糖尿病与正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前国内外在干细胞移植治疗心肌梗死的研究中，大多采用正常或者年轻的骨髓间充质干细胞作为移植细胞来源。
目的：比较糖尿病和正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效差别。
方法：无菌条件下获取正常大鼠及糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞，建立大鼠心肌梗死模型并随机分为3组，分别于心肌梗死病灶区注射100 μL含有105-106个F2代正常大鼠或糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞的细胞混悬液，空白对照组注射100 μL含体积分数20%胎牛血清的DMEM。移植后1个月行苏木精-伊红染色检测各组梗死区域心肌组织形态的变化；通过免疫组化方法检测Bcl-2的表达。
结果与结论：通过对细胞形态观察及流式细胞术鉴定，大鼠股骨骨髓贴壁培养可获取纯度较高的骨髓间充质干细胞，绘制细胞生长曲线结果显示正常大鼠骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长快。移植后1个月，正常大鼠干细胞移植组梗死区域心肌组织形态较糖尿病大鼠干细胞移植组及空白对照组明显改善，梗死区域心肌组织Bcl-2的表达也高于其他2组。证实正常大鼠来源骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长明显加快，且糖尿病使骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的疗效降低。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 骨髓间充质干细胞, 心肌梗死, 细胞移植, 糖尿病, 心肌, 病理变化, 细胞增殖, 细胞形态, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Current studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells from normal or young people usually serve as a source of transplanted cells in stem cell transplantation treatment of myocardial infarction.
OBJECTIVE: To compare the therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cells from diabetic and normal rats on myocardial infarction.
METHODS: Under sterile conditions, bone marrow mesenchymal stem cells from normal and diabetic rats were harvested. Then, rat models of myocardial infarction were established and randomly divided into three groups: 100 μL cell suspension containing 105-106 bone marrow mesenchymal stem cells from F2 normal or diabetic rats was injected into myocardial infarction lesions, and 100 μL Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 20% fetal bovine serum was injected serving as blank control. After 1 month, hematoxylin-eosin staining for myocardial infarction lesions was performed for histomorphological observation. Bcl-2 expression was detected by immunohistochemistry method.
RESULTS AND CONCLUSION: Based on cell morphology observation and flow cytometry identification, high-purity bone marrow mesenchymal stem cells could be obtained using rat femoral bone marrow adherent culture. Cell growth curve showed that normal rat bone marrow mesenchymal stem cells grew faster than those from diabetic rats. At 1 month after transplantation, histomorphological improvement was seen in the infarcted area after transplantation of normal rat bone marrow mesenchymal stem cells as compared with the other two groups. In addition, the Bcl-2 expression in the infarcted area was higher in the normal rat cell group than the the other two groups. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cells from normal rats grow faster than those from diabetic rats, and the cells from normal rats have better therapeutic effects on myocardial infarction.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, bone marrow-derived stem cells, myocardial infarction, cell transplantation, diabetes, myocardium, pathological changes, cell proliferation, cell morphology, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 36只正常大鼠心肌梗死模型均进入结果分析。
2.2 正常与糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞的形态观察见图1，2。

贴壁细胞融合达75%以上，正常大鼠及糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞均呈条索状梭形生长，糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞所形成的集落明显小于正常大鼠来源骨髓间充质干细胞，且细胞伸展无力，较为扁平，细胞增殖能力较低。
2.3 大鼠骨髓间充质干细胞表面标抗原的检测结果根据流式细胞检测结果，实验所培养的大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物阳性表达情况表明，第2代贴壁细胞高水平表达骨髓间充质干细胞的标志物：96.12%的细胞表达CD90，98.14%的细胞表达CD44，97.51%的细胞表达CD29；而内皮细胞标志物CD31表达水平低，为3.25%；造血细胞标志物CD34表达率为1.17%；白细胞标志物CD45表达率为10.17%。证明实验所培养的大鼠骨髓来源的贴壁细胞是间充质干细胞。
2.4 正常与糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞的生长曲线结果显示正常大鼠来源骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长明显加快。因此，正常大鼠骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞在移植治疗心肌梗死过程中可能会由于细胞数量的优势而具有更好的疗效。见图3，表1。

