liu Shu-ren, Cheng Tao, Chen Yang-shu, Kong Xiang-ping, Zhou Chi-long, Mu Liang-jing. Hepatic arterial transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in treatment of decompensated liver cirrhosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6455-6461.

图/表（结果） 5

2.1 参与者数量分析 采用意向性处理分析，治疗组与对照组均随访至治疗后48周，治疗组33例及对照组34例均进入结果分析，无脱落。

2.2 基线资料比较 2组患者在性别、年龄等基线资料方面差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

在治疗12周时，治疗组腹水和乏力纳差的改善率分别为40%和52%，显著高于对照组的26%和30%(P < 0.05)。至治疗24周，胸水、腹胀和乏力纳差的改善率分别为64%，70%和76%，显著高于对照组的46%，52%和59%(P < 0.01)；腹水和下肢浮肿的改善率分别为64%和67%，显著高于对照组的57%和50%(P < 0.05)。

2.4 肝功能变化 见表4。至治疗后第4周部分肝功指标(谷丙转氨酶、胆碱酯酶、凝血酶原活动度、白蛋白等)均较治疗前有明显改善，治疗组谷丙转氨酶、凝血酶原活动度、胆碱酯酶与对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)；至治疗后12，24周，两组患者肝功指标(谷丙转氨酶、白蛋白、总胆红素、凝血酶原活动度、胆碱酯酶)较治疗前均有显著改善(P < 0.05)，且在同一时间段治疗组与对照组相比，各项指标差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 Child-Pugh评分及终末期肝病模型评分变化 见表5。

治疗第4周，治疗组患者Child-Pugh计分及终末期肝病模型评分显著低于对照组(P < 0.05)；治疗12周，治疗组患者Child-Pugh计分及终末期肝病模型评显著低于对照组(P < 0.05)；至治疗24周，治疗组患者的Child-Pugh计分及终末期肝病模型评分亦显著低于对照组(P < 0.05)。

2.6 不良事件 33例患者骨髓干细胞采集、分离及肝内移植技术成功率为100%，术中及术后恶心8例，术后发热2例，未见外周血白细胞下降患者；14例股动脉穿刺点出血形成淤斑，骨髓穿刺部位淤斑2例，均经止血、对症支持治疗后好转；未发生与移植相关的严重并发症。

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引言

材料方法

设计：病例回顾性分析，非随机同期对照观察。

时间及地点：于2008年11月至2012年6月在解放军458医院肝病中心感染内科完成。

对象：2008年11月至2012年4月收治67例失代偿期乙肝肝硬化患者，男56例，女11例；年龄29-68岁，平均54.3岁。均为慢性乙型肝炎后肝硬化，Child-Pugh分级：B级23例，C级44例。上述患者治疗前均存在不同程度乏力、纳差、腹胀、胸腹水和下肢浮肿等临床症状和体征，经过影像学(腹部B超或CT、MRI)所有患者可明确诊断为肝硬化。术前实验室检查包括谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、白蛋白、凝血酶原活动度、胆碱酯酶。

本项目已通过医院器官移植伦理委员会审查批准，并在上级卫生部门备案。

诊断标准：符合《病毒性肝炎防治方案》(2010，北京)中失代偿期乙肝肝硬化的诊断标准者^[7]。

纳入标准：①失代偿期乙肝肝硬化患者：Child-Pugh B、C级。②已发生食管胃底静脉曲张破裂出血、肝性脑病、腹水等严重并发症患者。③对治疗方案均知情同意，且得到医院伦理委员会批准者。

排除标准：①<18岁及孕妇和哺乳期妇女。②终末期肝病模型评分>40分者。③合并细菌性腹膜炎或其他系统感染者。④心、肺、肾等重要脏器功能不全，不能配合治疗者。⑤治疗前化验凝血酶原活动度<20%或有严重出血倾向者。

方法：

分组治疗：所有治疗患者在知情同意的情况下，签定知情同意书。按照是否同意进行干细胞移植治疗分为2组，对照组34例行口服核苷类似物抗病毒、保肝、利尿等内科综合治疗，治疗组33例在对照组基础上，行自体骨髓间充质干细胞经肝动脉移植。2组患者在性别、年龄、病情、生化、Child-Pugh评分及终末期肝病模型评分方面差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性。

