低频电磁场促进骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5819-5826.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.012

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低频电磁场促进骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究

冯玉¹，白文芳²，许伟成²，李新平²，白利明²，梁玲³，王鑫³，张鸣生²

1南方医科大学研究生学院，广东省广州市 510515
2广东省人民医院，广东省医学科学院，广东省老年医学研究所康复医学科，广东省广州市 510080
3暨南大学第一临床学院，广东省广州市 510630

收稿日期:2013-05-07 修回日期:2013-05-13 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
通讯作者: 张鸣生，博士，主任医师，教授，博士研究生导师，广东省人民医院，广东省医学科学院，广东省老年医学研究所康复医学科，广东省广州市510080 mszrch@163.com
作者简介:冯玉★，女，1987年生，山西省吕梁市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事神经康复学方面的研究。 fengyu567810@126.com
基金资助:
广东省自然科学基金(S2012010009308)。

Low-frequency electromagnetic fields enhance the recovery of spinal cord injured rats undergoing bone mesenchymal stem cell transplantation

Feng Yu¹, Bai Wen-fang², Xu Wei-cheng², Li Xin-ping², Bai Li-ming², Liang Ling³, Wang Xin³, Zhang Ming-sheng²

1Graduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
2Department of Rehabilitation Medicine, Guangdong General Hospital, Guangdong Provincial Institute of Geriatric Medicine, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
3the First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Received:2013-05-07 Revised:2013-05-13 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
Contact: Zhang Ming-sheng, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Rehabilitation Medicine, Guangdong General Hospital, Guangdong Provincial Institute of Geriatric Medicine, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China mszrch@163.com
About author:Feng Yu★, Studying for master’s degree, Graduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China fengyu567810@126.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2012010009308*

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤被视为一种有前途的治疗方法，如何更有效地促进骨髓间充质干细胞在脊髓损伤区存活，加速脊髓损伤肢体运动功能的恢复是目前研究的重点。前期研究发现，低频电磁场能够促进骨髓间充质干细胞的增殖分化，低频电磁场是否可应用于骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤还需进一步研究。
目的：探讨低频电磁场对移植骨髓间充质干细胞脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响。
方法：采用脊髓压迫法制备64只T10不完全性脊髓损伤大鼠模型，随机等分为对照组、骨髓间充质干细胞组、电磁场组和电磁场+骨髓间充质干细胞组。造模成功后，骨髓间充质干细胞组和电磁场+骨髓间充质干细胞组大鼠脊髓损伤原部位注射大鼠全贴壁法分离培养BrdU标记的骨髓间充质干细胞，对照组和电磁场组注射a-MEM培养液。造模术后24 h，电磁场组和电磁场+骨髓间充质干细胞组予60 min/d的低频电磁场刺激(频率50 Hz、强度5 mT)。
结果与结论：骨髓间充质干细胞移植后第21天，电磁场+骨髓间充质干细胞组BBB评分与其他组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，与其他各组比较，电磁场+骨髓间充质干细胞组移植细胞后，大鼠BrdU阳性细胞在脊髓损伤区域生长并与脊髓组织融合，存活细胞数量较其他组多；空洞面积小；损伤区胶质纤维酸性蛋白表达更少，而基质金属蛋白2表达更多；脊髓损伤大鼠下肢运动功能恢复最快(P < 0.05)。提示低频电磁场促进了移植骨髓间充质干细胞脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复，可能与低频电磁场有利于损伤区移植骨髓间充质干细胞的存活，上调基质金属蛋白2的表达并减少胶质瘢痕的形成有关。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 低频电磁场, 脊髓损伤, 骨髓间充质干细胞, 细胞移植, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation is considered as a promising therapy for spinal cord injury. How to more effectively promote the survival of bone marrow mesenchymal stem cells in the area of spinal cord injury and to accelerate the recovery of motor function after spinal cord injury is a current study focus. Previous studies have found that low-frequency electromagnetic fields can promote bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and differentiation, but whether the low-frequency electromagnetic fields can be applied to bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for treatment of spinal cord injury requires further studies.
OBJECTIVE: To discuss the effects of low-frequency electromagnetic fields on motor function of spinal cord injury rats after transplantation of bone mesenchymal stem cells.
METHODS: Sixty-four rat models of incomplete spinal cord injury at T10 were established by compression method and then randomized into control group, transplantation group (bone mesenchymal stem cell transplantation), electromagnetic field group and combination group (electromagnetic field+bone mesenchymal stem cell transplantation). After successful modeling, bone mesenchymal stem cells labeled with 5-bromo-2'-deoxyuridine were injected into the original injured site in the transplantation group and combination group, which were isolated and purified with the fast adherence method; while alpha-minimum essential medium was injected into the electromagnetic field group and control group for instead. At 24 hours post-operation, the electromagnetic field group and combination group were explored to low-frequency electromagnetic fields (frequency 50 Hz, magnetic indaction intensity 5 mT) for 60 minutes per day.
RESULTS AND CONCLUSION: After cell transplantation for 21 days, the Basso, Beattie, and Bresnahan scores in the combination group was higher than the other groups (P < 0.05). 5-Bromo-2'-deoxyuridine positive cells grew well, and integrated into the normal spine; syringomyelia was reduced, and the number of spinal neural cells was increased in the combination group. In addition, glial fibrillary acidic protein expression was decreased in the combination group, while matrix metalloproteinase 2 expression was increased. It indicates that low-frequency electromagnetic fields could promote recovery of motor function in the spinal cord injury rats transplanted with bone mesenchymal stem cells, which could be associated that low-frequency electromagnetic fields facilitate the survival of transplanted bone mesenchymal stem cells, up-regulate the expression of matrix metalloproteinase 2, and reduce glial scar formation in the spinal cord injured site.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, low-frequency electromagnetic fields, spinal cord injury, bone mesenchymal stem cells, cell transplantation, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

