神经干细胞移植治疗大鼠恢复期脊髓损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (19): 3508-3514.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.014

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神经干细胞移植治疗大鼠恢复期脊髓损伤

李哲，申利坊，王国胜，郭钢花

郑州大学第五附属医院康复中心，河南省郑州市 450052

收稿日期:2012-08-29 修回日期:2012-10-08 出版日期:2013-05-07 发布日期:2013-05-07
通讯作者: 郭钢花，主任医师，教授，郑州大学第五附属医院康复中心，河南省郑州市 450052 ggh_jr@163.com
作者简介:李哲☆，男，1974年生，河南省邓州市人，汉族，2010年华中科技大学毕业，博士，副主任医师，主要从事神经系统疾病的康复基础与临床研究。 lizhe.1974@163.com
基金资助:
河南省教育厅自然科学研究计划项目(2009A320027)

Neural stem cell transplantation for the treatment of rat spinal cord injury in recovery period

Li Zhe, Shen Li-fang, Wang Guo-sheng, Guo Gang-hua

Rehabilitation Center, the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Received:2012-08-29 Revised:2012-10-08 Online:2013-05-07 Published:2013-05-07
Contact: Guo Gang-hua, Chief physician, Professor, Rehabilitation Center, the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China ggh_jr@163.com
About author:Li Zhe☆, M.D., Associate chief physician, Rehabilitation Center, the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China lizhe.1974@163.com
Supported by:
the Natural Science Research Plan of Henan Educational Commission, No. 2009A320027*

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现，脊髓损伤后细胞外信号调节激酶在反应性胶质细胞中存在上调现象，且磷酸化的细胞外信号调节激酶急剧增多。
目的：验证神经干细胞移植对恢复期脊髓损伤大鼠的功能影响及其在病灶局部的分化及机制。
方法：90只SD大鼠被随机分为3组，每组30只。对照组大鼠造模但不进行神经干细胞移植；静脉移植组及局部移植组造模后分别进行神经干细胞移植，分别于移植后的1，2，4，12，24周对各组随机抽取的6只动物后肢功能进行BBB评分及免疫组织化学染色。
结果与结论：神经干细胞移植后，静脉移植组和局部移植组病灶局部可见Brdu 阳性细胞；大鼠BBB评分逐渐提高，移植4周后静脉移植组和局部移植组BBB评分明显高于同期对照组；大鼠脊髓胶质纤维酸性蛋白、细胞外信号调节激酶1/2逐渐提高，4周达最大值，移植12周后胶质纤维酸性蛋白、细胞外信号调节激酶1/2较同期减少(P < 0.05)；微管相关蛋白2逐渐提高，4周达最大值，4周以后呈下降趋势，12周后不再有明显变化，但微管相关蛋白2较同期对照组增多(P < 0.01)。结果提示，神经干细胞移植后可在病灶局部增殖分化为神经元和神经胶质细胞；两种移植方式的作用没有明显区别；神经胶质细胞再生的过程和细胞外信号调节激酶通路密切相关。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 神经干细胞, 胶质纤维酸性蛋白, 细胞外信号调节激酶1/2, 微管相关蛋白2, 脊髓损伤, 神经元, 神经胶质细胞, 细胞外信号调节激酶通路, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that extracellular signal-regulated kinase can up-regulate the reactive glial cells after spinal cord injury, and the number of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase is increased.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of neural stem cell transplantation on motor function recoveryof rats with spinal cord injury in the recovery period, and to explore the focal differentiation and mechanism.
METHODS: Ninety Sprague Dawley rats were randomly divided into three groups, 30 rats in each group: control group, local transplantation group and intravenous infusion group. Rats in the control group were used to establish the models but did not receive neural stem cell transplantation; rats in the local transplantation group and the intravenous infusion group received neural stem cell transplantation after modeling. Six rats were collected from each group; then Basso, Beattie and Bresnahan score and immunohistochemical staining were performed at 1, 2, 4, 12 and 24 weeks after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: After neural stem cell transplantation, Brdu positive cells could be seen in local lesions of local transplantation group and the intravenous infusion group; Basso, Beattie and Bresnahan score at 4 weeks after transplantation in the local transplantation group and the intravenous infusion group was significantly higher than that in the control group; levels of rat spinal cord glial fibrillary acidic protein and extracellular signal-regulated kinase 1/2 were gradually increased and reached peak at 4 weeks after transplantation; at 12 weeks after transplantation, the levels of spinal cord glial fibrillary acidic protein and extracellular signal-regulated kinase 1/2 were decreased (P < 0.05); the level of microtubule-associated protein 2 was increased and reached peak at 4 weeks after transplantation, and gradually decreased after 4 weeks; at 12 weeks after transplantation, there was no significant difference in microtubule-associated protein 2 level, but the microtubule-associated protein 2 level was higher than that in the control group (P < 0.01). After neural stem cell transplantation, the neural stem cells could proliferate and differentiate into neuron and neuroglial cells. There is no significant difference between the two methods. There may be a certain correlation between the glial cells regeneration process and extracellular signal-regulated kinase pathways.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, neural stem cells, glial fibrillary acidic protein, extracellular signal-regulated kinase 1/2, microtubule-associated protein 2, spinal cord injury, neurons, glial cells, extracellular signal-regulated kinase pathway, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

李哲，申利坊，王国胜，郭钢花. 神经干细胞移植治疗大鼠恢复期脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(19): 3508-3514.

