人牙髓干细胞增殖与瞬时受体电位M7通道的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (19): 3495-3502.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.012

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人牙髓干细胞增殖与瞬时受体电位M7通道的作用

崔力^1，2，徐帅妹^1，2，吴补领^1，2

1南方医科大学南方医院，广东省广州市 510515 2南方医科大学口腔医学院，广东省广州市 510515

收稿日期:2012-12-10 修回日期:2013-02-21 出版日期:2013-05-07 发布日期:2013-05-07
通讯作者: 吴补领，博士，教授，主任医师，院长，博士生导师，南方医科大学南方医院，广东省广州市 510515；南方医科大学口腔医学院，广东省广州市 510515 wubuling@yahoo.com
作者简介:崔力★，男，1986年生，广东省高州人，汉族，南方医科大学在读硕士，医师，主要从事牙髓生物学方面的研究。
基金资助:
广东省高等学校人才引进科研资助课题项目(C1010047)，项目名称为牙胚发生位置、大小、形态的蛋白质组学研究和牙再生。

Role of transient receptor potential melastatin 7 in the proliferation of human dental pulp stem cells

Cui Li^{1, 2}, Xu Shuai-mei^{1, 2}, Wu Bu-ling^{1, 2}

1 Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
2 College of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2012-12-10 Revised:2013-02-21 Online:2013-05-07 Published:2013-05-07
Contact: r, Chief physician, Doctoral supervisor, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; College of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China wubuling@yahoo.com
About author:Cui Li★, Studying for master’s degree, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; College of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Supported by:
Program of Introducing Talents of Discipline to Universities in Guangdong Province, No. C1010047*

摘要/Abstract

摘要：

背景：瞬时受体电位M7通道广泛存在于机体组织和细胞，对细胞存活、增殖和维持细胞镁离子平衡是必须的。
目的：探讨瞬时受体电位M7通道对人牙髓干细胞增殖的作用。
方法：酶消化法分离培养人牙髓干细胞，运用不同浓度(50，100 μmol/L)瞬时受体电位M7通道抑制剂2-氨基乙基二苯硼酸酯作用于人牙髓干细胞 72 h后，Western-blot 检测2-氨基乙基二苯硼酸酯对瞬时受体电位M7通道蛋白水平的影响，MTT法观察其对人牙髓干细胞增殖的影响；构建特异抑制瞬时受体电位M7通道表达慢病毒载体，运用慢病毒感染人牙髓干细胞。进行RT-PCR和Western-blot沉默效果分析，在1，3，5，7 d进行MTT法检测特异沉默瞬时受体电位M7通道后对细胞增殖的影响。
结果与结论：50，100 μmol/L 2-氨基乙基二苯硼酸酯均能抑制瞬时受体电位M7通道蛋白水平的表达并且能明显抑制人牙髓干细胞增殖(P < 0.01)，特异性沉默瞬时受体电位M7通道表达后，在不同时间段人牙髓干细胞增殖能力均明显降低(P < 0.01)。提示瞬时受体电位M7通道对维持人牙髓干细胞增殖能力有重要作用。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 瞬时受体电位M7通道, 人牙髓干细胞, shRNA, 慢病毒, 2-氨基乙基二苯硼酸酯, 增殖, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Transient receptor potential melastatin 7 channel is widely distributed in tissues and cells, and it is necessary for cell survival, proliferation and maintenance of magnesium ion balance.
OBJECTIVE: To investigate the role of transient receptor potential melastatin 7 channel in the proliferation of human dental pulp stem cells.
METHODS: Human dental pulp stem cells were isolated and cultured by collagenase digestion method, and were exposed for 72 hours to 2-aminoethoxydiphenyl borate (50 and 100 μmol/L), which was widely used as an inhibitor of transient receptor potential melastatin 7. The influences of 2-aminoethoxydiphenyl borate on transient receptor potential melastatin 7 protein level and proliferation of human dental pulp stem cells were detected with western blot assay and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide method, respectively. Specific lentivirus vector was constructed to inhibit the expression of transient receptor potential melastatin 7, and lentivirus was applied to transfect human dental pulp stem cells. Reverse transcription-PCR and western blot for silencing efficacy analysis were also performed. Changes of cell proliferation after specific silencing transient receptor potential melastatin 7 was examined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay at 1, 3, 5, and 7 days after culture.
RESULTS AND CONCLUSION: The proliferation of human dental pulp stem cells and protein expression of transient receptor potential melastatin 7 were significantly inhibited by 2-aminoethoxydiphenyl borate at 50 and 100 μmol/L (P < 0.01). After specific silencing transient receptor potential melastatin 7, the proliferation capacity of human dental pulp stem cells was significantly decreased at different time poinrs (P < 0.01). Transient receptor potential melastatin 7 plays an important role in maintaining proliferation ability of human dental pulp stem cells.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, transient receptor potential melastatin 7, human dental pulp stem cells, short-hairpin RNA, lentivirus, 2-aminoethoxydiphenyl borate, proliferation, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