冯玉，白文芳，许伟成，李新平，白利明，梁玲，王鑫，张鸣生 . 低频电磁场促进骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5819-5826.

Feng Yu, Bai Wen-fang, Xu Wei-cheng, Li Xin-ping, Bai Li-ming, Liang Ling, Wang Xin, Zhang Ming-sheng . Low-frequency electromagnetic fields enhance the recovery of spinal cord injured rats undergoing bone mesenchymal stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5819-5826.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 在实验过程中，对照组、骨髓间充质干细胞组、电磁场组和电磁场+骨髓间充质干细胞组脊髓损伤大鼠在手术初期都不同程度的出现了神经损伤症状，手术当天BBB评分全部为0-2分，且有20只大鼠出现了血尿、乳糜尿。

在3周的观察期内，脊髓损伤对照组4只大鼠死亡，骨髓间充质干细胞组死亡7只，电磁场组死亡3只，电磁场+骨髓间充质干细胞组死亡6只。为保证实验例数，都已实时采用差额补充法补齐。

最终对照组、骨髓间充质干细胞组、电磁场组和电磁场+骨髓间充质干细胞组各16只大鼠进入结果分析。

2.2 骨髓间充质干细胞的形态 倒置相差显微镜下观察到骨髓间充质干细胞培养3 d时，细胞贴壁开始增殖，并向三角形、多角形、梭形等分化，见图1A。传代培养的第3代骨髓间充质干细胞均匀分布于瓶底，形态重新为长梭形成纤维细胞样，生长潜伏期较短，见图1B。

2.3 免疫组化方法检测移植的骨髓间充质干细胞 如图2所示，组织切片为造模后第7天的免疫组化结果，大部分视野可见胞核为蓝色的细胞，即原脊髓组织中的神经细胞或者为炎症细胞，而在部分视野中可见胞核呈棕黄色的细胞，说明是移植的骨髓间充质干细胞，即BrdU和苏木精双染的结果。
2.4 脊髓损伤组织病理形态学观察 造模后第3天各组大鼠损伤脊髓组织结构紊乱，局部有出血、水肿和坏死细胞形成。

