设计:动物实验观察。
时间及地点:实验于2011年9月至2012年3月在山西医科大学中心实验室完成。
材料:
实验动物:健康1周龄Balb/c-nu裸鼠,雄性,共20只,体质量15 g左右,购于中国医学科学院实验动物研究所,合格证号:SCXK(京)2008-0013,由山西医科大学动物中心饲养,对动物处置符合科技部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。
骨髓间充质干细胞对A549肺腺癌组织修复实验的主要试剂:
实验方法:
人骨髓间充质干细胞的分离培养:骨髓取自健康成年志愿者(医院体检者),签订知情同意书后于右侧髂前上嵴行骨髓穿刺抽取骨髓10 mL置于抗凝管中。全骨髓贴壁法:骨髓置于离心管中加入15 mL红细胞裂解液,作用10 min,1 000 r/min,离心半径11.5 cm,离心5 min,弃去上层清液,收集沉淀,加入无血清培养基离心洗涤两三次,重悬细胞,加入含体积分数20%胎牛血清的L-DMEM培养基,调整细胞浓度为2×108 L-1接种于 25 cm2培养瓶中,加含体积分数20%胎牛血清的L-DMEM培养基4.0-5.0 mL,CO2细胞培养箱中48 h后第一次换液,弃去未贴壁细胞。此后两三天换液1次。原代培养10-15 d后人骨髓间充质干细胞融合达到80%-90%时进行首次传代,以1∶2转入培养瓶中继续培养,两三天后贴壁生长达80%-90%再次传代,如此即可达到人骨髓间充质干细胞的纯化和扩增。
人骨髓间充质干细胞的表型鉴定:第3代人骨髓间充质干细胞离心垂悬,制成1×108 L-1的细胞悬液。各取100 μL于试管中,分别加入MouseIgG-1、IgG-2、CD34、CD44、CD45、CD71各表型抗体10 μL;避光孵育15 min,PBS洗涤,加入20 g/L多聚甲醛固定液重悬,流式细胞仪检测。数据分析采用Cell-Quest软件。
荷瘤裸鼠肿瘤模型制造:20只裸鼠采用细胞接种的方法,A549肺癌细胞悬液以1×106裸鼠腋窝皮下接种,1周后可触及肿瘤结节,4周后肿瘤结节直径达5 mm左右,质硬,活动度可。随机将16只造模成功的裸鼠随机数字表法均分成实验组和对照组。
骨髓间充质干细胞瘤周注射:取对数生长期的骨髓间充质干细胞,使用不含血清的DMEM低糖培养基制成细胞悬液,每份100 μL,调整细胞浓度为1×106。实验组使用1 mL注射器进行肿瘤周围注射骨髓间充质干细胞,每3 d注射1次,共4周。对照组等量等时间的PBS瘤周注射。每天观察动物生活情况,每3 d测量肿瘤大小。
苏木精-伊红染色、Masson 三色染色法:4周后统一处死裸鼠,取下肿瘤组织,甲醛固定,石蜡包埋制成切片,苏木精-伊红染色镜下观察肿瘤组织形态。
Masson三色染色法:切片脱蜡至水后入重铬酸钾-醋酸液处理1 h;水洗后染Regaud氏苏木精10 min;自来水充分洗后,用2%盐酸乙醇分化;流水冲洗到蓝黑色;1%丽春红酸性品红液中染5 min;蒸馏水洗;1%磷钼酸水溶液媒染5 min;不经水洗入2%淡绿液3 min;1%醋酸液1 min;脱水、透明、封固。镜下观察两组中胶原纤维的表达,BI2000医学图像分析系统阳性细胞/细胞凋亡计数程序计算阳性细胞面积比。
RT-PCR检测α平滑肌收缩蛋白的表达:TRlzol RNA试剂盒提取RNA。参照RT-PCR试剂盒说明进行反转录和聚合酶链反应扩增。反转录反应条件:离心混匀;混合物37 ℃水浴60 min,95 ℃ 5 min。α平滑肌收缩蛋白和GAPDH的cDNA在相同的条件下进行聚合酶链反应,扩增条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃ 1 min:58 ℃ 1 min;72 ℃ 1 min;共40个循环,最后72 ℃延伸10 min。GAPDH上游引物:GAG CTG AAC GGG AAA CTC AC;下游引物:GGT CTG GGA TGG AAA CTG TG。α平滑肌收缩蛋白上游引物:GTG TGA GGA AGA GGA CAG CA;下游引物:TAC GTC CAG AGG CAT AGA GG。PCR产物电泳后在紫外光下观察检测。
免疫组织化学染色:使用一抗试剂稀释比例:成纤维细胞特异蛋白1∶200,成纤维细胞活化蛋白1∶200,白细胞介素6 1∶200,血管内皮生长因子1∶100,肌糖蛋白C 1∶100,肝细胞生长因子1∶100脱蜡、水化。用蒸馏水或PBS配置新鲜的H2O2,室温封闭5-10 min,蒸馏水洗3次。抗原修复。滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min。甩去多余液体。滴加Ⅰ抗,4 ℃过夜(4 ℃过夜后在37 ℃复温45 min)。滴加生物素化二抗,20-37 ℃ 20 min。滴加试剂SABC,20-37 ℃ 20 min。DAB显色试剂盒显色。苏木精复染2 min、盐酸乙醇分化。脱水、透明、封固、镜检。
主要观察指标:①苏木精-伊红染色对比观察肿瘤组织生长情况,Masson染色对比胶原纤维含量。②RT-PCR检测两组α平滑肌收缩蛋白的表达,免疫组织化学检测两组成纤维细胞特异蛋白、成纤维细胞活化蛋白的表达情况,反映两组肿瘤组织的间质纤维的程度。说明骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境中向成纤维细胞方向分化,参与肿瘤间质的形成和构建。③免疫组织化学方法对比两组中血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、白细胞介素6、肌糖蛋白C的表达高低。结果采用BI2000医学图像分析系统序列图像切片组织形态测量/免疫组化分析软件,测量灰度值(IA)大小进行定量分析。
统计学分析:第一作者使用SPSS 13.0软件分析,结果以x±s表示,两组间采用t 检验,分析结果P=0.016,P < 0.05为差异有显著性意义。