2.5 正常与糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死后心肌组织形态的变化骨髓间充质干细胞移植后1个月，苏木精-伊红染色检测各组梗死区域心肌组织形态的变化，空白对照组心肌细胞紊乱，细胞间裂隙增大；正常大鼠干细胞移植组梗死区内心肌细胞纹理规则、清晰；糖尿病大鼠干细胞移植组介于二者之间。说明正常大鼠干细胞移植组较糖尿病大鼠干细胞移植组及空白对照组明显改善。见图4-6。

2.6 正常与糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死后Bcl-2的表达通过免疫组化方法检测Bcl-2的表达，Bcl-2蛋白家族为抗凋亡亚家族，在心肌梗死发生中起到抗凋亡的作用。骨髓间充质干细胞移植后1个月，通过免疫组化方法检测正常大鼠干细胞移植组、糖尿病大鼠干细胞移植组及空白对照组梗死区域Bcl-2的表达，结果见图7-9。

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引言

冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)目前已成为中国心血管病住院病例的首要原因。随着冠心病发病机制研究的深入，越来越多的证据表明，作为代谢综合征之一的糖尿病与冠心病的发生有着密切的关系^[1]，糖尿病是冠心病的独立危险因素。与普通人相比，糖尿病患者更易发生冠心病，糖尿病患者的冠心病发病率是普通人群冠心病发病率的2-4倍，其中，超过75%的糖尿病患者最后都死于冠心病，由此可见，糖尿病在很大程度上加重了冠心病患者的冠脉病变程度。
心肌细胞曾被认为是终末分化细胞，当心肌梗死发生后心肌细胞难以再生，坏死的心肌细胞由纤维瘢痕组织替代，引起左室重构而导致心力衰竭。但最新的研究结果证实心肌细胞也存在自我修复能力。可是只有不到一半的心肌细胞在正常人的一生中可被更新，所以这种自我修复能力不能弥补心肌梗死患者心肌细胞的丢失。因此，如何促进梗死区内心肌细胞再生，已成为防止心肌梗死后心力衰竭发生和降低病死率的关键。近年来开展的心肌细胞成形术是向心肌梗死组织中移植有增殖潜能的细胞，如胚胎干细胞、骨骼肌成肌细胞和骨髓干细胞等，替代梗死瘢痕区的纤维结缔组织，促进心肌细胞的再生。
成体干细胞是存在于已经分化组织中的未分化细胞，可自我更新并分化形成组成该类型组织的细胞。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)属于成体干细胞，具有高度可塑性，且来源广泛，体外增殖能力强，免疫原性低，并可分化为不同类型的成熟细胞^[2]，成为最佳的移植细胞来源。目前骨髓间充质干细胞移植替代受损心肌用于心肌重建取得了可喜进展。体外实验证实骨髓间充质干细胞在特定条件下可以诱导分化为心肌细胞^[3-4]，体内动物实验也表明骨髓间充质干细胞移植能够促进心肌细胞再生，使梗死面积缩小，改善受损的心脏功能。但是和其他体细胞类似，骨髓间充质干细胞也易受年龄、氧化应激和高糖等各种因素的影响而导致其生物学性状改变^[5-6]。
糖尿病患者的体内环境复杂，其长期的高血糖、高血脂，酮体、活性氧、氧化产物等有害物质的增多，势必对自体来源的骨髓间充质干细胞的性状产生影响^[1,7]。金培峰等^[8]研究发现，糖尿病模型鼠来源的骨髓间充质干细胞的增殖能力明显减弱，并且在细胞的分泌和抗凋亡能力上也较正常大鼠来源骨髓间充质干细胞显著降低。另外Re等^[9]的研究也表明，糖尿病模型鼠来源的骨髓间充质干细胞传代后细胞变为扁平，具有这样的形态特征为细胞衰老的表象^[10]。
目前国内外在干细胞移植治疗心肌梗死的研究中，大多采用正常或者年轻的骨髓间充质干细胞作为移植细胞来源^[11-17]。为了验证糖尿病体内环境对骨髓间充质干细胞的影响以及确定其能否作为自体移植的细胞来源，实验将培养得到的糖尿病模型鼠来源的骨髓间充质干细胞移植回心肌梗死模型鼠体内，通过观察各组梗死区域心肌组织形态的变化，及免疫组化方法检测Bcl-2的表达，探讨糖尿病与正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的差异，为临床上合并糖尿病的冠心病患者自体骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的应用提供实验依据。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年在解放军沈阳军区总医院医学实验中心进行。

