人羊膜间充质干细胞移植骨髓抑制小鼠的造血功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.010

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (23): 4248-4255.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.010

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人羊膜间充质干细胞移植骨髓抑制小鼠的造血功能

姚观平^1，2，余丽梅^1，2，范振海¹，方宁¹，任飞^1，2，罗娇^1，2，张小雨^1，2，王钰莹¹，刘金伟¹

1 遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室，贵州省遵义市 563003
2 遵义医学院贵州省基础药理重点实验室，贵州省遵义市 563003

出版日期:2013-06-04 发布日期:2013-06-04
通讯作者: 余丽梅，博士，教授，硕士生导师，遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室，贵州省遵义市 563003；遵义医学院贵州省基础药理重点实验室，贵州省遵义市 563003
作者简介:姚观平★，男，1984年生，湖北省黄冈市人，汉族，遵义医学院在读硕士，主要从事干细胞增殖分化的药物调控的研究。 yaoguanpin@sina.com
基金资助:
国家自然科学基金(30860338)；贵州省科学技术实验室建设平台(209.001.106.01)项目号。

Human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation improveshematopoietic function of myelosuppression mice

Yao Guan-ping^{1, 2}, Yu Li-mei ^{1, 2}, Fan Zhen-hai ¹, Fang Ning ¹, Ren Fei ^{1, 2}, Luo Jiao ^{1, 2}, Zhang Xiao-yu ^{1, 2}, Wang Yu-ying¹, Liu Jin-wei ¹

1 Key Laboratory of Cell Engineering of Guizhou Province, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
2 Key Laboratory of Basic Pharmacology of Guizhou Province, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou Province, China

Online:2013-06-04 Published:2013-06-04
Contact: Yu Li-mei, M.D., Professor, Master’s supervisor, Key laboratory of Cell Engineering of Guizhou Province, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou Province, China; Key Laboratory of Basic Pharmacology of Guizhou Province, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou Province, China ylm6567@yahoo.com.cn
About author:Yao Guan-ping★, Studying for master’s degree, Key Laboratory of Cell Engineering of Guizhou Province, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou Province, China; Key Laboratory of Basic Pharmacology of Guizhou Province, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou Province, China yaoguanpin@sina.com.
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 30860338*;Guizhou Province Science and Technology Laboratory Building Platform, No.209.001.106.01*

