富血小板血浆对颗粒脂肪移植的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.011

中国组织工程研究

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富血小板血浆对颗粒脂肪移植的影响

李锋^{1, 2}，李昆^{1, 2}，李杰^{1, 3}，田卫东^{1, 2}

1四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，四川省成都市 610041；2四川大学华西口腔医学院口腔颌面外科，四川省成都市 610041；3四川大学生命科学学院，四川省成都市 610041

收稿日期:2013-03-11 修回日期:2013-04-10 出版日期:2013-07-30 发布日期:2013-07-30
通讯作者: 田卫东，教授、博士生导师，四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，四川省成都市 610041；四川大学华西口腔医学院口腔颌面外科，四川省成都市 610041 drtwd@sina.com
作者简介:李锋☆，男，1985年生，2013年四川大学华西口腔医学院毕业，博士，主要从事颌面外科创伤与整形方面的研究。 541910085@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(30973348)资助。

Platelet-rich plasma effects on grainy fat transplantation

Li Feng^{1, 2}, Li Kun^{1, 2}, Li Jie^{1, 3}, Tian Wei-dong^{1, 2}

1State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, West China School of Stomatology Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; 3College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2013-03-11 Revised:2013-04-10 Online:2013-07-30 Published:2013-07-30
Contact: Tian Wei-dong, Professor, Doctoral supervisor, State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; Department of Oral and Maxillofacial Surgery, West China School of Stomatology Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China 610041drtwd@sina.com
About author:Li Feng☆, M.D., State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; Department of Oral and Maxillofacial Surgery, West China School of Stomatology Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China 541910085@qq.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 30973348*

摘要/Abstract

摘要：

背景：较高的远期吸收率极大地影响了脂肪移植在临床的广泛应用。富血小板血浆中含有丰富的促进组织修复与再生的生长因子。
目的：观察富血小板血浆对颗粒脂肪移植效果的影响，并初步探索其作用机制。
方法：将10只6周龄的裸鼠随机选择左侧或右侧背部皮下组织作为富血小板血浆组(0.5 mL人颗粒脂肪+0.1 mL富血小板血浆)受区，另外一侧作为对照组(0.5 mL人颗粒脂肪+0.1 mL磷酸盐缓冲液)受区。于植入后10，90 d各选择5只裸鼠，处死后取出移植物进行大体形态观察、体积测定及组织学检测。此外，体外实验中，从人离体脂肪组织中分离培养脂肪干细胞，分别通过Cell Counting Kit-8和Real Time-PCR检测富血小板血浆对脂肪干细胞体外增殖和成脂分化的影响。
结果与结论：比较植入后10，90 d所得的移植物发现，富血小板血浆组存活体积明显多于对照组(P < 0.05)，组织学上也含有更多的正常脂肪细胞(P < 0.05)及微血管数目(P < 0.05)。体外实验中，富血小板血浆显著促进了脂肪干细胞的增殖，同时在其诱导的脂肪干细胞中检测到成脂分化相关基因表达升高。说明富血小板血浆能够提高脂肪移植的成活，这可能与富血小板血浆促进脂肪干细胞的增殖及成脂分化以及促进移植脂肪组织的血管化密切相关。

关键词: 器官移植, 细胞移植, 富血小板血浆, 脂肪干细胞, 血管新生, 细胞增殖, 成脂分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The higher long-term absorption rate greatly influence the widely application of fat transplantation. Platelet-rich plasma contains a high concentration of growth factors, which benefits to the tissue healing and regeneration.
OBJECTIVE: To observe the effects of platelet-rich plasma on grainy fat transplantation and to investigate the mechanisms preliminarily.
METHODS: Ten 6-week-old nude mice were prepared. The right or left dorsal subcutaneous tissues were randomly selected as the platelet-rich plasma group (0.5 mL fat granule+0.1 mL platelet-rich plasma), and the contralateral side was regarded as the control group (0.5 mL fat granule+0.1 mL phosphate-buffered saline). At 10 and 90 days after implantation, five nude mice were selected from each group, and then the mice were sacrificed to obtain the grafts in each group for general appearance observation, volume determination and histological detection. Furthermore, we isolated adipose-derived stem cells from human subcutaneous fat tissue during the in vitro experiment. Cell counting kit-8 and real-time PCR were used to evaluate the influence of platelet-rich plasma on adipose-derived stem cell proliferation and adipogenic differentiation in vitro, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Comparison of the grafts obtained at 10 and 90 days after implantation, the residual volume in the platelet-rich plasma group was significantly larger than that in the control group (P < 0.05), Moreover, more normal adipocytes and capillary formation were observed in the platelet-rich plasma group (P < 0.05). For in vitro experiment, platelet-rich plasma could significantly improve adipose-derived stem cell proliferation, and the expressions of adipogenic-related genes were up-regulated in platelet-rich plasma-induced adipose-derived stem cells. All results demonstrate that platelet-rich plasma can improve the survival of fat grafts, which might be closely related to that platelet-rich plasma can promote the proliferation and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells and the revascularization in grafted fat tissue.