材料：

糖尿病与正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死实验应用的主要仪器和器材：

主要试剂：LG-DMEM培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)、猪胰蛋白酶及抗生素均购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。

实验动物：健康雄性2月龄SD大鼠80只，体质量(200±20) g，由解放军沈阳军区总医院动物实验中心提供。饲养温度20-25 ℃，昼夜自然光照，自动摄食和饮水。动物的饲养及处理按照National Institutes of Health (NIH)的《实验动物管理及使用指南》进行。

实验方法：

糖尿病大鼠模型的建立：取20只大鼠随机均分为2组，正常对照组大鼠喂饲普通饲料；糖尿病组大鼠在标准饲养环境下，持续给予高糖、高脂饮食(正常大鼠饲料按配比加入20%猪油及20%白砂糖)，监测大鼠尾静脉血糖值>16.7 mmol/L，且与正常大鼠血糖比较差异有显著性意义证实造模成功，造模成功的大鼠纳入实验。

骨髓间充质干细胞的分离、培养：无菌条件下取正常对照组及糖尿病组SD大鼠双侧股骨，在超净台内剪去部分双侧股骨干垢端，用5 mL注射器(内装含体积分数20%胎牛血清的DMEM)刺入干垢端反复冲洗，获取含大量骨髓间充质干细胞的骨髓细胞，5 mL移液管反复吹打均匀，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养，3 d后首次换液，PBS冲洗2遍，每3 d换液，至细胞贴壁长到80%，猪胰蛋白酶消化传代，重复上述步骤直至获得F2代细胞。

骨髓间充质干细胞的鉴定：用流式细胞仪对第2代骨髓间充质干细胞表面特异性抗原进行检测，猪胰蛋白酶消化待检细胞，PBS洗涤3次，制成细胞浓度为1×10⁹ L^-¹的细胞悬液，将待检细胞样品分为每管0.1 mL，加入CD29-PE、CD44-FITC、CD45-perCP、CD90-APC、CD34-PE、CD31-FITC，4 ℃孵育30 min，流式细胞仪测定各类抗原的阳性率^[18-20]。

骨髓间充质干细胞的生长曲线绘制：取正常大鼠及糖尿病大鼠来源的骨髓间充质干细胞分别培养，以观察的时间点为横坐标，以吸光度A值为纵坐标绘制髓间充质干细胞生长曲线。

正常大鼠心肌梗死模型的建立：正常SD大鼠采用10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉，大鼠麻醉成功，行气管插管并动物呼吸机持续辅助呼吸(潮气量：1.5 mL/100 g，呼吸次数：80次/min，吸呼比 1∶1.5)。取右侧卧位并固定，切开皮肤，分离肌肉，左进胸，用丝线牵拉两侧肋骨暴露胸腔，切开心包并悬吊，在左心耳附近结扎左冠状动脉前降支，局部心肌组织苍白，造成心肌缺血。局部缺血不明显者、术中大量出血或死亡者予以剔除。1个月后获取正常大鼠心脏标本及心肌梗死模型大鼠心脏标本行苏木精-伊红染色，从组织形态学上证实青年大鼠心肌梗死模型建立成功^[21-23]。

骨髓间充质干细胞移植：将正常大鼠心肌梗死模型36只随机分为3组，每组12只，分别标记为正常大鼠干细胞移植组、糖尿病大鼠干细胞移植组、空白对照组。取仰卧位，胸正中切口进胸，切开心包并探查，分别于心肌梗死病灶区注射100 μL含有10⁵-10⁶个F2代正常大鼠或糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞的细胞混悬液，空白对照组注射100 μL含体积分数20%胎牛血清的DMEM。注射方法为梗死灶周边均匀2点。

主要观察指标：正常与糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞移植后1个月，处死心肌梗死模型后获得石蜡切块标本，行苏木精-伊红染色检测各组梗死区域心肌组织形态的变化；通过免疫组化方法检测Bcl-2的表达。

