骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.002

中国组织工程研究

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骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

陈亮1，何少茹2，庄建1，郑曼利2，孙云霞2，梁穗新2，刘玉梅2，孙新2，陈晓博1

1广东省心血管病研究所，广东省广州市 510080；2广东省人民医院(广东省医学科学院)，广东省广州市 510080

出版日期:2013-07-02 发布日期:2013-07-02
通讯作者: 何少茹，博士，主任医师，教授，博士生导师，广东省人民医院，广东省广州市 510080 hsr1605@126.com
作者简介:陈亮★，男，1985年生，江苏省徐州市人，汉族，广东省心血管病研究所硕士研究生，主要从事干细胞与组织工程气管的研究。 lfchenliang@126.com
基金资助:
“十二五”国家科技支撑计划(2011BAI11B22)

Chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Chen Liang1, He Shao-ru2, Zhuang Jian1, Zheng Man-li2, Sun Yun-xia2, Liang Hui-xin2, Liu Yu-mei2, Sun Xin2, Chen Xiao-bo1

1Guangdong Cardiovascular Institute, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; 2Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Online:2013-07-02 Published:2013-07-02
Contact: He Shao-ru, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China hsr1605@126.com
About author:Chen Liang★, Studying for master’s degree, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China lfchenliang@126.com
Supported by:
Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period, No. 2011BAI11B22*

摘要/Abstract

摘要：

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物，对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。
目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞，观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。
方法：无菌环境取兔骨髓，经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代，流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管，经酶消化法分离培养气管软骨细胞，甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子β1的基础上，将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养，倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成，荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA的表达。
结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长，传代后细胞生长速度明显增快，呈鱼群状聚集生长。第1代有96.97%的细胞表达CD44、13.72%的细胞表达CD45，第2代有99.11%的细胞表达CD44、8.54%的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后，骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形，表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA基因，甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞，第2代纯度较高，且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 流式细胞术, 气管软骨细胞, 分离, 培养, 诱导分化, 鉴定, 部级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are important seeded cells for construction of tissue-engineered trachea, but there is no special surface marker. Therefore, identification of bone marrow mesenchymal stem cells is mostly based on morphology, phenotype antigen and the function of differentiation.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of the tracheal chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells under a special condition through isolation, cultivation and identification of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Rabbit bone marrow was acquired in the sterile environment to isolate and culture bone marrow mesenchymal stem cells to passage 2 by bone marrow adherence and screening method. Flow cytometry identified the phenotype CD44, CD45 of bone marrow mesenchymal stem cells at passages 1 and 2. Rabbit tracheal samples were acquired in the sterile environment, the tracheal chondrocytes were isolated and cultured by enzyme digestion, and toluidine blue staining was used to detect aggrecan. Bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with tracheal chondrocytes by Transwell and transforming growth factor β1. Cell morphology was detected under an inverted microscope. Real-time quantitative PCR and toluidine blue staining detected the extracellular matrix components, such as type Ⅱ collagen and aggrecan.
RESULTS AND CONCLUSION: After isolation and culture, cells were spindle and irregular in morphology, and passaged cells thrived that were gathered into a fish-like colony growth. For passage 1 bone marrow mesenchymal stem cells, the positive rates of phenotype antigen CD44 and CD45 were respectively 96.97% and 13.72%; for passage 2 cells, the positive rates of phenotype antigen CD44 and CD45 were 99.11% and 8.54%, respectively. Tracheal chondrocytes were positive for toluidine blue staining. The morphology of induced bone marrow mesenchymal stem cells changed from long fusiform to triangular or irregular shape, indicating the chondrocytes expressed type Ⅱ collagen and aggrecan, and toluidine blue staining was positive. These results showed bone marrow adherence and screening method could acquire bone marrow mesenchymal stem cells, and the purity of passage 2 cells is higher. Under a special condition, bone marrow mesenchymal stem cells have the potential of chondrogenic differentiation, and can be selected as seed cells for construction of tissue-engineered trachea.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, flow cytometry, tracheal chondrocytes, isolation, cultivation, induced differentiation, identification, ministerial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

陈亮，何少茹，庄建，郑曼利，孙云霞，梁穗新，刘玉梅，孙新，陈晓博 . 骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.002.

Chen Liang, He Shao-ru, Zhuang Jian, Zheng Man-li, Sun Yun-xia, Liang Hui-xin, Liu Yu-mei, Sun Xin, Chen Xiao-bo. Chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.002.

