间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.012

中国组织工程研究

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间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调

胡晶琼¹，欧阳为相²，李慧玉¹，王俊峰¹，卢聪¹，张兰男¹，徐海波³，陈莉莉⁴，黄士昂¹

武汉协和医院，1干细胞中心，2妇产科，3放射科，4口腔医疗中心，湖北省武汉市 430022

收稿日期:2012-10-02 修回日期:2012-12-20 出版日期:2013-07-02 发布日期:2013-07-02
通讯作者: 陈莉莉，博士，教授，武汉协和医院口腔医疗中心，湖北省武汉市 430022 并列通讯作者：黄士昂，博士，教授，武汉协和医院干细胞中心，湖北省武汉市 430022
作者简介:胡晶琼☆，女，1974年生，湖北省武汉市人，汉族，2004年德国弗莱堡大学分子医学系医学博士毕业，美国国家卫生研究院博士后，副教授，主要从事细胞治疗方面的研究。 jingqionghu2006@gmail.com
基金资助:
国家留学回国人员启动基金项目；国家自然科学基金海外合作项目(31110103905/C10030)及国家自然科学基金面上项目(81171386/H1808)。

Mesenchymal stem cells for the treatment of spinocerebellar ataxia

Hu Jing-qiong¹, Ouyang Wei-xiang², Li Hui-yu¹, Wang Jun-feng¹, Lu Cong¹, Zhang Lan-nan¹, Xu Hai-bo³, Chen Li-li⁴, Huang Shi-ang¹

1Stem Cell Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, 3Department of Radiology, 4Dental Center, Wuhan Union Hospital, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Received:2012-10-02 Revised:2012-12-20 Online:2013-07-02 Published:2013-07-02
Contact: Chen Li-li, M.D., Professor, Dental Center, Wuhan Union Hospital, Wuhan 430022, Hubei Province, China Corresponding author: Huang Shi-ang, M.D., Professor, Stem Cell Center, Wuhan Union Hospital, Wuhan 430022, Hubei Province, China
About author:Hu Jing-qiong☆, M.D., Associate professor, Stem Cell Center, Wuhan Union Hospital, Wuhan 430022, Hubei Province, China jingqionghu2006@gmail.com
Supported by:
The Project Sponsored by the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars of China*; Projects of International Cooperation and Exchanges, National Natural Science Foundation of China, No. 31110103905/C10030*; General Project of the National Natural Science Foundation of China, No. 81171386/H1808

摘要/Abstract

摘要：

背景：脊髓小脑性共济失调是临床上较常见的以进行性加重的四肢共济运动障碍为主要临床表现的中枢神经系统变性疾病，常规药物治疗效果欠佳。
目的：观察自体骨髓间充质干细胞以及异体脐带间充质干细胞输注治疗脊髓小脑性共济失调的临床效果。
方法：对接受间充质干细胞治疗的27例确诊脊髓小脑性共济失调患者进行综合统计分析，其中6例行自体骨髓间充质干细胞腰穿治疗，21例行异体脐带间充质干细胞腰穿结合静脉输注治疗，两组患者均采用世界神经病联合会国际合作共济失调量表(International Cooperative Ataxia Rating Scale，ICARS)对患者治疗前后神经功能进行评定。
结果与结论：所有27例脊髓小脑共济失调患者行间充质干细胞治疗过程中以及治疗前后均未及明显不良反应。其中6例患者采用自体骨髓间充质干细胞治疗后效果均不明显，另外21例患者行异体脐带间充质干细胞输注治疗，治疗后3个月与治疗前比较，患者自觉症状均有一定程度改善，ICARS评分明显降低(P < 0.05)。说明脐带间充质干细胞治疗是安全的，可以一定程度地改善脊髓小脑性共济失调患者的临床症状，提高患者生活质量。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 脐带间充质干细胞, 骨髓间充质干细胞, 脊髓小脑性共济失调, 运动障碍, 腰穿, ICARS评分, 异体脐带, 细胞移植, 脐血, 免疫表型, 老年痴呆, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Spinocerebellar ataxia is a common neurodegenerative disease characterized by slowly progressive movement incoordination of the limbs. It responds badly to common medication.
OBJECTIVE: To observe the clinical effect of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and allogeneic umbilical cord mesenchymal stem cells tranfusion in the treatment of spinocerebellar ataxia.
METHODS: A total of 27 spinocerebellar ataxia patients treated with mesenchymal stem cells treatment were included for comprehensive statistical analysis. Among these patients, six patients received autologous bone marrow mesenchymal stem cells lumbar puncture treatment and 21 patients received allogeneic umbilical cord mesenchymal stem cells lumbar puncture treatment combined with intravenous infusion. The neurologic function of the patients in the two groups was evaluated with International Cooperative Ataxia Rating Scale before and after treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no obvious adverse effect in the 27 spinocerebellar ataxia patients during, before or after mesenchymal stem cells treatment. The effect of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in six patents was not significant; for the other 21 patients treated with allogeneic umbilical cord mesenchymal stem cells transfusion, the subjective symptoms of the patients were improved, and the International Cooperative Ataxia Rating Scale scores were decreased significantly at 3 months after treatment when compared with those before treatment (P < 0.05). The results suggest that umbilical cord mesenchymal stem cells treatment is safe and able to ameliorate the clinical symptoms and improve life quality of spinocerebellar ataxia patients to some extent.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, umbilical cord mesenchymal stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, spinocerebellar ataxia, dyskinesia, lumbar puncture, International Cooperative Ataxia Rating Scale, allogeneic umbilical cord, cell transplantation, cord blood, immune phenotype, dementia, Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

