六味地黄丸含药血清对椎间盘Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.26.015

中国组织工程研究

• 脊柱损伤基础实验 basic experiments of spinal injury • 上一篇下一篇

六味地黄丸含药血清对椎间盘Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达的影响

徐无忌¹，李悦²，原超³

1湖南中医药大学第二附属医院脊柱科，湖南省长沙市 410005
2广州中医药大学，广东省广州市 510405
3广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510360

收稿日期:2012-10-26 修回日期:2013-03-06 出版日期:2013-06-25 发布日期:2013-06-25
作者简介:徐无忌☆，男，1978年生，湖南省祁东县人，土家族，2008年广州中医药大学毕业，博士，副主任医师，讲师，主要从事脊柱疾患的中医药防治研究。 xuwuji1@126.com
基金资助:
湖南省教育厅课题(09C743)，广东省科技计划项目(83014)。

Liuwei Dihuang Wan serum influences the expression of type Ⅰ and type Ⅱ
collagen in intervertebral discs

Xu Wu-ji¹, Li Yue², Yuan Chao³

1 Department of Spine Surgery, Second Affiliated Hospital, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410005, Hunan Province, China
2 Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
3 The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510360, Guangdong Province, China

Received:2012-10-26 Revised:2013-03-06 Online:2013-06-25 Published:2013-06-25
About author:Xu Wu-ji,☆ M.D., Associate chief physician, Lecturer, Department of Spine Surgery, Second Affiliated Hospital Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410005, Hunan Province, China xuwuji1@126.com
Supported by:
Projects of Hunan Provincial Education Department, No. 09C743*; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, No. 83014*

摘要/Abstract

摘要：

背景：胶原纤维是维持椎间盘正常结构与功能的重要物质，椎间盘中胶原的类型及含量的变化，影响整个椎间盘的生理和病理状态，Ⅰ型及Ⅱ型胶原是椎间盘胶原的主要组分。
目的：观察六味地黄丸含药血清对肿瘤坏死因子α致伤兔椎间盘Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白和基因表达的影响。
方法：将15只新西兰白兔带终板的45个L2-L5椎间盘随机分为空白第1天组、空白第14天组、肿瘤坏死因子α组、中药血清组、肿瘤坏死因子α+中药血清组。后两种培养液中分别含5 μg/L肿瘤坏死因子α和体积分数10%六味地黄丸血清，培养14 d后收集髓核和纤维环观察。
结果与结论：RT-PCR和Western Blot检测结果表明，随着培养时间的延长，纤维环中Ⅰ型胶原及髓核中Ⅱ型胶原蛋白和基因表达明显降低；加入肿瘤坏死因子α可加速这种变化，而含药血清可延缓Ⅰ，Ⅱ型胶原蛋白和基因表达变化。提示六味地黄丸可通过稳定Ⅰ，Ⅱ型胶原蛋白和基因表达，对椎间盘细胞外基质具有保护作用。

关键词: 骨关节植入物, 脊柱损伤基础实验, 六味地黄丸, 椎间盘源性腰痛, 六味地黄丸, Ⅰ型胶原, Ⅱ型胶原, 椎间盘, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Collagen fiber is the main subject to maintain the structural integrity and its physiological function, the type and content of the collagen in intervertebral disc will influence the physical and pathological condition of entire intervertebral disc. Type Ⅰ and type Ⅱcollagen are the main components of intervertebral disc collagen fiber.
OBJECTIVE: To observe the effect of Liuwei Dihuang Wan-containing serum on expression of type Ⅰ and type Ⅱ collagen and genes of the intervertebral discs in tumor necrosis factor-α injured rabbit.
METHODS: Forty-five L2-L5 intervertebral discs harvested from 15 rabbits were randomly divided into five groups: control 1st day, control 14th day, tumor necrosis factor-α group, Liuwei Dihuang Wan-containing serum group and tumor necrosis factor-α+ Liuwei Dihuang Wan-containing serum group. The culture medium in the Liuwei Dihuang Wan-containing serum group and tumor necrosis factor-α+ Liuwei Dihuang Wan-containing serum group contained
5 μg/L tumor necrosis factor-α and 10% Liuwei Dihuang Wan-containing serum. The nucleus pulposus and annulus fibrosus were collected after cultured for 14 days.
RESULTS AND CONCLUSION: Reverse transcription-PCR and Western Blot showed that with the culture time prolonging, the expressions of type Ⅰ collagen and genes in nucleus pulposus and type Ⅱ collage and genes in the annulus fibrosus were significantly decreased; Tumor necrosis factor-α could aggravate the change, while Liuwei Dihuang Wan-containing serum could delay the changes. The results indicate that Liuwei Dihuang Wan can protect the extracellular matrix of intervertebral discs through stabilizing the expressions of type Ⅰ and type Ⅱ collagen and genes.