崔力，徐帅妹，吴补领. 人牙髓干细胞增殖与瞬时受体电位M7通道的作用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(19): 3495-3502.

Cui Li, Xu Shuai-mei, Wu Bu-ling. Role of transient receptor potential melastatin 7 in the proliferation of human dental pulp stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(19): 3495-3502.

图/表（结果） 6

2.1 观察人牙髓干细胞克隆形成能力 细胞接种到塑料培养瓶24 h后开始增殖，培养7 d后可见细胞由中心向四周散射克隆性生长，培养14 d后可见人牙髓干细胞可以形成单细胞克隆，细胞形态呈短梭形，见图1。

2.2 Western-blot检测 2-APB对人牙髓干细胞瞬时受体电位M7通道表达的抑制作用取0，50，100 μmol/L 2-APB作用于人牙髓干细胞72 h后，提取细胞总蛋白，发现2-APB能在蛋白水平抑制瞬时受体电位M7通道的表达，而且存在一定的浓度依赖性，见图2。

取50，100 μmol/L 2-APB作用于人牙髓干细胞72 h后，经过MTT检测发现细胞数量比0 μmol/L 2-APB明显降低。50 μmol/L 2-APB处理组人牙髓干细胞细胞生长率为74.42%，100 μmol/L 2-APB处理组人牙髓干细胞细胞生长率为48.11%，与0 μmol/L 2-APB处理组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.4 观察人牙髓干细胞shTRPM7慢病毒感染情况 见图4。shTRPM7慢病毒感染人牙髓干细胞96 h后，倒置荧光显微镜观察可见人牙髓干细胞发出绿色荧光，说明病毒成功感染细胞。

2.5 RT-PCR验证瞬时受体电位M7通道 shRNA在mRNA水平的抑制作用见图5。RT-PCR验证发现瞬时受体电位M7通道shRNA在mRNA水平对瞬时受体电位M7通道有明显的抑制表达作用，说明慢病毒载体构建成功。

2.6 Western blot 验证瞬时受体电位M7通道shRNA在蛋白水平的抑制作用 见图6。Western blot验证发现瞬时受体电位M7通道shRNA在蛋白水平对瞬时受体电位M7通道有明显的抑制表达作用，说明shTRPM7慢病毒载体构建成功。

2.7 MTT检测慢病毒抑制瞬时受体电位M7通道表达对人牙髓干细胞增殖的作用 见图7。设置瞬时受体电位M7通道 shRNA组、阴性对照shRNA组、空白组3组，在培养1，3，5，7 d分别进行MTT检测，可见瞬时受体电位M7通道shRNA组在培养1，3，5，7 d时的增殖速度与阴性对照shRNA组相比均明显降低(P < 0.01)。

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引言

人牙髓干细胞存在于人的牙髓组织，在正常情况下处于静息状态，当受到外界刺激成牙本质细胞受损时，可增殖分化为成牙本质细胞，形成修复性牙本质，从而参与牙髓组织的损伤修复过程^[1]。而人牙髓干细胞正常的生长、增殖是其参与牙髓组织损伤修复过程的重要基础。

瞬时受体电位M7通道是由6个跨膜α螺旋(S₁-S₆)、N末端和C末端均在胞内的亚基组成的同源或异源四聚体，胞内C末端的激酶结构是该通道特征性的结构区域。瞬时受体电位M7通道(transient receptor potential M7，TRPM7)广泛存在于机体组织和细胞，对细胞存活、增殖和维持细胞镁离子平衡是必须的，研究发现瞬时受体电位M7通道参与胚胎发育，细胞分化、黏附，调节细胞极性等一系列重要生理功能^[2-5]。