Key words: organ transplantation, cell transplantation, platelet-rich plasma, adipose-derived stem cells, angiogenesis, cell proliferation, adipogenic differentiation, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

李锋，李昆，李杰，田卫东. 富血小板血浆对颗粒脂肪移植的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.011.

Li Feng, Li Kun, Li Jie, Tian Wei-dong. Platelet-rich plasma effects on grainy fat transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.011.

图/表（结果） 7

2.1 全血及富血小板血浆中血小板数量检测全血中的血小板浓度为145×109L-1，而富血小板血浆中的血小板浓度为920×109 L-1，达到全血中的5倍以上，符合实验用富血小板血浆标准^[4]。
2.2 移植物大体形态观察所有裸鼠很好地耐受了手术，术区未见明显脓肿、坏死形成。大体观察，术后10 d时两组移植物标本无明显异常。90 d时，富血小板血浆组移植物存留量明显多于对照组，且周围血供更丰富，触之质地较柔软，更接近正常脂肪组织。
2.3 移植物体积的比较见表2。

各组移植物存留体积随着移植时间的延长，都有所减少。在术后10，90 d，富血小板血浆组存留体积均大于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.4 移植物组织学比较术后10，90 d，富血小板血浆组脂肪细胞均维持较好的形态，细胞间隙保持较好，仅有少量脂肪空泡形成，见图1-4。对照组在移植90 d后的组织结构较混乱，大量结缔组织及脂肪空泡形成，部分出现坏死，仅少量细胞能够维持正常的形态。

定量比较发现，在各时间点，富血小板血浆组均比对照组具有更多正常脂肪细胞面积(P < 0.05)及微血管数量(P < 0.05)，见图5-7。

2.5 脂肪干细胞的分离与培养原代培养3 d左右可见部分细胞开始贴壁，10 d时可见细胞长满至80%，获得的细胞呈成纤维细胞样梭形，细胞形态较均匀，胞核胞质明显，见图8。传代培养后细胞增殖速度快，成旋涡状排列，一般3 d左右可消化传代1次。

2.6 富血小板血浆对脂肪干细胞体外增殖及成脂分化的影响 CCK-8结果显示与空白组相比，培养基中加入10%富血小板血浆或体积分数为10%胎牛血清后所测得吸光度值显著升高(P < 0.01)；富血小板血浆与胎牛血清对脂肪干细胞增殖的促进作用差异无显著性意义(P > 0.05)，见图9。
Real Time-PCR结果显示，在成脂诱导培养2周后，与阴性对照组相比，富血小板血浆组及阳性对照组脂肪干细胞均检测到过氧化物酶体激活受体γ及脂蛋白脂肪酶表达升高(P < 0.01)；且与单纯应用成脂诱导培养基的阳性对照组相比，添加富血小板血浆后也显著提高了过氧化物酶体激活受体γ及脂蛋白脂肪酶的表达(P < 0.05)，见图10。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年11月至2011年2月在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室及四川大学实验动物中心完成。

材料：

实验动物：健康6周龄清洁级裸鼠10只，雌雄不限，体质量(30±5) g，由四川大学华西实验动物中心提供；实验过程中对动物的处置符合相关动物伦理学要求。

人皮下脂肪组织：脂肪抽吸术中获取大约25 mL腹部皮下脂肪组织，由28岁健康女性自愿捐献。

人全血：健康志愿者捐献的45 mL血液，加入5 mL 3.8%枸橼酸三钠抗凝备用。

主要试剂与仪器：

实验方法：

颗粒脂肪制备：将新鲜获取的15 mL脂肪组织于超净工作台中用磷酸盐缓冲液反复冲洗以除去血液及油脂，随之用眼科剪去除肉眼可见的血管和筋膜，充分剪碎成能抽吸通过18^#注射针头的脂肪颗粒，4 ℃保存备用。