Key words: bone and joint implants, basic experiment of spinal injury, Liuwei Dihuang Wan, discogenic low back pain, type Ⅰ collagen, type Ⅱ collagen, intervertebral disc, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

徐无忌，李悦，原超. 六味地黄丸含药血清对椎间盘Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.26.015.

Xu Wu-ji, Li Yue, Yuan Chao. Liuwei Dihuang Wan serum influences the expression of type Ⅰ and type Ⅱ
collagen in intervertebral discs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.26.015.

图/表（结果） 4

参考文献

[1] McBeth J, Jones K. Epidemiology of chronic musculoskeletal pain.Best Pract Res Clin Rheumatol. 2007;21(3):403-425.

[2] Dagenais S, Caro J, Haldeman S.A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally.Spine J. 2008;8(1):8-20.

[3] Kotov AS, Eliseev IuV.Low back pain.Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova. 2012;112(5):90-93.

[4] Crock HV.Internal disc disruption. A challenge to disc prolapse fifty years on.Spine (Phila Pa 1976). 1986;11(6):650-653.

[5] Freemont AJ.The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain.Rheumatology (Oxford). 2009;48(1):5-10.

[6] Xu WJ,Li Y,Wu GB,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15 (46):8565-8568.徐无忌,李悦,吴官保,等.六味地黄丸含药血清对软骨终板蛋白多糖的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15 (46):8565-8568.

[7] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.中华人民共和国科学技术部. 关于善待实验动物的指导性意见. 2006-09-30.

[8] Freemont AJ.The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain.Rheumatology (Oxford). 2009;48(1):5-10.

[9] Adams MA, McNally DS, Dolan P.'Stress' distributions inside intervertebral discs. The effects of age and degeneration.J Bone Joint Surg Br. 1996;78(6):965-972.

[10] McNally DS, Naish C, Halliwell M.Intervertebral disc structure: observation by a novel use of ultrasound imaging.Ultrasound Med Biol. 2000;26(5):751-758.

[11] Richardson SM, Doyle P, Minogue BM,et al. Increased expression of matrix metalloproteinase-10, nerve growth factor and substance P in the painful degenerate intervertebral disc.Arthritis Res Ther. 2009;11(4):R126.

[12] Kang JD, Georgescu HI, McIntyre-Larkin L,et al.Herniated lumbar intervertebral discs spontaneously produce matrix metalloproteinases, nitric oxide, interleukin-6, and prostaglandin E2.Spine (Phila Pa 1976). 1996;21(3):271-277.

[13] Rand N, Reichert F, Floman Y,et al.Murine nucleus pulposus-derived cells secrete interleukins-1-beta, -6, and -10 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in cell culture.Spine (Phila Pa 1976). 1997;22(22):2598-2601.

[14] Wang ERD,Wang SB. Zhongguo Yiyao Zhinan. 2008;6(15): 159-160.王额尔敦,王守彪.椎间盘源性腰痛的椎间盘形态与神经分布[J].中国医药指南,2008,6(15):159-160.

[15] Shang QS,Huang B,Sheng WH,et al. Zhongguo Jiaoxing Waike Zazhi. 2009;17(5):385-387.尚琦松,黄擘,盛文辉,等.炎性因子TNF-α及IL-18与椎间盘退变的相关性研究[J].中国矫形外科杂志,2009,17(5):385-387.

[16] Hu XJ,Shao ZW. Zhongguo Jizhu Jisui Zazhi. 2006; 16(7): 541-544.胡绪江,邵增务.外源性肿瘤坏死因子-α对腰椎间盘退变影响的实验研究[J].中国脊柱脊髓杂志,2006,l6(7):541-544.

[17] Le Maitre CL, Pockert A, Buttle DJ,et al.Matrix synthesis and degradation in human intervertebral disc degeneration. Biochem Soc Trans. 2007;35(Pt 4):652-655.