第7天，对照组和电磁场组脊髓组织结构破坏严重，损伤区有较多坏死液化吸收后形成的囊性空洞，神经细胞明显减少且变性、肿胀较重，周围有炎性细胞浸润，组织进一步肿胀，血流减少；骨髓间充质干细胞组和电磁场+骨髓间充质干细胞组损伤区囊性空洞面积较小、肿胀稍减轻，可见肥大的巨噬细胞和胶质细胞等，组织结构仍比较模糊。随着时间变化，如图3A-H所示，各组脊髓组织结构逐渐改善，第14天，除了对照组外，其他3组囊性空洞几乎闭合，被其它细胞组织所代替填充，骨髓间充质干细胞组组织水肿消失，仅有少量炎细胞浸润，电磁场+骨髓间充质干细胞组脊髓损伤结构已大部分修复，细胞排列有序，炎细胞基本消失。造模后第21天，除对照组外，其他各组损伤脊髓组织结构基本修复。

2.5 电磁场促进骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠损伤脊髓中BrdU阳性细胞的生长及基质金属蛋白2的表达 免疫组化染色显示，对照组在脊髓损伤14 d和21 d脊髓损伤区见大量的胶质纤维酸性蛋白的表达；电磁场组和骨髓间充质干细胞组大鼠损伤脊髓中可见中等量胶质纤维酸性蛋白表达分布于损伤区周围；电磁场+骨髓间充质干细胞组大鼠损伤脊髓中胶质纤维酸性蛋白的表达最少，表明损伤局部胶质瘢痕组织最少，见图4A-D。

骨髓间充质干细胞组和电磁场+骨髓间充质干细胞组在脊髓损伤后7 d，大鼠损伤脊髓局部组织基质金属蛋白2的表达量开始升高，14 d 最明显，见图4E-H。脊髓损伤后3-21 d，骨髓间充质干细胞组和电磁场+骨髓间充质干细胞组大鼠损伤脊髓组织中都可观察到BrdU阳性细胞，并与组织融合生长，电磁场+骨髓间充质干细胞组大鼠损伤脊髓中BrdU阳性细胞生长情况较好，对照组和电磁场组脊髓损伤部位未发现BrdU阳性细胞。

2.6 电磁场促进骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠行为能力的改善 脊髓损伤3 d后，各组大鼠BBB 评分差异无显著性意义(F=1.941，P=0.177)，后肢运动功能恢复均不理想。

7 d后，各组BBB评分均有提高，电磁场+骨髓间充质干细胞组最高，骨髓间充质干细胞组次之，随之为电磁场组，对照组稍微改善，4组大鼠BBB评分差异有显著性意义(F=13.918，P=0.000)，但对照组与电磁场组之间BBB评分差异无显著性意义(P=0.240)，骨髓间充质干细胞组和电磁场+骨髓间充质干细胞组之间BBB评分差异无显著性意义(P=0.472)；骨髓间充质干细胞移植后14 d，趋势同7 d，但除了骨髓间充质干细胞组和电磁场+骨髓间充质干细胞组之间BBB评分差异无显著性意义(P=0.258)外，其余各组之间差异都有显著性意义(P < 0.05)；术后第21天，评分趋势同14 d，且效果更加显著，尤其是电磁场+骨髓间充质干细胞组，4组处理间BBB评分差异均有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

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引言

材料方法

设计：分组样本对比观察。

时间及地点：于2011年10月至2012年9月在广东省人民医院中心实验室和中山大学动物实验中心完成。

材料：

实验动物：64只健康成年SPF级雌性SD大鼠，鼠龄为7-9周，体质量220-250 g，分笼颗粒饲料饲养，自由饮水。动物房室温(22±1) ℃，光照与黑夜时间为 12 h更替。

实验动物由中山大学医学院动物中心提供，许可证号：SCSK[粤]2011-0029，实验符合动物伦理学要求。

主要仪器：电磁场发生器由暨南大学物理系定制，由波形发生器、功率放大器和线圈三部分组成，可产生稳恒、正弦和方波磁场。正弦磁场的磁场强度可调范围：0-20 mT，线圈高度H=40 mm，线圈距离D= 60 mm，内径=100 mm，外径=300 mm，线圈匝数N=200匝，线圈半径R = 70 mm。磁场发生器的线圈部分采用Helmholtz线圈，能够获得相对均匀的磁场。当两线圈的距离约为线圈半径时，两线圈中心轴线的理论磁场强度为：