摘要/Abstract

摘要：

背景：大剂量化疗药物可造成严重的骨髓损伤，除药物治疗外，干细胞移植已越来越多的用于骨髓损伤的治疗。
目的：观察人羊膜间充质干细胞移植对顺铂所致骨髓抑制小鼠造血功能恢复的影响。
方法：体外培养人羊膜间充质干细胞，雌性ICR小鼠被随机分为3组，除空白组外，其余小鼠腹腔注射顺铂诱导ICR小鼠制备骨髓抑制模型，建模后人羊膜间充质干细胞移植组小鼠尾静脉注射人羊膜间充质干细胞3.0×10⁵/g，空白组和模型组注射等量PBS。
结果与结论：连续给予顺铂7 d后，ICR小鼠体质量明显降低，但模型组与人羊膜间充质干细胞移植组之间差异无显著性意义。模型组小鼠外周血白细胞、淋巴细胞、单个核细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积和血小板等水平明显低于空白组(P < 0.01)，于首次给顺铂后第21天开始恢复。人羊膜间充质干细胞移植组外周血的上述指标较模型组提前7 d开始恢复，第21天时，已接近或达到空白组水平；与空白组相比，人羊膜间充质干细胞移植后的一两天及移植后的2周出现了一过性的白细胞增高和血小板数增加。第24天，人羊膜间充质干细胞移植组小鼠股骨髓腔冲洗液有核细胞数明显高于模型组(P < 0.05)，骨髓组织病理学检查结果也显示，人羊膜间充质干细胞移植组小鼠股骨骨髓组织结构明显改善，与空白组相似，骨髓细胞数明显增多，可见较多的巨核细胞，且人羊膜间充质干细胞移植组后2周，骨髓组织可见分布较广的小鼠抗人核单克隆抗体-FITC阳性的移植细胞定植。以上结果表明，人羊膜间充质干细胞移植治疗较早地改善顺铂所致骨髓抑制小鼠的造血功能。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 人羊膜间充质干细胞, 顺铂, 骨髓抑制, 造血功能, 小鼠, 白细胞, 红细胞, 淋巴细胞, 单个核细胞, 血红蛋白, 红细胞压积, 血小板, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: High-dose chemotherapy often results in severe bone marrow damage. Beside medicines, stem cells transplantation has also been as a strategy for the treatment of bone marrow damage.
OBJECTIVE: To investigate the effects of human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation on the hematopoietic function of myelosuppression mice induced by cisplatin.
METHODS: Human amnion-derived mesenchymal stem cells were cultured in vitro. The female Imprinting Control Region mice were divided into three groups. Excepted for the mice in the blank group, the mice in the other groups were intraperitoneal injected with cisplatin to make the myelosuppression Imprinting Control Region mice, then the 3.0×105/g human amnion-derived mesenchymal stem cells were injected into the mice in the human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation group through the caudal vein, and PBS solution in the same dose was injected in the mice of blank group and model group.
RESULTS AND CONCLUSION: On day 7, the body weight of Imprinting Control Region mice was reduced after administrated with cisplatin for 7 days, there was no significant difference between model group and human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation group. The number of white blood cells, lymphocytes,mononuclear cells, red blood cells, hemoglobin, hematocrit and platelet of peripheral blood in the model group were significantly lower than those in the blank group (P < 0.05), then the indexes above began to recover on day 21 after cisplatin treatment. The recovery of the indexes above of the peripheral blood in the human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation group was 7 days earlier than that in the model group, and the indexes above were recovered to normal level at 21 days; compared with blank group, the number of white blood cells and platelet in the human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation group was transiently increased at 1-2 days before transplantation and 2 days after transplantation. At 24 days after transplantation, the number of bone marrow karyocytes in human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation group was significantly higher than that in the model group (P < 0.05). Bone marrow histopathological testing results showed that the mice femur bone marrow organizational structure in the human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation group was significantly improved. Compared with blank group, the number of bone marrow nucleated cells, especially megakaryocytes, was higher in human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation group, and at 2 weeks after human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation, many mouse anti-human nuclei monoclonal antibody-FITC positive cells were colonized in myeloid tissue. These results showed that human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation can remarkably ameliorate hematopoietic function in cisplatin induced myelosuppression mice.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, human amniotic mesenchymal stem cells, cisplatin, bone marrow suppression, hematopoietic function, mice, white blood cells, red blood cells, lymphocytes, mononuclear cells, hemoglobin, hematocrit, platelet, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R318

姚观平，余丽梅，范振海，方宁，任飞，罗娇，张小雨，王钰莹，刘金伟. 人羊膜间充质干细胞移植骨髓抑制小鼠的造血功能[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(23): 4248-4255.

Yao Guan-ping, Yu Li-mei, Fan Zhen-hai, Fang Ning, Ren Fei, Luo Jiao, Zhang Xiao-yu, Wang Yu-ying, Liu Jin-wei. Human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation improveshematopoietic function of myelosuppression mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(23): 4248-4255.

图/表（结果） 7

2.1 人羊膜间充质干细胞的形态学特点与波形蛋白表达 羊膜来源细胞分离后，用含体积分数1%自体脐血血清加体积分数9%胎牛血清的L-DMEM培养基的原代细胞，72 h全量换液，培养第四五天，贴壁细胞融合可达80%-90%，传代培养至第三四代，细胞形态均一，呈梭形，放射状或漩涡状排列，见图1A，人羊膜间充质干细胞增殖迅速，三四天细胞融合度可达100%。免疫细胞化学染色后，显微镜下观察可见传代培养三四代人羊膜间充质干细胞形态均一，95%以上细胞均表达波形蛋白，见图1B。

2.2 人羊膜间充质干细胞细胞表型特征 流式细胞仪检测结果显示：人羊膜间充质干细胞高表达CD29、CD44、CD73、CD166和CD49d，不表达CD34和CD45，见图2，其中表达CD44和CD73的阳性细胞比例大于90%。