图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞形态学观察经全骨髓贴壁筛选法培养3 d换液后，倒置显微镜下可见大部分细胞呈梭形或不规则形贴壁生长，散在分布于瓶壁，见图1A。培养5-7d细胞形成集落，细胞呈长梭形融合至90%以上，1∶2比例传代后细胞生长旺盛，大部分细胞在传代后3- 5 h内已贴壁，两三天呈长梭形或不规则形融合至95%以上，呈鱼群样聚集成集落，第1代可见大量圆形透亮造血细胞悬浮培养液中，见图1B。不断换液，并传至第2代时，仅见少量圆形透亮造血细胞悬浮培养液中，见图1C。

2.2 流式细胞鉴定细胞表型
第1代骨髓间充质干细胞分析结果：第1代细胞有96.97%的细胞表达CD44，13.72%的细胞表达CD45，鼠IgG1同型阴性对照细胞的表达为0.17%、空白对照细胞则为0.1%，见图2。

第2代骨髓间充质干细胞分析结果：第2代细胞有99.11%的细胞表达CD44，仅8.45%的细胞表达CD45，鼠IgG1同型阴性对照细胞的表达为0.13%、空白对照细胞则为0.1%，见图3。

2.3 气管软骨细胞原代培养及鉴定原代软骨细胞培养3 d可见大部分细胞贴壁生长，呈短不规则形散在分布，胞核清晰，细胞外基质遮光性强，培养7 d后细胞大量增殖，呈较均匀分布生长，核质清晰，见图4A。正常气管软骨细胞甲苯胺蓝染色可见细胞核质分界清晰，细胞核被染成深蓝色，胞质染成蓝紫色，见图4B。

2.4 骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞共培养及鉴定
骨髓间充质干细胞形态观察及甲苯胺蓝染色：自共培养7 d以后，骨髓间充质干细胞形态由长梭形逐渐变为短小的三角形或不规则形，细胞增殖速度减慢，见图5A；对照组骨髓间充质干细胞仍呈长梭性，聚集成集落密集生长。经甲苯胺蓝染色示细胞核染成深蓝色，胞质染成蓝紫色，见图5B；对照组甲苯胺蓝染色后未见细胞核和细胞质染色。

qRT-PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA表达：实验组与对照组相比，经诱导后的骨髓间充质干细胞较高的表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA基因(P < 0.05)，见图6，表5。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。
时间及地点: 实验于2012年12月至2013年3月在广东省人民医院医学研究中心实验室完成。
材料：
实验动物：普通级新西兰大白兔8只，2月龄，体质量约1.5 kg，雌雄不限，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2011-0015，实验过程中对动物的处置符合广东省人民医院伦理学标准。
兔骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定所用主要试剂和仪器：