B；当测量点在两线圈的中心点时，磁场强度为B₀。其中，B为线圈轴线磁感应强度，R为Helmholtz线圈半径，d为线圈的中心距离，χ_i为测量点到线圈中心点的距离，n(N)为单个线圈匝数，I为通过线圈的电流值，μ₀为真空磁导率(μ₀=4π×10^-⁷ N/A²)。其特点是不同于常用的利用瞬间的高电压通过非常大的电流而短时间内产生高强度磁场的脉冲磁疗仪，此设备会产生相应波形的磁场，属于长时间的励磁，不会产生过大的电流而导致线圈发热严重甚至烧毁。
骨髓间充质干细胞移植治疗使用的其他试剂及仪器：

实验方法：

脊髓损伤大鼠模型的制备：将实验大鼠腹腔注射安定 5 mg/kg和氯胺酮50 mg/kg麻醉后俯卧位固定，于T₉_-₁₁椎骨背部处备皮，常规消毒，以T₁₀棘突为中心行正中纵向切口，依次切开皮肤、皮下组织，分离两侧肌肉，暴露T₉_-₁₁棘突和椎板。切除T₉_-₁₁棘突和两侧椎板，暴露硬脊膜，以T₁₀相对区域为损伤区，后正中血管为中心定位。使用自制的质量为100 g，接触直径为2.0 mm的有机玻璃杆压迫，造成脊髓压迫伤，3 min后移去。以压迫后立即出现一过性鼠尾痉挛性摆动和双下肢抽动及术后1 h麻醉清醒后BBB评分为0-2分视为造模成功。冲洗伤口后，缝合手术切口。术后常规人工排尿，每天两三次，直至恢复自主膀胱，青霉素2×10⁵ U连用3 d，预防感染^[11]。

实验动物分组：64只大鼠随机分成对照组、骨髓间充质干细胞组、电磁场组和电磁场+骨髓间充质干细胞组，每组16只大鼠。

骨髓间充质干细胞的培养、鉴定、标记和移植：采用全贴壁法培养骨髓间充质干细胞^[12]，取长满瓶底的P3细胞^[11]，加入10 g/L的BrdU(终浓度为10 mg/L^[13])置37 ℃孵育24 h。移植前30 min，先用PBS漂洗，消化后离心收集细胞，无血清的α-MEM重悬，配成1.5×10⁹ L^-¹的细胞悬液置于冰浴中1 h内进行细胞移植。脊髓损伤后30 min内，骨髓间充质干细胞组和电磁场+骨髓间充质干细胞组大鼠用微量注射器接无菌玻璃拉丝针头将骨髓间充质干细胞悬液缓慢注入到距脊髓损伤区头尾侧各1.0 mm，距中线0.5 mm的脊髓实质内^[14]。每点50 μL，每只动物移植的细胞总数共1.5×10⁵个，注射时间5-10 min，为防止细胞倒流留针5 min。对照组和电磁场组每点注射50 μL α-MEM培养液。

低频电磁场干预：脊髓损伤24 h后，将电磁场组和电磁场+骨髓间充质干细胞组大鼠置于专用固定盒内，呈俯卧位，大鼠至于间距为10 cm的2个电磁场电极之间，频率为50 Hz，强度为5 mT，60 min/d，1次/d。对照组和骨髓间充质干细胞组大鼠不打开电磁场。

行为学评价：造模前及造模后3，7，14和21 d，每个时间点检测16只大鼠，将各组大鼠置于90 cm× 120 cm开放空间内，采用BBB运动评分标准，双人、双盲进行大鼠双后肢运动功能观察和评分，取双人评分均值。

取材：分别于造模后3，7，14和21 d，每组各取4只大鼠行心脏灌注。先以生理盐水200-250 mL冲灌，再换冷的40 g/L多聚甲醛100 mL灌流固定。切取损伤节段头尾长约0.8 cm的脊髓制成标本，行OCT包埋，切片，冠状面和矢状面连续切片，切片厚度为5 μm。

苏木精-伊红染色观察大鼠脊髓组织的病理变化：取大鼠病理切片，行苏木精-伊红染色，即-20 ℃冰箱取出冰冻切片，室温晾干，苏木精染色5 min，清水轻轻洗去，体积分数1% HCl分化1 s，清水中返蓝15-30 min，搽拭干净，伊红染色30 s，75%乙醇脱水1.0-2.0 s，体积分数100%乙醇脱水2 min/2次，晾干，二甲苯4.0-5.0 s/ 2次，晾干，中性树脂封固，在倒置显微镜下观察拍照，观察各组大鼠脊髓组织的病理变化。