Li Zhe, Shen Li-fang, Wang Guo-sheng, Guo Gang-hua. Neural stem cell transplantation for the treatment of rat spinal cord injury in recovery period[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(19): 3508-3514.

图/表（结果） 5

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年3月至2012年3月在郑州大学第五附属医院实验室完成，实验室的生物安全等级二级，为省部级重点实验室。

材料：

神经干细胞移植治疗大鼠恢复期脊髓损伤实验所需试剂：

Main reagents:

实验动物：SPF成年SD大鼠120只，体质量(200± 50) g，雌雄不拘，孕14 d SD大鼠用于胚胎海马组织分离，实验动物均由郑州大学医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。

实验方法：

脊髓损伤模型的制备及分组：用体积分数10%的水合氯醛300 mg/kg腹腔内注射麻醉，将大鼠俯卧固定，腰背部剪毛，以T₈棘突为中心，无菌操作，背部正中切口，显露T₇-T₁₀棘突及椎板，切除T₈棘突及椎板，暴露脊髓作为损伤区，应用改良Allen’s打击法致伤脊髓(25 cm•g= 10 g×2.5 cm，即10 g的重物从2.5 cm的高度垂直落下产生的致伤力)，见脊髓组织出现水肿、出血，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩扑动后，双后肢呈迟缓性瘫痪，表明撞击成功^[4]。造模后以消毒温盐水清洗损伤的脊髓，待动物苏醒后分别单独饲养，自由进食及饮水，7:00-19:00光照，每日按摩膀胱或穿刺膀胱排尿2次，直至2周时排尿反射恢复为止^[5]。1周后有90只大鼠存活，随机分为3组，每组30只：①对照组：造模但不进行神经干细胞移植。②静脉移植组：造模后经静脉进行神经干细胞移植。③局部移植组：造模后病灶局部进行神经干细胞移植。造模后14 d内每天腹腔注射青霉素(10×10⁴ U/kg)。每天将动物的膀胱人工排空2次，至动物自身排尿反射恢复。

神经干细胞的移植：

大鼠胚胎神经干细胞的体外分离和培养：取孕14 d的SD大鼠分离出胚胎海马组织，按照参考文献[6]分离培养神经干细胞。

移植前的细胞准备：移植前12 h，在鉴定的第2代前体细胞中加入Brdu溶液(5 μmol/L)标记，37 ℃、体积分数5%CO₂孵育。移植前调整细胞浓度为5×10¹⁰ L^-¹，放入冰中待移植。

神经干细胞移植：静脉移植组伤后4周经尾静脉注射移植神经干细胞悬液，量为100 μL^[6]。局部移植组在脊髓损伤病灶头尾端各注射50 μL的神经干细胞悬液。

BBB功能评分评价大鼠下肢功能^[8]：行为学检测参照Basso等提出的大鼠脊髓损伤后肢运动功能评判标准(简称BBB评分法)在移植1，2，4，12，24周后分别对各组6只实验动物后肢的运动功能进行评分。所有观察都在上午进行，评分前应将所有动物的膀胱排空，时间为4 min，评分时采用双盲法。

组织免疫组织化学检测：采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(StreptAvidin-Biotin-Complex， SABC)法进行免疫组织化学染色，按SABC免疫组织化学试剂盒说明书中的步骤进行，胶质纤维酸性蛋白抗体稀释度为1∶200，微管相关蛋白2抗体稀释度为1∶100，ERK1/2抗体稀释度为1∶100。实验大鼠在移植1，2，4，12，24周后过度麻醉并作40 g/L多聚甲醛灌注。每次随机取出各组6只实验动物脊髓，4%PFA固定后作石蜡切片。

胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及ERK1/2免疫组织化学染色过程：烤片，60 ℃过夜，二甲苯浸泡10 min 2次脱蜡，无水乙醇5 min 2次、体积分数95%乙醇5 min 1次、体积分数75%乙醇5 min 1次水化，PBS漂洗3次各5 min，抗原修复，画圈，用PBS配置新鲜的体积分数3%H₂O₂，室温封闭10 min，PBS洗3次各5 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温15-20 min，甩去多余液体，滴加Ⅰ抗，室温1 h，兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白抗体稀释度为1∶200，兔抗鼠微管相关蛋白2抗体稀释度为1∶100，ERK1/2抗体稀释度为1∶100，PBS漂洗3次，5 min/次，加二抗，室温20 min，PBS漂洗3次，2 min/次，滴加试剂SABC，室温20 min， DAB显色，PBS冲洗，苏木精复染2 min、然后分化、脱水、透明、封固、镜检。