胡晶琼，欧阳为相，李慧玉，王俊峰，卢聪，张兰男，徐海波，陈莉莉，黄士昂. 间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.012.

Hu Jing-qiong, Ouyang Wei-xiang, Li Hui-yu, Wang Jun-feng, Lu Cong, Zhang Lan-nan, Xu Hai-bo, Chen Li-li, Huang Shi-ang. Mesenchymal stem cells for the treatment of spinocerebellar ataxia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.012.

图/表（结果） 5

2.1 参与者数量分析纳入经临床、头颅MRI检查确诊的27例脊髓小脑性共济失调患者，其中6例行自体骨髓间充质干细胞治疗，细胞采集以及回输均为一次性，为1个疗程；21例行异体脐带间充质干细胞输注治疗，4 次为1个疗程。患者随访时间为1年，无随访脱落，按照意向性处理分析所有病例均进入结果分析。
2.2 脊髓小脑性共济失调的基因诊断所有患者外周血DNA均采用PCR技术扩增ATXN1，3，7基因相应CAG重复序列并以1%琼脂糖凝胶电泳。正常阴性对照产生一正常条带(约200 bp)，患者PCR扩增后产物电泳可见一正常条带(约200 bp)以及一异常条带 (有时有两条)，明显大于300 bp，与脊髓小脑性共济失调阳性对照条带基本吻合，提示ATXN基因相应CAG重复序列异常增加，见图1A。对阳性病例扩增出的异常条带进行克隆测序。27例病例中11例脊髓小脑性共济失调3基因出现异常扩增，ATXN3基因相应CAG重复次数为50-78次，较正常值(13-40次)相比增加，见图1B。

2.3 间充质干细胞培养以及体外鉴定间充质干细胞从形态上基本都是贴壁细胞，呈长梭形，呈典型的漩涡状生长。通常骨髓间充质干细胞的培养采用联合利用密度梯度离心和差异贴壁法分离间充质干细胞，但常常不可避免的混有各种杂细胞，一开始经常会有很多个体较大的圆形或细胞，可能是血细胞或吞噬细胞，还混有很多成纤维细胞，一般多次换液后杂细胞才逐渐被除去，残留的杂细胞理论上来说要在传代后才能完全除去，但在临床上应用时，3周的培养时间往往还未传代，因此最后回输时往往还是混有一定数量的杂细胞。而脐带间充质干细胞由于临床上应用的多为传代4次以后，因此细胞高度均一，杂细胞极少，见图2-5。

2.4 间充质干细胞免疫表型的特征由于前述的原因，骨髓来源的间充质干细胞在流式检测上CD90+ CD13+CD45-CD14-细胞/有核细胞以及CD44+CD34- CD105+CD71+细胞/有核细胞的比例一般在75%-92%，而脐带间充质干细胞的CD90+CD13+ CD45-CD14-细胞/有核细胞以及CD44+CD34-CD105+ CD71+细胞/有核细胞的比例则在95%-99%，脐带间充质干细胞的体外免疫表型检测明显优于骨髓间充质干细胞，见表1。