自体骨髓间充质干细胞移植治疗：

自体骨髓采集：在层流无菌治疗室内，选患者双侧髂后上棘为采髓点，常规消毒铺巾局麻后，16号骨髓穿刺针穿刺，共抽取骨髓60-100 mL，以4 000 U肝素抗凝，避免污染。

骨髓单个核细胞分离：采用本中心自行研发的专利技术^[8]，用密度梯度离心法分离出骨髓干细胞，每例患者提取的骨髓单个核细胞总数均在2×10⁸以上。

骨髓间充质干细胞培养及鉴定：骨髓单个核细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中，至于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱中培养，48 h后去除未贴附细胞，扩增细胞培养1周后，弃胎牛血清培养基，用生理盐水洗涤2次后，加入含体积分数10%自体血清的DMEM培养基，继续培养7 d后收集细胞，获得骨髓间充质干细胞，悬浮于5 mL肝素生理盐水中，含细胞数3.0×10⁶-5.0×10⁶个。行免疫组织化学染色鉴定示：CD34^-，CD45^-，CD90⁺，CD44⁺。

移植方法：在数字减影血管造影技术下经股动脉穿刺插管，置管于肝固有动脉进行造影，观察肝内血管情况及有无占位性病变，将待用的细胞悬液5 mL经左右肝动脉缓慢注入；术毕拔管，穿刺点加压包扎后返回病房，穿刺侧下肢固定6 h。

主要观察指标：①临床症状、体征及不良反应。②于治疗前及治疗后4，12，24周检测实验室指标：谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、白蛋白、凝血酶原活动度、胆碱酯酶。③于治疗前及治疗后4，12，24周行Child-Pugh评分及终末期肝病模型评分。

Child-Pugh分级标准是一种临床上常用的对肝硬化患者肝脏储备功能进行量化评估的分级标准。根据血清白蛋白、凝血酶原时间、总胆红素、腹水程度、肝性脑病等5项指标，依照病情严重程度分别记为1，2，3分，每例患者分值相加，5-6分为A级，7-9分为B级，10-15分为C级。

Child-Pugh分级的计分标准：

终末期肝病模型评分：确定4项实验室和临床指标：血清肌酐、总胆红素、INR和病因，由4项指标的回归系数组成死亡风险预测公式：终末期肝病模型评分= 9.6×In[肌酐(mg/dL)]+3.8×In[胆红素(mg/dL)]+11.2× In(国际标准化率)+6.4×病因(胆汁淤积性和酒精性肝硬化为0，病毒等其他原因肝硬化为1)，结果取整数。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，采用配对t 检验和两独立样本的t 检验，所有数据采用SPSS 13.0软件进行分析处理。

讨论

干细胞移植是将具有一定增殖能力和分化潜能的干细胞植入体内，以替代因退变、损伤、基因缺陷或自身免疫而受损的细胞，重构原组织器官的结构和功能，是器官移植的发展和改进，主要包括胚胎干细胞移植和骨髓干细胞移植两种。

胚胎干细胞移植在细胞治疗中具有较大的优势，但因胚胎干细胞来源困难、存在某些伦理问题，并且具有一定的致瘤性，短期内很难将其应用于临床。

骨髓干细胞主要包括造血干细胞和间充质干细胞。造血干细胞是所有血细胞的原始起源细胞。间充质干细胞属于中胚层的一类多能干细胞^[9]，是最具分化潜能的干细胞成分^[10-11]。间充质干细胞具有跨胚层多向分化潜能，在合适的分化条件下，可跨胚层分化为内胚层的干细胞样细胞、胆管细胞和血管内皮样细胞^[12-13]。骨髓间充质干细胞移植的优点：来源充足，易于获得；增殖能力强，体外能大量扩增，能满足细胞移植需要输入大量功能细胞的需求；具有较强的多向分化潜能，可根据需要在适宜的体内或体外条件下分化为各种细胞；患者可用骨髓间充质干细胞自体移植完全克服免疫排斥，从根本上解决细胞和器官移植面临的免疫排斥问题^[14-19]。因此与现有细胞和器官移植相比，自体骨髓干细胞移植具有不可比拟的优点。