2.3 人羊膜间充质干细胞移植对小鼠一般状况的影响 给予顺铂前第0天开始检测小鼠体质量，与空白组比较，连续注射顺铂，第3天开始小鼠体质量明显下降，于第7-9天降至最低，停止给药后，模型组和人羊膜间充质干细胞移植组小鼠体质量有所恢复，见图3，但明显低于空白组，模型组小鼠出现明显的活动迟缓、倦卧，毛发竖立、无光泽，精神状态差、摄食和饮水量减少；而人羊膜间充质干细胞移植组小鼠活动有所改善，毛发较有光泽，精神状态较好。模型组与人羊膜间充质干细胞移植组动物24 d存活率均为80%，空白组则无一动物死亡。3组小鼠均未见明显皮肤损伤和口腔黏膜损伤，与空白组比较，模型组与人羊膜间充质干细胞移植组肝指数、脾指数均显著降低，模型组与人羊膜间充质干细胞之间差异则无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4人羊膜间充质干细胞移植对骨髓抑制小鼠外周血象的影响 见图4A-C，图5A-C。与空白组比较，连续给予顺铂的模型组和人羊膜间充质干细胞移植组小鼠，第8天，外周血白细胞、淋巴细胞、红细胞、血小板数和血红蛋白、红细胞压积值均显著降低(P < 0.05)。模型组血小板于第10天，白细胞、红细胞和血红蛋白、红细胞压积于第21天降至最低，第24天仅淋巴细胞、血小板和红细胞压积恢复至空白组水平。而人羊膜间充质干细胞移植组，人羊膜间充质干细胞移植后2 d内白细胞数出现一过性增高，此后白细胞数一直保持于空白组水平，未出现明显降低；第14天，淋巴细胞、红细胞、血红蛋白、血小板数和红细胞压积值已开始逐渐恢复，第21天，红细胞数和血红蛋白、红细胞压积值已恢复至空白组水平，21-24 d血小板出现一过性增高后恢复至空白组水平。由此可见，人羊膜间充质干细胞移植治疗后顺铂引起骨髓抑制导致的外周血中“三系”的减少受到遏制，尤其是白细胞未出现明显降低，且红细胞、淋巴细胞的恢复提前至少7 d。

2.5人羊膜间充质干细胞移植对骨髓抑制小鼠股骨髓腔冲洗液有核细胞数的影响 小鼠股骨髓腔冲洗液有核细胞数主要反映髓腔中的有核细胞数。给予顺铂24 d小鼠单侧股骨骨髓细胞计数结果显示，与空白组相比，模型组小鼠骨髓有核细胞数减少39.44%[(23.53±4.55)，(14.25±1.48)×10⁶/股骨，(P < 0.05)]，而人羊膜间充质干细胞移植组骨髓细胞数(18.96±1.39)×10⁶/股骨]较模型组增多(P < 0.05)，与空白组差异无显著性意义。
2.6人羊膜间充质干细胞移植后对骨髓抑制小鼠骨髓组织形态学的改变 见图6。

给予顺铂14 d，股骨组织苏木精-伊红染色后，镜下观察可见，空白组小鼠股骨骨髓组织着色均匀，骨膜、骨小梁、骨髓腔及骨髓内细胞形态正常，结构清晰，骨髓腔内细胞丰富。模型组股骨骨髓组织结构破坏明显，骨髓中细胞数明显减少，见大量空泡样结构。与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植组可见明显、活跃的骨髓增生，骨髓腔内细胞数明显增加，骨小梁结构较完整，可见巨核细胞、成熟红细胞等各种类型血细胞，仅见较少的空泡样改变。第24天，模型组小鼠股骨组织结构和骨髓细胞数虽有一定改善，但明显尚未达到空白组状态，而人羊膜间充质干细胞移植组小鼠骨髓组织形态学与空白组比较差异无显著性意义，骨髓腔中可见较多的巨核细胞。
2.7人羊膜间充质干细胞在小鼠骨髓组织的定植、分布 MAB1281-FITC免疫荧光染色结果显示，人羊膜间充质干细胞移植后2周(第21天)可见大量人羊膜间充质干细胞植活，MAB1281阳性细胞核呈亮绿色荧光，主要分散于骨髓组织骨小梁、骨髓腔和骨内膜处，见图7。而模型组和空白组均未见亮绿色MAB1281阳性细胞分布。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2011年9至11月在遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室完成。
材料：
人羊膜标本来源：实验所用人羊膜标本，由遵义市妇幼保健院提供，选取健康足月剖腹产产妇，经知情同意，产妇及家属交由医院自行处理的胎盘，HBV、HCV、HIV、梅毒检测均为阴性者。
ICR小鼠：SPF级七八周龄雌性ICR小鼠32只，体质量18-22 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2009-0004，合格证号：0222459。按照中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》饲养和处理动物^[13] 。
人羊膜间充质干细胞对顺铂所致的骨髓抑制小鼠造血功能影响实验中主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