2.5 临床疗效采用ICARS对患者治疗前后神经功能进行评定，两组患者治疗前ICARS评分大致相当，骨髓间充质干细胞治疗组治疗前ICARS(38.05±10.85)分；脐带间充质干细胞治疗组治疗前ICARS(39.56±14.52)分。6例脊髓小脑共济失调患者采用自体骨髓间充质干细胞治疗后效果均不明显，另外21例脊髓小脑共济失调患者行异体脐带间充质干细胞腰穿结合静脉输注治疗，治疗过程中以及治疗前后均未及明显不良反应，21例患者治疗前ICARS(39.56±14.52)分，治疗后1个月评分(36.28±14.76)分，差异无显著性意义。但3个月后患者自觉症状均有一定程度改善，ICARS评分(33.39±13.25)分，与治疗前相比明显降低(P < 0.05)，见表2。

通常眼球运动障碍较难改善，言语流利程度的改善一般出现在3个月左右，最先出现自觉症状的改善往往是姿势和步态以及共济运动的改善，患者主观感觉走路较前稳，向前走时的冲撞现象明显减弱，另外有2例患者治疗时已经坐轮椅，ICARS评分约为80分，尽管治疗有一定的效果，1例治疗后3个月感觉说话较以前流利，但由于病情严重程度与其他治疗的大部分患者不匹配，因此未纳入此次临床统计范畴。
2.6 不良反应及并发症观察所有治疗患者未发现有畏寒发热现象，2例患者腰穿回输后出现一过性头痛，与体位明显相关，考虑为腰穿操作所致，经多饮水等对症处理后症状消失。其余所有患者均无头痛头昏等不良反应。

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引言

材料方法

设计：病例回顾分析，对照观察。

时间及地点：在2009年10月至2012年6月在武汉协和医院干细胞中心完成。

对象：纳入经临床、头颅MRI检查、基因检测确诊的27例脊髓小脑性共济失调患者，其中男15例，女12例，年龄16-59岁，平均年龄(38.64±12.00)岁，发病年龄14-49岁，平均发病年龄(33.14±11.22)岁，发病到治疗时间平均5.5年。治疗前常规进行三大常规，肝肾功能，电解质，心肺功能检查，输血前全套，乙肝全套，出凝血功能，肿瘤标志物全套以及头部MRI检查。治疗前如实告知患者治疗方案及风险，患者均签署知情同意书，经医院医学伦理委员会批准。

脐带的取材标准：孕妇年龄≤35岁，无遗传性传染性及各种孕期疾病；由武汉市协和医院妇产科提供，产妇及家属对实验均知情同意，并经医院伦理委员会批准。

脊髓小脑性共济失调诊断标准：根据典型的共济失调的临床表现包括行走和站立不稳、上肢精细动作差、构音障碍等，体检有典型的共济失调体征，MRI检查提示有特征性的小脑萎缩的影像学特征(基因筛查检测作为诊断的参考依据但不作为临床诊断依据)。

纳入标准：①确诊为脊髓小脑性共济失调。②以前未进行过干细胞治疗的患者。③患者对实验知情同意并签署临床知情同意书。

排除标准：①高度过敏体质或有严重过敏史者。②恶性肿瘤。③正处于全身感染或局部严重感染的患者。④合并心、肺、肝、肾等重要脏器的功能障碍等。

方法：

自体骨髓间充质干细胞制备：取自体骨髓50 mL以及自体外周血100 mL，送干细胞中心GMP实验室开始骨髓间充质干细胞培养，联合利用密度梯度离心和差异贴壁法分离间充质干细胞，将细胞悬浮于人间充质干细胞无血清培养基中，按1×10⁶ /cm²密度接种于塑料培养瓶中，自体血清以体积比1∶10添加，一般3周左右获得1×10⁷个细胞回输。所有操作均在国家GMP认证的细胞治疗制备室中完成。

骨髓间充质干细胞的鉴定：所有骨髓来源的间充质干细胞回输前均需进行多参数流式检测，间充质干细胞的免疫表型以CD90⁺CD13⁺CD45^-CD14^-细胞/有核细胞以及CD44⁺CD34^-CD105⁺CD71⁺细胞/有核细胞的比例表示，二者均在80%以上即认为获得了较纯的间充质干细胞，达到回输质量要求，可以回输。