自从实验中发现肝脏中有来源于骨髓的肝细胞以来，许多研究证实骨髓中的干细胞确实可以通过某种途径转移到肝脏^[20]，并转化为有功能的肝细胞，而且这种细胞的转化量似有随肝脏损伤的程度和时间的增加而增加的倾向^[21]。

目前关于骨髓干细胞在肝脏疾病中的治疗机制认识较少，部分学者推测当肝脏遇到损害时，它会向骨髓干细胞发出一系列求救信号^[22]，这些信号因子包括肝细胞生长因子、基质金属蛋白酶9和基质细胞衍生因子等，骨髓干细胞一旦感知这些从肝脏发出的信号，会不断产生并释放出来，然后再移向肝脏，在肝脏微环境的调节下分化为成熟的肝细胞，帮助修复受到损害的肝脏细胞或胆管细胞^[23-24]。同时移植的骨髓干细胞通过分泌细胞因子，刺激受体肝细胞再生，间接影响某些促胶原降解因子的表达，促进胶原和细胞外基质的降解，抑制肝脏炎性反应，抑制肝细胞凋亡^[25]，促进肝小叶结构的恢复^[26-27]，提高血清白蛋白水平^[28]。另外，骨髓间充质干细胞可影响肝星状细胞，或通过诱导凋亡减少其数量，或通过减少转化生长因子的分泌抑制肝星状细胞的激活，从而减少细胞外基质沉积，改善肝纤维化程度^[29-30]。多数动物实验证实，干细胞移植能减轻肝纤维化、改善肝生化指标及不同程度转化为肝细胞^[31]。Kuo等^[32]发现间充质干细胞经静脉移植可归巢到肝衰竭小鼠肝脏中，不仅可以分化为成熟的肝脏细胞，而且可以通过旁分泌作用促进肝细胞增殖，提高肝衰竭小鼠的存活率。很多体外实验也证实，骨髓间充质干细胞在合适的培养环境，经表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等细胞因子组合的诱导下，可向肝细胞样细胞分化^[33-38]。国外临床研究表明，晚期肝病、肝硬化患者可耐受骨髓干细胞治疗，且对肝脏功能的恢复有积极作用^[39-43]。日本学者经静脉移植5.2×10⁸骨髓单核细胞，治疗9例代偿期肝硬化患者，6个月后白蛋白明显升高，胆红素明显下降^[44]。近期国外研究还证明，集落刺激因子动员骨髓安全有效，动员后的骨髓干细胞能更好地达到治疗目的^[45-47]。国内姚鹏等^[48]对60例慢性重症肝病患者行自体骨髓干细胞经肝动脉移植后12周观察，获得令人鼓舞的效果：谷丙转氨酶、总胆红素等逐渐降低；白蛋白、凝血酶原活动度逐渐上升；患者体力、食欲等改善。从临床角度来看，骨髓干细胞移植具有极其诱人的临床应用价值^[49]。

但干细胞移植治疗慢性肝病的临床实验尚有许多缺陷，如病例数量较少，缺乏对照，无移植干细胞跟踪研究，观察时间较短及缺乏远期疗效和安全性分析等^[50-52]。且多数临床试验只观察了肝功损害的指标，对肝功能储备指标并无明确的监测、研究。