实验方法：
骨髓间充质干细胞分离及培养：无菌环境下取兔股骨，吸取无血清DMEM/F12培养基冲洗髓腔，1 500 r/min，离心5 min，弃上层废液，加入DMEM/F12完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素 100 U/mL)吹打混匀并移入75 cm2培养瓶内，37 ℃、体积分数5%CO2、100%饱和湿度的CO2温箱培养。3 d后首次换液，保留贴壁细胞继续培养，以后每2 d更换一次培养液，细胞培养至融合达90%以上时胰酶消化并传代培养至第2代。
流式细胞术鉴定第1代和第2代细胞表面标志物：取生长至90%以上融合的骨髓间充质干细胞P1和P2，0.25%胰酶- EDTA消化液消化，1 300 r/min的速度离心10 min，去上清，磷酸盐缓冲液(PBS)吹打混匀，分装入4个EP管，每管100 μL PBS，向其中3个EP管中分别加入鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45、鼠IgG1阴性对照等一抗(1∶1 000)，剩余1个EP管不加一抗，作为空白对照，4 ℃孵育30 min，4 ℃、2 000 r/min的速度离心5 min，去上层液体，加入500 μL PBS混匀，4 ℃、2 000 r/min的速度离心5 min，去除上层液体，每管各加入100 μL PBS重悬，除空白对照组外其余各管均加入二抗(1∶1 000)，混匀孵育 30 min，4 ℃、2 000 r/min的速度离心5 min，后去除上层液体，每管加250 μL PBS混匀行流式细胞仪鉴定。
气管软骨细胞的分离、培养：无菌环境下分离兔颈部气管，沿环状软骨下0.5 cm处横向切断气管约2 cm，去除气管表面异物，剪碎气管，大小约1 mm×1 mm× 1 mm，0.2%Ⅱ型胶原酶(量约气管软骨体积的3倍)消化，37 ℃水浴箱中孵育3.0-4.0 h，至大部分气管软骨被消化、液体变浑浊时，加体积分数10%的胎牛血清终止消化，200目尼龙筛过滤，离心后加入DMEM/F12完全培养基，吹打混匀后移入25 cm2培养瓶，放入37 ℃、体积分数5%CO2、100%饱和湿度的CO2温箱培养。3 d后首次换液，随后每两三天换一次液。
气管软骨细胞甲苯胺蓝染色：待原代细胞长满瓶底约85%以上后，用0.25%胰酶-EDTA消化液消化，从培养瓶中移入已放有载玻片的6孔板中，放入CO2温箱培养，爬片、固定，1%甲苯胺蓝染液染色1 h，体积分数95%乙醇洗去多余染液，光学显微镜观察。
骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞共培养：取第2代骨髓间充质干细胞，按每孔1×109 L-1接种于Transwell小室下层。实验分为对照组和实验组，实验组将1×1010 L-1的正常气管软骨细胞悬液加入Transwell小室上层，再加入含有转化生长因子β1(10 μg/L)的DMEM/F12培养基；对照组不加软骨细胞和转化生长因子β1，培养基中加入体积分数10%的胎牛血清，完成Transwell非接触式共培养体系的液体配置，放入CO2温箱进行非接触式共培养14 d。每天倒置显微镜观察细胞形态变化。期间每两三天换一次液，并更换正常气管软骨细胞，更换时将生长有气管软骨细胞的上层小室放入含有0.25%胰酶- EDTA消化液的无菌培养皿中消化10 min，并间断地使用吸管吹打上层小室的底部，然后使用PBS冲洗底部3-5次，放回Transwell小室中，将培养的正常气管软骨细胞接种于上层小室。
诱导后骨髓间充质干细胞甲苯胺蓝染色：甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成情况，具体步骤同上。
诱导后骨髓间充质干细胞 qRT-PCR鉴定：TRIzol提取诱导后的骨髓间充质干细胞总RNA，反转录获得cDNA，进行qRT-PCR反应。引物序列分别为(Invitrogen公司设计)：内参GAPDH(121 bp)正义链：5’-TGA CGA CAT CAA GAA GGT GG TG-3’，反义链：5’-GAA GGT GGA GGA GTG GGT GTC-3’；Ⅱ型胶原(167 bp)正义链：5’-TAC CAC TGC AAG AAC AGC GT-3’，反义链:5’-CCC CAC TTA CCG GTG TGT TT-3’；蛋白聚糖(64 bp)正义链：5’-T CTA CCG CTG TGA GGT GAT GC-3’，反义链：5’-TTC ACC ACC ACC TCC AAG G-3’。反转录反应液配制、反应条件以及qRT-PCR反应液配制、反应条件见表1-4。在PCR反应中，将正常的骨髓间充质干细胞作为对照组。qRT-PCR由荧光定量PCR仪自动采集目的基因与内参基因的Ct值。各个基因的基因表达量根据公式计算。

主要观察指标：原代及传代细胞形态学观察，第1代和第2代流式细胞术结果分析，气管软骨细胞甲苯胺蓝染色结果分析，qRT-PCR和甲苯胺蓝染色鉴定骨髓间充质干细胞向气管软骨细胞分化潜能的结果分析。
统计学分析：由第一作者应用统计软件SPSS 13.0进行分析。数据采用x(_)±s表示，两组间比较采用两独立样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞是一种少见的非造血干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，是组织工程气管种子细胞研究的热点^[6]。因此，体外分离、培养及鉴定骨髓间充质干细胞尤其重要。

目前研究常用的分离培养骨髓间充质干细胞的方法有^[7]：全骨髓贴壁筛选法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法等。密度梯度离心法是使用淋巴细胞分离液将不同浓度的细胞分离，选择所需要的细胞进行单独体外培养，其不足之处是获得的细胞数量较少^[8]。免疫磁珠分选法是根据细胞表面表达不同的抗原而进行纯化，可以获得相对较高纯度的细胞，但是操作繁琐，技术复杂，易损伤细胞，且费用昂贵^[9]。全骨髓贴壁筛选法是使用骨髓直接培养，通过反复的换液，将骨髓中不能贴壁的造血干细胞等去除，而贴壁的非造血干细胞保留，经过不断的换液与传代，即可获得较纯的骨髓间充质干细胞，操作简单，不易污染，对细胞的损伤小^[10]。因此，研究采用此方法进行分离培养骨髓间充质干细胞。