异体脐带间充质干细胞制备：经产妇知情同意及感染源检定后收集健康胎儿端脐带5 cm，去除脐带动、静脉，将脐带华通胶(wharton’s jelly)剪成0.1 cm³大小的组织块，加入0.1% Ⅰ型胶原酶，37 ℃消化过夜。次日，加入0.05%的胰蛋白酶，37 ℃消化30 min。200目筛网过滤，1 200 r/min 离心10 min 收集细胞，计活细胞数。将细胞悬浮于人间充质干细胞专用培养基中，按1×10⁶/cm²底面积接种于塑料培养瓶中。2-5 d后可见成纤维状细胞贴壁。达80%贴壁后加入0.05%胰蛋白酶消化，1∶3进行传代培养，体外扩增达1×10⁷后收获细胞用于治疗，或将细胞冻存于液氮备用。

脐带间充质干细胞的鉴定：所有脐带间充质干细胞回输前均需进行多参数流式检测，CD90⁺CD13⁺CD45^-CD14^-细胞/有核细胞以及CD44⁺CD34^-CD105⁺CD71⁺细胞/有核细胞两者比率均在95%-100%即认为获得了较纯的间充质干细胞，可以回输。

间充质干细胞治疗方案：

骨髓间充质干细胞治疗方案：采集患者自体骨髓后3周左右将所扩增的骨髓间充质干细胞一次性腰穿回输给患者，一般回输细胞数量为(1.0-2.0)×10⁷。细胞采集以及回输均为一次性，完成即为1个疗程。

脐带间充质干细胞治疗方案：患者入院第2天进行间充质干细胞静脉回输(1×10⁶/kg)，第4天进行腰穿间充质干细胞回输，鞘内注射脐带间充质干细胞，每次5 mL (5×10⁵/kg)，注射时，将脐带间充质干细胞+地塞米松 5 mg在5 min 内缓慢注入蛛网膜下腔。2周后重复1次，1个疗程干细胞回输4次，2次静脉回输，2次腰穿回输，以上过程完成为1个疗程。

评估标准：采用世界神经病联合会国际合作共济失调评分量表(ICARS)对患者治疗前及治疗后1个月，3个月的神经功能及生活质量进行评定，分值越高表示神经功能缺损越严重^[26]。

不良反应及并发症观察：观察治疗中及治疗后有无一过性畏寒，发热、腰痛、头痛、头晕等不良反应。

主要观察指标：主要观察患者治疗前后的共济运动改善情况，采用ICARS量表逐项评分。主要分步态，上下肢共济运动，语言功能以及眼球运动四大方面进行评估^[26]。

统计学分析：采用SPSS 11.5 软件包进行统计处理，数据以x(_)±s表示，行数据配对t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脊髓小脑性共济失调是在临床中最常见的遗传性共济失调类型，由于此病往往呈进行性发展，常规治疗无效，预后较差。脊髓小脑性共济失调在临床上一般诊断并不困难，根据典型的临床症状，阳性家族史，典型的MRI表现诊断基本可以明确。但是临床上有时需要与多系统萎缩的小脑型相鉴别。本中心也收治了5例多系统萎缩的小脑型，这些患者一般发病年龄较大，一般50-60岁发病，无遗传家族史，症状多伴发其他如锥体外系表现如帕金森症状可以鉴别^[27]。这类患者干细胞治疗的效果也不太理想，这可能与年纪大的患者本身干细胞自身内源性神经细胞再生能力减弱有关。

3.1 脊髓小脑性共济失调的基因检测本中心对所有干细胞治疗患者提供了相应的基因检测。从基因检测结果来看，27例患者有11例属脊髓小脑性共济失调3型(40.7%)，测得ATAXIN 3基因存在异常重复。与文献报道脊髓小脑性共济失调3型为脊髓小脑性共济失调最常见的基因型的结果基本一致^[27]。对ATAXIN 3基因明显异常的患者子女进行ATAXIN 3 基因筛查发现，子代存在遗传早现的分子学特征，表现为子代的CAG异常重复序列次数较亲代增加，但是由于目前对此病无有效的治疗方法，因此对脊髓小脑共济失调患者的子女做基因筛查一定要谨慎，因为会造成知情负担，本组有1例26岁女性患者，其女1岁半查出已经有CAG异常重复序列，另一例患者53岁，发病已经10年，其子无症状，23岁也查出已经有CAG异常重复序列，鉴于脊髓小脑性共济失调基因诊断时间不长，目前尚缺乏此病的长期随访资料，因此建议做脊髓小脑性共济失调患者的无症状子女的筛查时一定要谨慎，否则人为造成知情负担，对患者家庭会造成不利的影响。