文章采取了自体骨髓间充质干细胞联合内科综合治疗的方案并设定对照组，进行严格的对照研究，并增加了胆碱酯酶等针对肝储备功能的监测。结果显示：①2组患者治疗后症状均有不同程度改善，且治疗后12，24周同期治疗组患者的临床症状及体征改善率较对照组有显著差异。②治疗组患者在自体干细胞治疗后第4周实验室指标开始出现改善，至第12周多项指标出现显著改善，两组患者至治疗12周及24周时谷丙转氨酶、白蛋白、凝血酶原活动度、总胆红素、胆碱酯酶与治疗前相比差异有显著性意义。以上各项指标在12周与24周同一时间段治疗组与对照组相比差异均有显著性意义。③从第4周开始，患者Child-Pugh分值及终末期肝病模型评分分值下降较为明显，到第12周和24周时与治疗前比差异有显著性意义，同一时段治疗组和对照组相比差异有显著性意义。④自体骨髓间充质干细胞经肝动脉移植后无明显不能耐受不良反应。表明在包括抗病毒在内的内科综合治疗的基础上联合自体骨髓间充质干细胞治疗可在更大程度上改善肝脏功能，且肝脏储备功能也得到增强，控制肝硬化的进展速度，改善提高肝硬化患者的生存质量，且自体骨髓间充质干细胞经肝动脉移植是安全可行的，不失为治疗乙肝肝硬化失代偿期的一种重要治疗手段。

但如何进一步规范自体骨髓间充质干细胞治疗方案，比如建立标准化、规范化干细胞体外扩增、诱导分化技术，以获得足够数量、满足临床治疗需要的移植材料等尚有待完善；移植的途径、部位以及植入细胞数量等都值得进一步研究探讨；自体骨髓间充质干细胞移植治疗要在临床上进一步广泛应用，还有很长的路要走。

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自从实验中发现肝脏中有来源于骨髓的肝细胞以来，许多研究证实骨髓中的干细胞确实可以通过某种途径转移到肝脏，并转化为有功能的肝细胞，而且这种细胞的转化量似有随肝脏损伤的程度和时间的增加而增加的倾向。目前关于骨髓干细胞在肝脏疾病中的治疗机制认识较少，部分学者推测当肝脏遇到损害时，它会向骨髓干细胞发出一系列求救信号，这些信号因子包括肝细胞生长因子、基质金属蛋白酶9和基质细胞衍生因子等，骨髓干细胞一旦感知这些从肝脏发出的信号，会不断产生并释放出来，然后再移向肝脏，在肝脏微环境的调节下分化为成熟的肝细胞，帮助修复受到损害的肝脏细胞或胆管细胞。同时移植的骨髓干细胞通过分泌细胞因子，刺激受体肝细胞再生，间接影响某些促胶原降解因子的表达，促进胶原和细胞外基质的降解，抑制肝脏炎性反应，抑制肝细胞凋亡，促进肝小叶结构的恢复，提高血清白蛋白水平。另外，骨髓间充质干细胞可影响肝星状细胞，或通过诱导凋亡减少其数量，或通过减少转化生长因子的分泌抑制肝星状细胞的激活，从而减少细胞外基质沉积．改善肝纤维化程度。多数动物实验证实，干细胞移植能减轻肝纤维化、改善肝生化指标及不同程度转化为肝细胞。Kuo等发现间充质干细胞经静脉移植可归巢到肝衰竭小鼠肝脏中，不仅可以分化为成熟的肝脏细胞，而且可以通过旁分泌作用促进肝细胞增殖，提高肝衰竭小鼠的存活率。很多体外实验也证实，骨髓间充质干细胞在合适的培养环境，经表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等细胞因子组合的诱导下，可向肝细胞样细胞分化。国外临床研究表明，晚期肝病、肝硬化患者可耐受骨髓干细胞治疗，且对肝脏功能的恢复有积极作用。日本学者经静脉移植5.2×10⁸骨髓单核细胞，治疗9例代偿期肝硬化患者，6个月后白蛋白明显升高，胆红素明显下降。近期国外研究还证明，集落刺激因子动员骨髓安全有效，动员后的骨髓干细胞能更好地达到治疗目的。国内姚等对60例慢性重症肝病患者行自体骨髓干细胞经肝动脉移植后12周观察，获得令人鼓舞的效果：谷丙转氨酶、总胆红素等逐渐降低；白蛋白、凝血酶原活动度逐渐上升；患者体力、食欲等改善。从临床角度来看，骨髓干细胞移植具有极其诱人的临床应用价值。

自体骨髓间充质干细胞肝动脉移植治疗失代偿期肝硬化

Hepatic arterial transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in treatment of decompensated liver cirrhosis

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