免疫组化方法检测移植的骨髓间充质干细胞：-20 ℃冰箱取出冰冻切片，室温晾干，冷PBS冲洗3次后，体积分数3% H₂O₂去离子水，37 ℃孵育15-20 min，以消除内源性过氧化物酶活性；冷PBS冲洗3次，山羊血清室温封闭15-20 min，倾去，勿洗；滴加一抗兔抗大鼠BrdU多克隆抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜。冷PBS冲洗3次，滴加生物素化二抗，室温孵育15-20 min；冷PBS冲洗3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15- 20 min；冷PBS冲洗3次，滴加DAB显色剂，置于显微镜下观察，3-5 min后有棕色结构出现，立即自来水冲洗。室温晾干，苏木精染色5 min，清水轻轻洗去，体积分数1% HCl分化1 s，清水中返蓝15-30 min，体积分数75%乙醇脱水1.0-2.0 s，体积分数100%乙醇脱水 2 min/2次，晾干，二甲苯4.0-5.0 s/2次，晾干，中性树脂封固。

免疫荧光染色：-20 ℃冰箱取出冰冻切片，室温晾干，冷PBS冲洗3次后，0.3% Triton X-100室温透化20 min；冷PBS冲洗3次，山羊血清室温封闭20 min，甩干勿洗；滴加一抗兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白、基质金属蛋白2和BrdU多克隆抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜；冷PBS反复冲洗3次，滴加FITC标记的羊抗兔IgG荧光二抗，室温避光孵育60 min；冷PBS冲洗3次，DAPI核染室温孵育15 min，冷PBS冲洗3次后封固，在共聚焦显微镜观察拍照。

主要观察指标：移植骨髓间充质干细胞的脊髓损伤大鼠在低频电磁场作用下后肢的运动情况和脊髓组织的病理学变化。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料结果以x(_)±s表示，BBB评分采用重复测量数据的方差分析，各时间点数据组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验中采用了脊髓压迫损伤模型，模拟了临床上常见的闭合性脊髓压缩伤^[15]。该模型不仅避免了经典Takahashi模型的非直线性压力改变^[16]；而且容易控制、重复性好、简单经济，可以广泛应用于基础研究。虽然骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的方式包括直接移植法、经脑脊液注入法和经静脉注入法^[1]，但由于后两者操作是否能够有效将干细胞透过血脑屏障尚存在争议，因此目前作者采用了直接注射法。

成年脊髓创伤性损伤会导致损伤区急性神经细胞死亡，引发一系列事件导致额外的组织损伤以及囊性空洞的形成^[17]。移植干细胞被认为是修复脊髓损伤极有希望的方法^[18]。骨髓间充质干细胞是脊髓损伤修复中干细胞移植的候选者之一^[19-²⁶^]。该细胞分泌生长因子支持修复，抑制脊髓损伤后组织的丢失^[^27-29^]。大量研究证实骨髓间充质干细胞移植能够促进不同类型脊髓损伤模型实验动物的运动功能恢复，但脊髓损伤后，在损伤区形成细胞毒性环境会降低损伤区移植的细胞存活数，减弱其修复作用。因此，如何促进移植的骨髓间充质干细胞在损伤脊髓组织中的存活并提高其修复脊髓的作用需要进一步研究。

近年来随着低频电磁场研究的开展，低频电磁场对人类的作用越来越引起大众的关注。尤其是非侵入性、经济和不影响其他治疗方法的特点^[6]，使低频电磁场成为当今神经损伤修复、细胞治疗基础和临床研究的热点之一。有研究发现，每天4 h脉冲电磁场连续12周刺激猫脊髓损伤模型可以明显改善其运动功能^[10]。在体外脉冲电磁场可以促进背根神经节神经突的延长并影响其定向生长^[3⁰^]。这些都表明电磁场可能有助于脊髓损伤的治疗。