富血小板血浆制备：利用血细胞分析仪对全血中的血小板计数后，200×g、4 ℃离心10 min，从离心后得到的上层血浆中吸出5 mL备用；将剩下的血液成分用磷酸盐缓冲液稀释(1∶1)后，缓慢加入含有淋巴细胞分离液的离心管中；将离心管400×g、4 ℃离心20 min后，其内液体分为4层，从上到下依次为血浆层、富含血小板及白细胞的棕黄层、淋巴细胞分离液层、红细胞层。使用移液枪小心吸取棕黄层，用磷酸盐缓冲液离心清洗(200×g、4 ℃、10 min)两次后用之前提取的5 mL血浆重悬，吹打混匀即得富血小板血浆；同样利用血细胞分析仪对其进行血小板计数。

体内移植及结果检测：根据移植物不同，分为富血小板血浆组(0.5 mL颗粒脂肪+0.1 mL富血小板血浆)及对照组(0.5 mL颗粒脂肪+0.1mL磷酸盐缓冲液)；将10只裸鼠按随机数字法选择左侧或右侧背部皮下作为富血小板血浆组受区，另一侧作为对照组受区。将各组移植物均与0.1 mL溶有100 U凝血酶的1%氯化钙溶液充分混匀后，立即用带有18^#注射针头的1 mL注射器注射植入相应受区。于术后10，90 d各取出5组移植物进行大体观察、体积及组织学检测。

大体观察：观察移植物大小、颜色、质地、周围组织反应等。

体积测定：取2.5 mL注射器，准确加磷酸盐缓冲液至1.0 mL刻度线，分别将完整剥离出的各移植物完全没入磷酸盐缓冲液中，读取液平面刻度，减去1.0 mL即得移植物存活体积，可以精确到0.1 mL，估读到0.01 mL。

组织学检测：将各移植物标本用40 g/L多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后制备4 µm厚的组织切片，常规苏木精-伊红染色后在倒置显微镜下观察、拍照。利用Image-Pro Plus图像分析软件对100倍光镜下随机选取的每组8张无重叠视野照片进行分析，定量计算正常脂肪细胞、脂肪空泡的面积；同时对200倍光镜下的视野照片进行微血管计数。

脂肪干细胞的培养：在超净工作台中，将约10 mL脂肪组织用磷酸盐缓冲液反复冲洗，尽量去除肉眼可见的血管和筋膜，充分剪碎后转移入离心管中，加入等体积0.15%Ⅰ型胶原酶，37 ℃振荡、水浴消化30 min；200×g、4 ℃离心8 min，吸去悬浮的残存组织，将离心管底所得细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基，混合均匀，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内培养。每天倒置相差显微镜观察细胞形态特征及增殖情况，36-48 h观察细胞贴壁后首次换液，以后每72 h换液1次。待细胞融合至超过培养瓶底80%时，0.25%胰酶消化、传代培养。

富血小板血浆对脂肪干细胞体外培养的影响：用溶有凝血酶的1%氯化钙溶液激活富血小板血浆后，在 3 000×g、4 ℃下离心10 min，收集上清液，此即为激活的富血小板血浆。利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)检测富血小板血浆对脂肪干细胞增殖的影响；利用Real Time-PCR检测富血小板血浆对脂肪干细胞成脂分化的影响。

CCK-8：将脂肪干细胞接种于96孔培养板中，每孔100 µL培养液含5×10³个细胞，分为富血小板血浆组(α-MEM+10%富血小板血浆)、空白组(α-MEM)、胎牛血清组(α-MEM+体积分数为10%胎牛血清)，每组设3个复孔。置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内培养1，2，3，4，5，6，7 d后，向每孔内加入10 µL CCK-8溶液，继续培养3 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。