统计学分析：采用SPSS 14.0统计学软件进行统计学处理，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 关于干细胞移植治疗心肌梗死随着对干细胞研究的深入，干细胞的分离纯化及体外定向分化技术的完善，人们逐渐认识了干细胞治疗的机制。干细胞除了体外实验验证的分化作用外，还有旁分泌功能，它能分泌干细胞因子、血管内皮生长因子、机制细胞衍生因子、胰岛素样生长因子等，而且还能抑制细胞的凋亡。所以经过了30年的动物实验研究后，人们认为干细胞移植治疗可能经过了某种未知的途径增强了心脏修复系统的能力，因此干细胞移植治疗技术有望成为一种最具有潜力的新的治疗方法^[24-27]。

2002年干细胞移植治疗心肌梗死技术在国外开始走入临床实验阶段。10个国外随机对照的临床试验的荟萃分析(共698例)结果显示：骨髓干细胞移植治疗能够提供左室射血分数，降低左心室舒张期内径、舒张期末容积，减小梗死面积，改善梗死室壁的局部运动。

骨髓间充质干细胞表达的表面标志抗原比较复杂，比如骨髓间充质干细胞可表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，主要包括①黏附分子：如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体如白细胞介素1受体(IL-1R)、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R、干扰素受体肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其他如CD90、CD105等。许多研究表明不同组织来源的间充质干细胞具有相似的免疫表型特征，表现为SH2(CD105)、SH3(CD73)、SH4、CD166、CD13、CD29、CD44等黏附分子阳性，不表达造血和内皮标记，如CD34、CD31、和CD45等。表达HLA-Ⅰ，不表达HLA-DR，不表达协同刺激分子CD80、CD86和

CD40^[28-37]。

实验采用F2代大鼠骨髓间充质干细胞进行流式细胞检测，96.12%的细胞表达CD90；98.14%的细胞表达CD44；97.51%的细胞表达CD29，内皮细胞标志物CD31表达率为3.25%；造血细胞标志物CD34表达率为1.17%；白细胞标志物CD45表达率为10.17%，高表达CD90、CD44、CD29这些间充质干细胞表面抗原，低表达内皮细胞标志物CD31、造血细胞标志物CD34、白细胞标志物CD45，以上结果符合间充质干细胞免疫分子的表达。

3.2 正常与糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞体外增殖对比实验旨在研究糖尿病对于骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的影响，为进一步临床应用提供实验依据。实验中绘制正常与糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞体外增殖的生长曲线，结果显示正常大鼠来源骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长明显加快，同时细胞形态观察发现，糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞所形成的集落较正常大鼠明显要小，且细胞伸展无力，较为扁平，细胞增殖能力低。因此，正常大鼠骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞在移植治疗心肌梗死过程中，可能会由于细胞数量和质量的优势而具有更好的疗效。

3.3 正常与糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效正常与糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞移植后1个月，处死心肌梗死模型后获得石蜡切块标本，通过苏木精-伊红染色检测梗死区域心肌组织形态的变化，结果显示正常大鼠干细胞移植组较糖尿病大鼠干细胞移植组及空白对照组明显改善。同时通过免疫组化方法检测Bcl-2的表达，结果显示正常大鼠干细胞移植组梗死区域心肌组织Bcl-2的表达增强，其染色较糖尿病大鼠干细胞移植组及空白对照组。Bcl-2蛋白家族为抗凋亡亚家族，在心肌梗死发生中起到抗凋亡的作用^[38-40]。正常大鼠干细胞移植组梗死区域心肌组织Bcl-2的表达增强，可以减少心肌梗死后的细胞凋亡，而糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞促Bcl-2表达的作用降低，不能很好控制心肌细胞的凋亡，这也可能是糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效不佳的机制之一。

糖尿病导致的高胰岛素血症和胰岛素抵抗，使得各种炎性因子作用于冠状动脉血管，加重了冠状动脉病变的同时，糖尿病患者机体的内环境也势必会发生改变^[19-21]。实验为对比正常与糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞的治疗效果，将受体统一为2月龄正常大鼠，真正应用于临床时势必将有一部分做为受者的患者为糖尿病患者，故仅研究供体所培养的骨髓间充质干细胞的差异是不够的，还需进一步研究受体的差异所带来的影响。同时，糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞移植组较空白对照组仍具有一定的心功能改善，说明受糖尿病影响，骨髓间充质干细胞在机体内的作用也在减小，但仍然存在。因此，是否可以在未来采用基因工程技术将糖尿病患者的骨髓间充质干细胞转载入适当基因，以改进其功能，也值得进一步实验研究。