[18] Benz K, Stippich C, Fischer L,et al.Intervertebral disc cell- and hydrogel-supported and spontaneous intervertebral disc repair in nucleotomized sheep.Eur Spine J.2012;21(9):1758-1768.

[19] Duncan NA.Cell deformation and micromechanical environment in the intervertebral disc.J Bone Joint Surg Am. 2006;88 Suppl 2:47-51.

[20] Lotz JC, Hadi T, Bratton C,et al.Anulus fibrosus tension inhibits degenerative structural changes in lamellar collagen. Eur Spine J. 2008;17(9):1149-1159.

[21] Wang D, Vo NV, Sowa GA,et al.Bupivacaine decreases cell viability and matrix protein synthesis in an intervertebral disc organ model system.Spine J. 2011;11(2):139-146.

[22] Park JY, Kuh SU, Park HS,et al.Comparative expression of matrix-associated genes and inflammatory cytokines- associated genes according to disc degeneration: analysis of living human nucleus pulposus.J Spinal Disord Tech. 2011;24(6):352-357.

[23] Popovich JM Jr, Yau D, Chuang SY,et al.Exogenous collagen crosslinking of the intervertebral disc restores joint stability after lumbar posterior decompression surgery.Spine (Phila Pa 1976). 2011;36(12):939-944.

[24] Attia M, Santerre JP, Kandel RA.The response of annulus fibrosus cell to fibronectin-coated nanofibrous polyurethane- anionic dihydroxyoligomer scaffolds. Biomaterials. 2011;32(2): 450-460.

[25] Calderon L, Collin E, Velasco-Bayon D,et al.Type II collagen-hyaluronan hydrogel--a step towards a scaffold for intervertebral disc tissue engineering.Eur Cell Mater. 2010;20: 134-148.

[26] Antoniou J, Goudsouzian NM, Heathfield TF,et al.The human lumbar endplate. Evidence of changes in biosynthesis and denaturation of the extracellular matrix with growth, maturation, aging, and degeneration.Spine (Phila Pa 1976). 1996;21(10):1153-1161.

[27] Jeong JH, Lee JH, Jin ES,et al.Regeneration of intervertebral discs in a rat disc degeneration model by implanted adipose-tissue-derived stromal cells.Acta Neurochir (Wien). 2010;152(10):1771-1777.

[28] Endres M, Abbushi A, Thomale UW,et al.Intervertebral disc regeneration after implantation of a cell-free bioresorbable implant in a rabbit disc degeneration model.Biomaterials. 2010;31(22):5836-5841.

[29] Vonk LA, Kroeze RJ, Doulabi BZ,et al. Caprine articular, meniscus and intervertebral disc cartilage: an integral analysis of collagen network and chondrocytes.Matrix Biol. 2010;29(3):209-218.

[30] Yang SH, Lin CC, Hu MH,et al.Influence of age-related degeneration on regenerative potential of human nucleus pulposus cells.J Orthop Res. 2010;28(3):379-383.

[31] Le Maitre CL, Fotheringham AP, Freemont AJ,et al.Development of an in vitro model to test the efficacy of novel therapies for IVD degeneration.J Tissue Eng Regen Med. 2009;3(6):461-469.

[32] Gruber HE, Hanley EN Jr.Ultrastructure of inclusion bodies in annulus cells in the degenerating human intervertebral disc. Biotech Histochem. 2009;84(3):85-94.

[33] Korecki CL, Kuo CK, Tuan RS,et al.Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.J Orthop Res. 2009;27(6):800-806.

[34] Zhang H,Ni Q,Ren Y,et al. Zhongyi Zazhi. 2010;51(5): 409-411.张辉,倪青,任艳,等.腰痛酸软与糖尿病肾虚症状的相关性[J].中医杂志,2010,51(5): 409-411.

[35] Huang J. Henan Keji Daxue Xuebao:Yixueban. 2004;22(3): 196-197.黄娟.六味地黄汤治疗肾虚腰痛116例[J]河南科技大学学报:医学版,2004,22(3):196-197.

[36] Qian ZM. Shandong Zhongyi Zazhi. 2006;25(9):609.钱祝民.金匮肾气丸和六味地黄丸交替久服治疗慢性腰痛体会[J].山东中医杂志,2006,25(9):609.