主要观察指标：①观察Brdu标记的阳性细胞。②各组大鼠后肢运动功能评分(BBB评分)。③各组大鼠脊髓内胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及ERK1/2比较。

统计学分析：所有数据采用SPSS 17.0软件分析，以a=0.05作为差异显著性的检验标准，符合正态性分布且方差齐的应用参数检验中的t 检验，不符合正态性分布的应用非参数检验中的秩和检验。

讨论

细胞增殖周期包括G₁、S、G₂、M 4个周期，其中S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料可渗入到DNA中^[9]。Brdu作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物，可代替胸腺嘧啶核苷渗透到细胞合成的DNA中^[10]。因此当细胞处于DNA合成期而又有Brdu存在时，就会有Brdu渗入到新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种Brdu就在胞核的DNA中长期存留。渗入到DNA的Brdu可通过抗Brdu单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示^[11]。标记Brdu的细胞只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害^[12]。移植2周后，移植组病灶局部Brdu阳性说明神经干细胞具有自我复制更新的能力，并能在移植后迁移至病灶局部。

胶质原纤维中间丝中存在胶原纤维酸性蛋白，且胶质纤维酸性蛋白仅存在于星形胶质细胞中，因此星形细胞中的胶质纤维酸性蛋白基因表达为其特异性分子标志。胶质纤维酸性蛋白是鉴定星形胶质细胞的特异性标志物^[13]。微管相关蛋白是微管的结构蛋白之一^[14]，对神经元的很多方面都有重要作用^[15]。微管相关蛋白可以促进微管的组装并增加微管的稳定性且与轴突运输有关^[16]。微管相关蛋白2活性下降后通过一系列病理生理变化最终导致神经元死亡^[17]。因此，其可作为神经元的标志蛋白。有丝分裂原激活蛋白激酶是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝苏氨酸蛋白激酶^[18]。每种有丝分裂原激活蛋白激酶被特异的有丝分裂原激活蛋白激酶的激酶(MAPKK，MEK)通过磷酸化方式激活，后者又被有丝分裂原激活蛋白激酶的激酶激酶(MAPKKK，MEKK)激活^[19]。MAPK信号通路通过这种保守的三级酶促级联反应激活其下游转录因子^[20]，参与基因表达^[21]，细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节^[22]，ERK1 和ERK2是有丝分裂原激活蛋白激酶通路中最重要的下游组件，主要调节细胞的生长和分化^[23]，因此实验将它作为观察细胞活性的指标，来评价神经干细胞注入到大鼠体内后的活性。

实验显示神经干细胞可以分化为神经元和星形胶质细胞，并且证明在大鼠脊髓的病灶处，胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2都逐渐提高，4周均达最大值，但胶质纤维酸性蛋白4周以后不再有明显变化，而微管相关蛋白2 在4周以后呈下降趋势，12周后不再有明显变化。与对照组比较，静脉移植组和局部移植组胶质纤维酸性蛋白 2周以后显著性增加，胶质纤维酸性蛋白在4周时与对照组相当，4周后小于对照组，而微管相关蛋白2在移植后2周明显高于对照组直至24周，胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2静脉移植组和局部移植组两组之间移植后各个时间段无明显差异，结合胶质纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的生物学特性。

从上述结果可以推测：移植2周后，直至第24周，移植组相对于对照组病灶局部有更多神经元存在，而胶质细胞则在移植2周后移植组高于对照组，4周后基本相当，12周后对照组反而高于移植组，说明神经干细胞移植后，星形胶质细胞先增殖，后受到抑制。ERK1/2逐渐提高，4周达最大值，4周以后不再有明显变化，显示了和胶质纤维酸性蛋白相似的变化趋势，说明神经干细胞移植后，病灶局部的神经再生与ERK1/2信号系统密切相关。

在急性期进行的神经干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠研究中，已经证实神经干细胞有助于脊髓损伤大鼠后肢功能的提高，且在观察10周内，脊髓损伤大鼠的BBB评分均为上升趋势。实验中大鼠BBB评分逐渐提高，12周达最大值，12周以后不再有明显变化，与对照组比较，静脉移植组和局部移植组在4周以后显示出显著性差异，而静脉移植组和局部移植组两组之间移植后各个时间段无明显差异，这说明神经干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠无论是在恢复期还是急性期，对于大鼠后肢功能的恢复均有明显有效，但肢体功能不会无限制的提高，到12周以后基本无明显变化。实验结果发现大鼠的BBB评分12周最高，而胶质纤维酸性蛋白 4周以后不再有明显变化，微管相关蛋白2在4周以后呈下降趋势，这种不一致的变化趋势说明外在功能的进步不仅与再生神经元的数量，可能与其他因素如神经元再生的微环境都密切相关。

综上所述，无论静脉途径或局部种植，神经干细胞移植后均可在病灶局部增殖分化为神经元和神经胶质细胞，而且，神经胶质细胞的再生不是线性增加，而是呈现出先增殖分化后抑制的态势，从而促进外在功能的提高，这个神经再生的过程和ERK通路密切相关。

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