实验BBB评分结果显示，在脊髓损伤后第1-3周，电磁场+骨髓间充质干细胞组评分最高，说明该组脊髓功能恢复最好，提示低频电磁场可能促进了移植骨髓间充质干细胞脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。与该结果一致的是脊髓损伤后组织病理学变化情况，即电磁场+骨髓间充质干细胞组脊髓囊性空洞小，范围局限；神经细胞肿胀轻、数目多，结构清晰，BrdU阳性细胞更多，胶质瘢痕形成范围更小，表明低频电磁场可能改善了脊髓损伤区的环境，促进了移植细胞的存活，减少了胶质疤痕的形成，从而加速了脊髓损伤后运动功能的恢复。

脊髓损伤修复是一个动态、复杂的事件，涉及多个病理生理过程。以往多集中在骨髓间充质干细胞在损伤脊髓内的存活、迁移和分化方面的研究^[3^1-36-^]，而对骨髓间充质干细胞促进脊髓损伤后运动功能恢复的机制研究较少。基质金属蛋白属于内肽酶家族成员，是介导中枢神经系统损伤和修复的一类蛋白水解酶，参与细胞生长发育、炎症和损伤修复相关的病理生理过程^[³⁷^]。在脑和脊髓损伤后，基质金属蛋白既参与破坏血脑/脊髓屏障、促进炎症、氧化应激和脱髓鞘作用的早期病理过程^[³⁸^]；也参与中枢神经系统损伤后轴突再生和突触可塑性调节的后期修复过程^[³⁹^]。越来越多的证据显示基质金属蛋白2在脊髓损伤后的继发病理过程中扮演着重要的角色，影响脊髓损伤后胶质瘢痕形成^[⁴⁰^]。与野生型大鼠相比，基质金属蛋白2基因敲除鼠脊髓损伤后伤口较难愈合^[4¹^]，原因是发现有大量的抑制剂——胶质瘢痕形成。在Veeravalli等^[4²^]实验中，脊髓损伤后21 d内，对照组基质金属蛋白2没有显著增加，而在骨髓间充质干细胞移植组，损伤后第21天基质金属蛋白2的量急剧增加，胶质纤维酸性蛋白量减少，运动功能得到极大提高，说明骨髓间充质干细胞通过上调基质金属蛋白2的水平来调节胶质瘢痕的形成从而促进脊髓损伤的修复。而在本实验的免疫荧光结果中也显示，脊髓损伤后14 d，骨髓间充质干细胞组和电磁场+骨髓间充质干细胞组基质金属蛋白2的表达量都有增加，胶质纤维酸性蛋白蛋白相应减少，其中电磁场+骨髓间充质干细胞组变化较明显，表明低频电磁场可能增强了损伤区移植的骨髓间充质干细胞上调基质金属蛋白2减少胶质瘢痕生成的作用。

大量研究显示移植骨髓间充质干细胞可以促进脊髓损伤功能的恢复，然而，据报道受损中枢神经系统移植的骨髓间充质干细胞存活率只有10%左右，且几乎没有骨髓间充质干细胞分化为成熟的神经细胞^[43]。所以如何更加有效的提高骨髓间充质干细胞的存活率是目前的研究方向之一。体外实验发现低频电磁场可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化^[44-46]，作者所在课题组也初步观察到低频电磁场有助于骨髓间充质干细胞体外向功能性神经元分化^[47]，但是低频电磁场是否因影响脊髓损伤后移植的骨髓间充质干细胞的增殖分化能力，从而促进移植骨髓间充质干细胞脊髓损伤大鼠运动功能的恢复，国内外尚未见相关报道，今后将加大这方面的研究。实验结果显示电磁场+骨髓间充质干细胞组BrdU阳性细胞生长情况较骨髓间充质干细胞组好，低频电磁场促进了移植骨髓间充质干细胞脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复，可能与低频电磁场有利于损伤区移植骨髓间充质干细胞的存活，上调基质金属蛋白2的表达并减少胶质瘢痕的形成有关。但低频电磁场是否有助于骨髓间充质干细胞体内向功能性神经细胞分化还有待进一步研究。

低频电磁场促进骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究

Low-frequency electromagnetic fields enhance the recovery of spinal cord injured rats undergoing bone mesenchymal stem cell transplantation

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