引言

材料方法

设计：随机分组设计，对比观察。
时间及地点：组织培养于2010年6月至2011年11月在中南大学湘雅医学院高血压病研究所完成，RT-PCR检测及Western Blot测定在广州中医药大学第三附属医院细胞实验室完成。
材料：
实验动物：6月龄清洁级新西兰白兔17只，雌雄不限，体质量2.5-3.5 kg，由中南大学物中心提供。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于动善待实验动物的指导性意见》标准[7]。
药物：六味地黄丸浓缩丸(国药准字号Z20055053)，广州白云山制药总厂生产，主要成分为熟地黄、山萸肉、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻。
主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
含药血清制备：取新西兰白兔2只，以六味地黄丸浓缩丸凝悬液灌胃，按人和动物体表面积比计算动物等效给药量给药，给予0.327 g/kg中药灌胃制备含药血清，2次/d，每次间隔5 h，连续7 d，在最后1次灌胃4 h后，经心脏穿刺采血，离心后取上清液，过滤后-20 ℃分装保存备用。
建立整体椎间盘体外培养体系：无菌条件下采用后正中入路取出15只新西兰白兔带终板的45个L2-L5椎间盘，尽量去除软骨终板上附着的骨组织及韧带，保留软骨终板的完整性，连续以生理盐水，聚烯吡酮磺溶液以及含55 mmol/L 柠檬酸钠、50 mg/L庆大霉素的Hank’s液漂洗。将切取的椎间盘随机分为5组：空白第1天组、空白第14天组、肿瘤坏死因子α组、中药血清组、肿瘤坏死因子α+中药血清组，每组9个样本。椎间盘样本分组编号后置于6孔板中，放在转鼓上(转鼓的转速为 10 r/h)，以含体积分数5%胎牛血清、50 mg/L 庆大霉素、20 mmol/L柠檬酸钠的DMEM/F12培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2、100%相对湿度温箱中过夜。
将过夜后标本接种于6孔板，加入8 mL含体积分数10%胎牛血清、50 mg/L庆大霉素、25 mg/L维生素C的DMEM/F12，置于37 ℃、体积分数5%CO2、100%相对湿度温箱中培养，每2 d换液1次。其中肿瘤坏死因子α组培养液中另含5 μg/L肿瘤坏死因子α；肿瘤坏死因子α+中药血清组含5 μg/L肿瘤坏死因子α和体积分数10%六味地黄丸血清。
RT-PCR检测：于实验第1天收集空白第1天组，于实验的第14天收集其余4组髓核、纤维环，加液氮研磨成粉末状，迅速将样品转移到离心管中，按1 g∶2 mL比例悬浮于RNA抽提缓冲液(20 mmol/L tris HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA，1% SDS，0.2%巯基乙醇)，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，按1∶1比例加入水饱和苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)，上下颠倒混匀，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，反复抽提，至中间无白色界面，取上清加入2.5倍体积无水乙醇，-20 ℃沉淀15 min，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，留沉淀即总RNA，在通风柜中干燥10 min，加入20 μL DEPC处理的双蒸灭菌水，得到总RNA，于-20 ℃保存。取 1 μg总RNA，采用大连宝泰克公司反转录试剂盒，按其说明书进行mRNA反转录。取2 μg cDNA模版，加入20 pmol引物，根据美国NCBI核酸数据库中Ⅰ型胶原(Genbank序列号D49399)、Ⅱ型胶原(Genbank序列号NM001195671.1)基因序列的保守区，使用设计软件Primer5.0设计引物和探针，合成引物和探针，见表1。配制成25 μL反应体系，在TaqDNA聚合酶催化下分别进行β-actin基因及Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原聚合酶链反应。β-actin解链温度51 ℃，35个循环，产物大小142 bp。Ⅰ型胶原解链温度55 ℃，35个循环，产物大小403 bp。Ⅱ型胶原解链温度56 ℃，35个循环，产物大小229 bp。合成cDNA，实时荧光反转录-聚合酶链反应检测。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果由HMIAS-2000分析仪照相后测算条带积分吸光度，以目的基因与β-actin条带吸光度比值作为基因相对表达量。Sequence Detection 1.71软件保存和分析实验结果。