Real Time-PCR：取贴壁脂肪干细胞，更换成脂诱导α-MEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清， 1 μmol/L地塞米松，5 mg/L胰岛素，0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.2 mmol/L吲哚美辛)；富血小板血浆组加入10%富血小板血浆，阳性对照组仅用成脂诱导培养基，阴性对照组为含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基。诱导培养2周后，提取Total RNA，利用PrimeScript^® RT-PCR试剂盒合成cDNA，通过ABI PRISM^® 7300扩增，检测各组细胞中成脂分化相关基因过氧化物酶体激活受体γ(peroxisome proliferator- activated receptor-γ，PPARγ)、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)以及内参基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)mRNA的表达水平。相关引物见表1。

主要观察指标：移植物大体情况、移植物存留体积、移植物组织学结构、微血管数量；脂肪干细胞增殖及成脂分化相关基因表达情况。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。实验数据以x(_)±s表示，采用t 检验对组间差异性进行分析，P < 0.05(双尾)为差异有显著性意义。

讨论

为提高移植脂肪的成活率国内外学者进行了大量的研究^[11-12]，然而仍然不能得到满意的临床效果。作者将富小板血浆应用于颗粒脂肪移植，以期能够降低脂肪移植的吸收。与对照组相比，加入富小板血浆后，显著提高了颗粒脂肪移植的存活体积；进一步组织学分析表明，富小板血浆组含有更多正常脂肪细胞面积，更少的脂肪坏死空泡。这些实验结果说明富小板血浆提高了脂肪移植的效果。作者进一步探索了富小板血浆影响脂肪移植效果的原理。

既往研究表明，早期能否及时建立血供对移植脂肪组织的成活至关重要^[13]。在这次实验中，移植后10 d，富小板血浆组比对照组具有更多的微血管数目，说明富血小板血浆能够加速脂肪移植早期的血管重建。这得益于富小板血浆在被凝血酶激活后，可以释放大量生长因子，比如血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、表皮生长因子等，这些生长因子是血管新生的趋化因子^[14-15]，对血管再生有强烈的促进作用。因此，富小板血浆促进移植脂肪组织的血管新生，为移植组织中的细胞代谢提供充足的营养，从而提高脂肪移植的成活。

再次，脂肪组织中含有大量的脂肪干细胞^[16]。研究表明，脂肪干细胞相比其他成体干细胞，具有较强的自我更新能力以及多向分化潜能^[17-18]；更重要的，最近的研究表明，脂肪干细胞可通过分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子而促进血管新生^[19-20]，这对脂肪组织的再生至关重要，从而也对脂肪移植的成活起到促进作用^[21]。实验研究了富小板血浆对脂肪干细胞体外培养下增殖及成脂分化的影响。CCK-8结果显示富小板血浆显著促进了脂肪干细胞的增殖，这是因为富血小板血浆激活后能够释放高浓度的血小板源性生长因子、转化生长因子β等生长因子，它们能够刺激、促进间充质干细胞的有丝分裂，从而加速细胞增殖^[22-23]。同时，富小板血浆中的转化生长因子家族可以诱导间充质细胞向脂肪细胞分化^[24]；富小板血浆诱导的脂肪干细胞中检测到成脂相关基因过氧化物酶体激活受体γ及脂蛋白脂肪酶表达升高，说明富小板血浆促进了脂肪干细胞的成脂分化。所以，作者推断富血小板血浆一定程度上促进了移植脂肪组织中的脂肪干细胞的增殖及成脂分化，从而提高脂肪移植的成活。

此外，富小板血浆激活后形成的丰富的纤维网络对促进细胞黏附、防止细胞流失具有一定作用^[25]，也对降低脂肪移植的吸收起到积极作用。

除了促进脂肪移植的成活，富血小板血浆还具有诸多优点，比如富血小板血浆自源性获取，从而减免了异体移植排斥反应及疾病传播的风险；激活后的富血小板血浆呈凝胶状，可塑性、可操作性高，可以很好地与脂肪组织混合后通过注射方法进入缺损部位，从而减小创伤、感染、术后瘢痕等并发症。

总之，作者将富血小板血浆复合脂肪颗粒进行裸鼠体内移植，发现富血小板血浆能够提高移植脂肪的成活体积及组织学质量，这与富血小板血浆能够促进移植组织的血管新生及促进脂肪干细胞的增殖和成脂分化密切相关；复合富血小板血浆的脂肪颗粒移植为整形外科修复和重建软组织缺损畸形提供了崭新的思路，具有较高的临床应用前景。

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