人羊膜间充质干细胞的分离、培养：参照文献[14]方法，用含0.02%EDTA的0.5 g/L胰蛋白酶和0.075 g/L DNaseI 加上0.75 g/L的胶原酶消化剪碎的人羊膜组织，分离人羊膜间充质干细胞，按1×10¹⁰ L^-1的细胞浓度，用含体积分数1%自体脐血血清和体积分数9%胎牛血清的LG-DMEM培养基接种培养，置于37 ℃，体积分数5%CO₂，饱和湿度的CO₂孵箱中培养。差速贴壁、传代培养，纯化人羊膜间充质干细胞，取培养至第三四代的80%左右融合度的人羊膜间充质干细胞，2.5 g/L胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液消化后，离心，细胞沉淀用PBS重悬，用于细胞表型鉴定和细胞移植。
人羊膜间充质干细胞鉴定：培养至第三四代的人羊膜间充质干细胞，倒置相差显微镜下观察其形态与生长情况，并用流式细胞仪检测其表面分子标志。取1×10⁶个人羊膜间充质干细胞悬液，分别加入小鼠抗人CD分子PE或FITC标记的单克隆抗体及其同型对照，室温下避光孵育、离心、10 g/L多聚甲醛PBS固定后，混匀，FACS Calibur流式细胞仪检测CD29、CD44、CD73、CD166、CD49d阳性细胞数和CD34、CD45阴性细胞数，每管采集细胞数≥20 000个，Cell Quest软件分析。
免疫细胞化学染色：第三四代人羊膜间充质干细胞爬片，PBS冲洗、40 g/L多聚甲醛固定，0.3% Triton-X100作用15 min，体积分数3%H₂O₂灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗，正常羊血清封闭30 min，小鼠抗人波形蛋白抗体室温孵育1 h后，滴加鼠兔通用型二抗室温孵育，DAB显色，苏木精复染、封固，光学显微镜下观察表达波形蛋白棕色颗粒的人羊膜间充质干细胞数，细胞纯度均大于95%。
小鼠骨髓抑制模型的建立及实验分组：参照文献[15]方法，SPF级条件下饲养ICR雌性小鼠32只，体质量18-22 g，随机分为空白组(n=8)、模型组(n=12)和人羊膜间充质干细胞移植组(n=12)。模型组小鼠腹腔注射顺铂溶液3 mg/(kg•d)，1次/d，连续7 d，诱导小鼠产生骨髓抑制。以实验开始前一天记为0 d，首次注射顺铂当日为第1天，末次给予顺铂次日，即第8天，人羊膜间充质干细胞移植组小鼠建模后尾静脉缓慢注射1.0×10¹⁰ L^-1的人羊膜间充质干细胞3.0×10⁵/g，空白组和模型组小鼠则注射等体积PBS。
外周血血常规检查与骨股髓腔有核细胞计数：分别于首次注射顺铂后第8，10，14，21和24天，取尾静脉血20 µL置于130 µL肝素抗凝稀释液中，充分混匀。用XS-800i系统全自动全血细胞分析仪检测小鼠外周血白细胞、淋巴细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积和血小板的变化。第24天(即人羊膜间充质干细胞移植第17天)处死小鼠，取右侧股骨，用1 mL生理盐水冲出全部股骨骨髓细胞，制成骨髓细胞悬液。体积分数3%冰醋酸裂解红细胞后，低速离心后，用Vi-CELLTM XR细胞计数仪计数股骨髓腔冲洗液有核细胞数。
骨髓组织病理学检查：给予顺铂第14和第24天，取小鼠左侧股骨浸泡于含5.5%EDTA-2K的40 g/L多聚甲醛固定液中，4 ℃固定、脱钙20 d，石蜡切片苏木精-伊红染色，观察股骨骨髓组织形态学变化。另取股骨组织石蜡切片，脱蜡、水化、冷丙酮固定，室温晾干，PBS冲洗，0.3% TritonX-100室温处理15 min，体积分数3%H₂O₂室温避光孵育10 min，经PBS洗涤，微波修复，PBS再洗涤后，山羊血清室温封闭30 min，滴加MAB1281(1∶50，1%BSA的PBS液稀释)50 μL，4 ℃孵育过夜，FITC标记的羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，缓冲甘油封固，荧光显微镜下观察、拍照。空白对照片以PBS替代一抗。
主要观察指标：①人羊膜间充质干细胞形态与表型特征及纯度。②小鼠体质量等一般状况和外周血血象。③股骨骨髓有核细胞数。④股骨骨髓组织形态学变化。⑤人羊膜间充质干细胞骨髓内定植情况。
统计学分析：所有数据均采用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料以x(_)±s表示，采用单因素方差分析进行检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