Western Blot检测：所有步骤均在4 ℃下进行，首先进行蛋白提取，-20 ℃保存。采用Bradford法测定蛋白浓度。SDS-PAGE胶板制作，同时准备上样(总蛋白不超过50 μg；配制、混匀；煮沸，5 min；离心；Pretaining Marker，煮沸，5 min)，等体积(标本+上样缓冲液)加样后电泳，夹心制作、标记凝胶，标记聚偏氟乙稀膜，15- 20 mA转膜过夜。加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60 min，立即加入稀释好的一抗，缓慢摇动孵育过夜。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10 min。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤10 min，共洗涤3次，吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，4 ℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1 h，回收二抗。化学增强发光操作，扫描，软件分析、统计。
主要观察指标：纤维环及髓核中Ⅰ，Ⅱ型胶原蛋白、RNA表达情况。
统计学分析：由第二作者采用SPSS 12.0软件进行统计处理，数据以x(_)±s表示，组间比较行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘退变是椎间盘源性腰痛的主要原因和病理基础，目前认为，椎间盘退变可能通过以下机制导致椎间盘源性腰痛症状的发生^[8]：①力学机制。正常椎间盘在生理负重下不会刺激窦椎神经，但由于退变导致纤维环撕裂、松弛，破坏椎间盘的稳定性，使腰椎出现纤维位移或整体失衡性位移，对窦椎神经的感觉神经末梢产生机械刺激而引起疼痛^[9]。同时机械压力可将椎间盘内的炎性递质通过终板泵入邻近椎体刺激相应敏感神经而引起疼痛。单纯的椎间盘内机械压力的变化能否引起疼痛目前仍存在争议，若同时合并椎间盘内伤害性神经纤维的长入和炎性介质的刺激，痛阈下降，则轻微的机械刺激也可能诱发腰痛的产生^[10]。②化学机制。椎间盘病变过程中释放大量的细胞因子，如前列腺素、白细胞介素、组胺、5-羟色胺等，这些物质对神经末梢产生化学性刺激引起炎性反应而产生疼痛。Richardson等^[11]发现椎间盘源性下腰痛患者椎间盘内的基质金属蛋白10、白细胞介素1、神经生长因子、P物质的含量显著高于正常人的椎间盘。化学性物质的来源有外源性和内源性两种^[12-13]。③神经机制。正常腰椎间盘仅纤维环外1/3和后纵韧带内含有神经末梢，是属于交感神经的窦椎神经。椎间盘退变导致椎间盘源性腰痛时，髓核变性致纤维环应力失衡和内层纤维环断裂，纤维血管组织侵入断裂处，继而肉芽组织对裂隙的修复，同时伴随着小的神经纤维通过裂隙长入到椎间盘深层，该神经纤维缺乏髓鞘，因而较正常的神经纤维更易感受环境变化刺激而引起疼痛^[14]。从文献研究不难看出，椎间盘的力学性能下降是椎间盘退变的重要环节。

肿瘤坏死因子α是肿瘤坏死因子家族中发现最早，研究较多的一种。一般认为，它由单核细胞和巨噬细胞产生，不仅具有选择性杀伤某些肿瘤细胞的功能，而且有多种免疫调节作用，尤其是参与炎症反应。研究结果显示，椎间盘退变时椎间盘组织中肿瘤坏死因子α表达增多^[15]。通过向兔椎间盘内注射外源性肿瘤坏死因子α发现，肿瘤坏死因子α可以影响蛋白聚糖含量的变化导致椎间盘退变，小剂量注射短期内就可以引起蛋白多糖含量的明显下降^[16]。Le Maitre等^[17]认为肿瘤坏死因子α等细胞因子是在炎症反应和新生血管等刺激下通过髓核细胞的内源性合成而存在于椎间盘内的，当肿瘤坏死因子α表达过高时，可以刺激大部分硫酸化和含有硫酸软骨素的蛋白多糖降解。作者在既往的体外实验中，通过给予肿瘤坏死因子α干预建立椎间盘退变模型，发现退变椎间盘软骨终板结构不同程度破坏，蛋白多糖总量及其各成分水平不同程度下降，并随时间延长变化更为明显。