3.2 间充质干细胞的治疗效果实验中心最初开展的是自体骨髓间充质干细胞治疗。治疗了几例以后，经随访发现治疗后病情改善不明显。因此又开展了脐带间充质干细胞治疗。脐带间充质干细胞来源于脐带，取材方便，无伦理学争议，人脐带中分离出的间充质干细胞在细胞含量、增殖能力上均优于骨髓间充质干细胞^[28-30]，可在体外大量扩增，具有低免疫原性^[31]。另外，间充质干细胞可以分泌大量的生物活性物质^[32-33]，能促进神经组织的修复。体外实验证明人脐带富含间充质干细胞且易分离，在体外易于培养扩增，且增殖能力强，具有多向分化潜能，无致瘤性等生物学特性，可以有效的向神经元方向诱导分化^[5-8]，因此作为基因治疗的靶细胞，以及组织工程研究的种子细胞具有广泛的应用前景。

采用脐带间充质干细胞治疗后，大部分病例均取得一定效果。ICARS分姿势和步态障碍，动态功能，语言障碍，以及眼球运动障碍四大部分，有经验的医生可以在10 min内完成检查以及评分，因此简便易行。

尽管大部分患者有一定的临床效果，但常规MRI检查对治疗前后进行对比一般看不出明显的影像学改变。

3.3 造成两种治疗方法疗效差异的可能原因尽管自体骨髓间充质干细胞治疗例数较少，仅6例，但是这6例患者治疗效果均不明显，而脐带充质干细胞治疗的21例患者治疗后均有一定的效果，两组患者治疗前初始ICARS评分相当，因此可以认为这两组患者的临床治疗效果差异还是有显著意义的。

那么为何自体骨髓间充质干细胞治疗效果不明显而脐带间充质干细胞治疗效果较明显。作者认为可能有以下原因：①脊髓小脑性共济失调患者大部分有基因异常，为相应三核苷酸序列大量扩增^[27]，因此患者自体骨髓间充质干细胞可能因为也携带了相应的基因异常，因此向小脑神经元诱导分化受阻而导致治疗效果不明显。②间充质干细胞能分泌多种神经营养因子支持神经细胞生存，诱导内源性神经细胞再生以及促进外源性神经细胞在损伤部位再生^[33]。脊髓小脑性共济失调患者的基因异常可能也影响了自体间充质干细胞的自分泌和旁分泌效应导致疗效不明显。但是，自体骨髓来源的间充质干细胞治疗由于涉及抽取患者骨髓，因此往往是一次采集，3周后一次性将培养扩增后的间充质干细胞回输。而脐带来源的间充质干细胞治疗不涉及抽取患者骨髓的问题，因此可以多次回输，总细胞回输量远较自体骨髓来源的间充质干细胞大，所以尚不排除这种治疗疗程以及细胞回输数量的差异也导致了疗效的差异。

3.4 干细胞治疗后一定要配合进行康复功能训练常规对患者进行共济失调的功能训练一般分为4个方面，上肢的平衡能力训练包括指鼻运动，对指运动，轮替运动等；下肢的平衡训练单腿站立以及双脚前后站立等；行走平衡的训练：直线行走、倒行、曲线行走、原地踏步走。逐渐增加训练次数。还有精细动作的平衡训练。干细胞治疗以后，新输入体内的干细胞要发挥功能需要重新建立神经反射环路，这些简单的共济失调的功能训练有助于帮助重新建立姿势平衡反射弧有关。康复训练的时间可以在治疗后马上进行，然后逐渐增加训练的强度和频率。

综上，作者的临床应用研究结果表明，脐带间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调是安全的，可在一定程度上改善神经功能。但由于脊髓小脑性共济失调属进展性神经变性疾病，从理论上说，这些患者的脑内环境存在缺陷，新植入的干细胞在不良的环境中生存以及发挥功能很可能受限，因此干细胞治疗只能在一定时间内改善症状、延缓疾病进展。

间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调

Mesenchymal stem cells for the treatment of spinocerebellar ataxia

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