抗肿瘤药物顺铂产生的骨髓抑制，可引起外周血白细胞、红细胞、淋巴细胞和血小板的明显减少^[16] ，这与其损害骨髓微环境，损伤骨髓基质细胞、造血干细胞，减少造血细胞生长因子和抑制骨髓造血重建活性等有关^[17] 。外周血象即能直接反映机体血液细胞数量和分类，也能间接反映骨髓造血功能，是评价机体造血功能变化的重要指标。实验采用腹腔注射大剂量顺铂，连续用药7 d后，与用药前和空白组比较，顺铂诱导的模型组小鼠外周血白细胞、淋巴细胞、红细胞、血小板、血红蛋白和红细胞压积均明显降低，小鼠体质量也显著下降，表明产生了明显的骨髓抑制。
人羊膜间充质干细胞由于缺乏特异性标志，难以直接分离、纯化，因而实验采用二酶消化法联合差速贴壁、传代培养纯化人羊膜间充质干细胞[10，14]，培养至第三四代的人羊膜间充质干细胞呈典型的梭型特征，并均一地表达波形蛋白，流式细胞术分析结果也显示，人羊膜间充质干细胞表达CD29、CD44、CD73、CD166和CD49d，而不表达CD34和CD45，尤其是CD44与CD73高表达在90%以上，均符合以往文献中报道的人羊膜间充质干细胞人羊膜间充质干细胞表型特征^[18-23] 。
实验结果显示，与模型组比较，人羊膜间充质干细胞组小鼠外周血“三系”细胞减少明显较轻，甚至白细胞数与空白组水平相当；更为突出的是，与模型组比较，人羊膜间充质干细胞移植后骨髓抑制小鼠外周血象的恢复提前7 d；第21天，外周血白细胞、淋巴细胞、红细胞、血小板、血红蛋白和红细胞压积均已恢复至正常水平，而模型组小鼠才开始恢复。人羊膜间充质干细胞移植后2周，可见较多人细胞来源的MAB1281阳性细胞定植于骨髓组织，提示移植的人羊膜间充质干细胞在骨髓组织参与了骨髓造血功能的修复。股骨组织切片的病理组织学检查结果进一步证实，人羊膜间充质干细胞移植促进顺铂引起骨髓损伤小鼠造血功能的恢复，可见骨髓组织结构的显著改善，骨髓细胞数明显增加，空泡样改变显著减少，人羊膜间充质干细胞移植17 d，人羊膜间充质干细胞移植小鼠的骨髓组织形态学改变基本恢复至正常状态，与其外周血血象的恢复一致。骨髓有核细胞数量多，表明未成熟的血细胞数量较多，反映骨髓的造血功能较好；尤其是见到较多的巨核细胞，这也较好的解释了外周血检测到的一过性血小板增高，然而这种血小板增高的意义尚不清楚，有待进一步研究。股骨髓腔冲洗液骨髓有核细胞计数结果也充分证实了人羊膜间充质干细胞移植治疗后，骨髓损伤小鼠造血功能恢复达正常水平，骨髓增生活跃，明显高于模型组。上述结果，从骨髓组织到外周血象及小鼠的一般状况，均表明人羊膜间充质干细胞移植治疗明显减轻了化疗药物引起的骨髓损伤，可明显促进化疗药物所致骨髓抑制小鼠造血功能的恢复，即改善了骨髓组织结构，又较早地恢复了外周血象。此外，从小鼠体质量变化而言，人羊膜间充质干细胞移植组与模型组无显著差异，但肝、脾指数小于空白组，且两组间无差异，也未观察到明显的皮肤、黏膜损害，表明在人羊膜间充质干细胞移植的一段时间内未出现明显的急性移植物抗宿主病。

人羊膜间充质干细胞移植骨髓抑制小鼠的造血功能

Human amnion-derived mesenchymal stem cells transplantation improveshematopoietic function of myelosuppression mice

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