正常椎间盘主要由髓核、纤维环及二者之间的过渡区构成。髓核主要含有Ⅱ型胶原(主要成分)、Ⅴ型、Ⅵ型(15%-20%)、Ⅸ型(1%-2%)及Ⅺ型胶原(30%)；纤维环主要含有Ⅰ型胶原(主要成分)、Ⅱ型胶原(主要成分)和少量的Ⅲ型、Ⅴ型(3%)、Ⅵ型(10%)、Ⅸ型、Ⅺ型胶原(1%-2%)，其中Ⅰ型胶原占纤维环胶原干质量的70%，占髓核胶原干质量的20%^[18-20]。

Ⅰ型胶原主要位于纤维环外层，是椎间盘承受张力和剪力的主要功能胶原。髓核和纤维环内层的胶原绝大多数是Ⅱ型胶原，承受和吸引压力。Ⅰ型胶原分子有12-15个羟赖氨酸残基，Ⅱ型胶原氨基酸构成上与Ⅰ型胶原有明显的不同，其分子中羟赖氨酸残基含量达36-72个，由于二者亚氨基酸含量上的差异，因而Ⅰ型胶原分子的水含量较低，能够耐受强的张力和剪力，而对压力耐受较差。Ⅱ型胶原较高的亚氨基酸含量决定了其糖化作用高，使水分子在亚氨基酸的侧链聚集，含水量高，更适于变形，使胶原更适于承受压力^[21-25]。Ⅰ型和Ⅱ型胶原的定量分布大多具有相对组织特异性，在维持椎间盘正常的力学特性中发挥着重要的作用。当椎间盘发生退变时，不仅椎间盘的生化成分和比例发生变化，纤维环及髓核内细胞也逐渐凋亡、减少，类软骨细胞逐渐分化成为纤维样细胞外观，功能上由表达Ⅱ型胶原改为表达Ⅰ型胶原，导致髓核内出现Ⅰ型胶原。髓核内与Ⅱ型胶原分泌合成相关的细胞，经常受到失稳状态中作用力、各种炎症递质、自由基等外来因素的影响，基因低表达，新的胶原合成明显下降，原有胶原在退变时被激活的胶原酶及其他各种中性蛋白酶催化分解，椎间盘内Ⅱ型胶原的分解代谢占据主导地位，导致椎间盘胶原结构出现变性，损坏，对各种应力的耐受能力明显降低，导致整个椎间盘的形态结构发生病理变化，功能减退而致病，Ⅰ型胶原基因表达逐渐增加和Ⅱ型胶原基因表达逐渐降低的改变与椎间盘退变程度相关^[26-30]。髓核与纤维环中胶原类型以及胶原含量的差异必然引起椎间盘不同区域承受负荷和应力的能力发生，从而增加机械损伤的机会，促使椎间盘退变^[31-33]。实验发现通过给予肿瘤坏死因子α干预，体外培养的椎间盘纤维环中Ⅰ型、Ⅱ型胶原及髓核中Ⅱ型胶原 mRNA及蛋白表达明显下调(P < 0.05)，髓核中的Ⅰ型胶原 mRNA及蛋白表达明显上调(P < 0.05)，这说明肿瘤坏死因子α可导致体外培养的椎间盘发生退变，类似于椎间盘自然退变过程。

传统医学中并无椎间盘源性腰痛这一诊断，但根据其病理特点，可将其归属为“腰痛”范畴。在长期对于腰痛的诊治过程中，传统医学积累了丰富的经验，认为腰痛是以肾虚为本，纵属实邪，亦每在肾虚的基础上受邪，传统中医认为：肝主筋，肾主骨。椎间盘属于中医“筋”的范畴，椎间盘源性腰痛发生于下腰部，腰为肾之府，因而，腰痛多与肾虚相关^[34]，正如《证治准绳》所说，腰痛“有风、有湿、有寒、有热、有挫闪、有瘀血、有滞气、有痰积，皆标也；肾虚，其本也”。补肾是历代医家治疗腰痛的基本方法之一。六味地黄丸便为补肝肾名方，本方出于宋•钱乙《小儿药证直决》。临床上通过使用补益肝肾的六味地黄丸为基础方治疗腰痛可取得良好效果^[35-36]。作者既往的实验发现六味地黄丸含药血清可通过保护软骨终板超微结构，缓解由外源性肿瘤坏死因子α所导致的软骨终板结构破坏和蛋白多糖含量的下降，从而减缓软骨终板的退变。实验发现六味地黄丸含药血清部分缓解由肿瘤坏死因子α干预所导致的体外培养的椎间盘胶原含量以及类型的变化，这说明了六味地黄丸的部分作用机制所在，即通过保护椎间盘的细胞外基质延缓椎间盘的退变。