对于分离培养的骨髓间充质干细胞的鉴定，方法众多，研究主要从细胞形态、细胞表型以及细胞诱导向软骨细胞分化的功能进行鉴定分析。

骨髓间充质干细胞表面抗原具有多样性，缺乏典型的造血细胞表面标记如CD19、CD34、CD45等，但表达非造血干细胞的多种黏附分子如CD44 、CD29 、CD105等，通过检测这些标记物可以进行骨髓间充质干细胞鉴定^[11-12]。研究报道显示骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44阳性率大于90%，CD45和CD34则不足10%^[13]。实验应用流式细胞学技术检测骨髓间充质干细胞第1代和第2代细胞表面抗原CD44和CD45的表达，结果显示经过不断的更新培养液并进行传代，非贴壁的造血干细胞等逐渐被去除，而贴壁的非造血干细胞的纯度则明显增加，仅培养至第2代时非造血干细胞标记物CD44阳性率几乎达到100%，而造血干细胞标记物CD45的表达极低，形态学观察显示贴壁细胞形态及生长状态良好，增殖速度快，表明经全骨髓贴壁筛选法分离培养至第2代即可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞。

正常软骨细胞主要是通过细胞外基质蛋白的合成及相关基因的表达作为特征^[14]。研究表明软骨细胞主要合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等细胞外基质成分，且在固体基质内，50%-75%是胶原和15%-30%是蛋白聚糖^[15]。实验通过甲苯胺蓝染色鉴定从气管中分离培养的细胞，结果示阳性，证明所分离获取的细胞为气管软骨细胞，可以为研究共培养时提供所需要的正常气管软骨细胞。

骨髓间充质干细胞的另一重要特性是具有多向分化的潜能，因此，在特定的条件下，可诱导其向软骨细胞分化。研究报道在单层培养时使用骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、成纤维细胞生长因子2等可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化^[16-18]。一种有前景的研究发现，与骨髓间充质干细胞单独诱导培养相比，软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养可以产生更多的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等软骨细胞特征性的细胞外基质成分^[19-20]；特别是在表达Ⅱ型胶原极低的人间充质干细胞在向软骨细胞形成时，Ⅱ型胶原的表达可以增加100甚至1 000倍^[21]；并且可以抑制间充质干细胞向肥大细胞的分化^[22]。Chen等^[23]研究显示骨髓间充质干细胞与人软骨细胞共培养1周，蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的合成显著增加。综合以上研究报道的结果，研究使用Transwell系统非接触式共培养气管软骨细胞与骨髓间充质干细胞，并在培养液中加入转化生长因子β1，体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，结果显示骨髓间充质干细胞合成软骨细胞特征性的细胞外基质成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖并表达相关的mRNA基因，表明骨髓间充质干细胞具有向气管软骨细胞分化的潜能。诱导后骨髓间充质干细胞合成软骨细胞特征性细胞外基质成分的原因除了转化生长因子β1可促进向软骨细胞的分化外，也可能与共培养时正常软骨细胞形成的微环境有关^[24]。共培养系统中，软骨细胞与骨髓间充质干细胞相互作用相互影响^[25-26]：通过非接触式共培养，软骨细胞可以自合成生长因子如转化生长因子β1、骨形态发生蛋白等促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，而骨髓间充质干细胞与新形成的软骨细胞通过接触式共培养，可被进一步诱导向软骨细胞分化，合成更多的软骨细胞外基质成分。

综上所述，实验通过全骨髓贴壁筛选法成功进行体外分离培养骨髓间充质干细胞，运用流式细胞术完成了细胞表面抗原的鉴定；并在使用转化生长因子β1的基础上，将其与气管软骨细胞经Transwell非接触式共培养，通过qRT-PCR、甲苯胺蓝染色在基因和蛋白水平鉴定，初步证明骨髓间充质干细胞具有向软骨细胞分化的潜能，为获取理想的骨髓间充质干细胞作为种子细胞应用于构建组织工程气管奠定实验基础。但是实验存在的不足之处是共培养的具体作用机制未能解决，因此，下一步仍需要深入研究。

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

Chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

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