实验通过建立稳定的椎间盘体外培养体系，并给予中药血清干预，证实了六味地黄丸可以稳定椎间盘胶原含量，从而减缓了椎间盘的退变，为中医补肾法治疗椎间盘源性腰痛提供了实验依据，也为解决椎间盘源性腰痛提供新的治疗方法。但实验仅对肿瘤坏死因子α及六味地黄丸血清干预的椎间盘体外培养体系中胶原成分变化进行了研究，其具体机制如对细胞信号通路、髓核细胞凋亡的影响有待进一步研究。

六味地黄丸含药血清对椎间盘Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达的影响

Liuwei Dihuang Wan serum influences the expression of type Ⅰ and type Ⅱ
collagen in intervertebral discs

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	吕振, 白金柱. 基于McKenzie技术的腰椎运动链训练应用于腰椎间孔镜术后分期康复的前瞻性研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1398-1403.
[2]	高燕, 赵力聪, 赵洪增, 朱园园, 李杰, 桑德恩. 慢性椎间盘源性下腰痛患者脑静息态低频振幅的改变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1160-1165.
[3]	刘志超, 张帆, 孙旗, 康晓乐, 袁巧妹, 柳根哲, 陈江. 不同静水压下人椎间盘髓核细胞的形态和活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1172-1176.
[4]	杨洋, 姚羽, 沈孝天, 刘佳佳, 薛建华. 退变腰椎间盘中白细胞介素21的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 690-694.
[5]	徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 713-718.
[6]	解志锋, 刘清, 刘冰, 张涛, 李琨, 张春秋, 孙艳芳. 腰椎间盘疲劳损伤的生物力学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 339-343.
[7]	梁彦, 赵永飞, 朱震奇, 刘海鹰, 毛克亚. 微创经椎间孔腰椎椎体间融合固定治疗椎间盘源性脊柱侧凸：冠状面和矢状面平衡的2年随访[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 409-413.
[8]	李岳飞, 李瑞, 任佳彬, 刘鑫, 孙宁, 刘维克, 毕经纬, 孙兆忠. 三维CT指导经皮内镜后外侧入路治疗胸椎间盘突出症建立良好的骨性通道[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3354-3359.
[9]	吴彦禹, 张春霖, 邵成龙, 严旭, 刘小康, 王永魁, 李东哲. 二维距离法和三维体积法对内镜下微创颈椎管成形后突出椎间盘再吸收的定量测量[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3390-3394.
[10]	钟远鸣, 何炳坤, 吴卓檀, 吴思贤, 万通, 钟锡锋. 芍药甘草汤治疗腰椎间盘突出症早期疼痛作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3194-3201.
[11]	付远飞, 何升华, 赖居易, 孙志涛, 冯华龙, 蓝志明. 地龙提取物抑制核因子κB信号通路延缓椎间盘髓核细胞的退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 264-268.
[12]	张凯, 张晓勃, 施锦涛, 王克平, 周海宇. 间充质干细胞治疗椎间盘退行性疾病：基于Web of Science数据库的文献计量及可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3031-3038.
[13]	张明彦, 刘向阳, 常磊, 陈晶, 沈雄杰, 刘斌, 彭帅, 张超, 吴环宇, 朱峰, 牟海频. 腰椎融合过程中终板损伤与术后融合器脱出的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(18): 2856-2862.
[14]	侯宇龙, 王晶石, 王旭凯. 牛膝治疗腰椎间盘突出症潜在作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2734-2739.
[15]	张冲锋, 李现林, 彭卫兵, 贾宏声, 蔡磊. 中药、针刺、灸法和推拿等中医疗法治疗血瘀型腰椎间盘突出症的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2781-2788.

六味地黄丸含药血清对椎间盘Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达的影响

Liuwei Dihuang Wan serum influences the expression of type Ⅰ and type Ⅱ collagen in intervertebral discs

PDF

可视化

被引次数

引用本文

使用本文

Liuwei Dihuang Wan serum influences the expression of type Ⅰ and type Ⅱ
collagen in intervertebral discs