有研究报道在分化成熟的骨细胞中，沉默瞬时受体电位M7通道表达可以抑制成骨细胞的增殖^[6]。有学者比较了肝干细胞和肝星状细胞瞬时受体电位M7通道的表达水平，发现在瞬时受体电位M7通道肝干细胞上的表达明显要比终末分化的肝星状细胞要高，他们认为增殖能力越强的细胞，瞬时受体电位M7通道的表达水平可能也会越高^[7]。人牙髓干细胞具有更高的体外增殖能力，前期实验研究验证了瞬时受体电位M7通道在人牙髓干细胞的高表达。

文章首先通过观察瞬时受体电位M7通道非特异性抑制剂2-氨基乙基二苯硼酸酯(2-Aminoethyloxy diphenyl borane，2-APB)对人牙髓干细胞增殖的抑制作用，然后通过慢病

毒特异性抑制人牙髓干细胞瞬时受体电位M7通道表达，使瞬时受体电位M7通道表达减少后，通过MTT检测发现细胞增殖能力明显降低，说明瞬时受体电位M7通道对于维持人牙髓干细胞增殖能力有重要作用。

材料方法

设计：基因学及细胞生物学体外实验。

时间及地点：实验于2012年3月至9月在南方医科大学基因工程研究所完成。

材料：人牙髓干细胞来源于南方医院口腔医疗中心18-25岁因正畸治疗或阻生需要拔除的完整、健康的第三磨牙(经患者知情同意)。HEK-293T细胞由南方医科大学基因研究所工程研究所尹虹硕士提供。

瞬时受体电位M7通道对人牙髓干细胞增殖的作用研究所用主要试剂和仪器：

Main experimental reagents and instruments:

实验方法：

人牙髓干细胞的分离、培养：将无菌条件下取出的牙髓剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，加入3 g/L的Ⅰ型胶原酶和4 g/L的中性蛋白酶，37 ℃消化1 h，过直径70 μm筛子制备单细胞悬液，将细胞悬液接种于塑料培养瓶，以α-MEM、体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青/链霉素为培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂培养，待细胞贴壁后每3 d换液1次，细胞生长融合约80%时传代扩大培养。

人牙髓干细胞克隆形成能力：将单细胞悬液接种于塑料培养瓶，正常培养，倒置显微镜下观察人牙髓干细胞单克隆形成能力。

2-APB作用于人牙髓干细胞：设置0，50，100 μmol/L 2-APB 3组。将细胞以2×10⁵/孔的细胞密度接种到六孔板，待细胞长成单层后，分别加入2-APB使其终浓度为0，50，100 μmol/L，72 h后Western-blot检测2-APB对人牙髓干细胞瞬时受体电位M7蛋白表达的影响。取对数生长期细胞以2×10³/孔的密度接种到96孔板，待细胞贴壁后分别加入2-APB使其终浓度为0，50，100 μmol/L，72 h后MTT检测细胞增殖情况。

shTRPM7慢病毒感染人牙髓干细胞：设置瞬时受体电位M7通道shRNA组、阴性对照shRNA组、空白组3组。抑制瞬时受体电位M7通道shRNA序列^[8]、阴性对照shRNA序列见表1。

shTRPM7慢病毒感染方法：shRNA退火，HpaⅠ和XhoⅠ双酶切，连PGC-LV慢病毒载体，lipofectamine 2000转染 PGC-LV、pHelper1.0、pHelper2.0三质粒系统入HEK-293T细胞，感染48 h后，收集上清，0.45 μm滤膜过滤。浓缩病毒液。调整shRNAM7慢病毒浓度感染人牙髓干细胞，倒置荧光显微镜观察。阴性对照shRNA组和抑制瞬时受体电位M7通道表达干扰shRNA的处理过程序列是一样的，只是插入载体的序列不一样，空白组是不做任何处理的组别，所以不用shRNA处理。构建特异抑制瞬时受体电位M7通道表达慢病毒载体后，RT-PCR和Western-blot验证载体构建成功。每组取对数生长期的人牙髓干细胞以2×10³/孔的密度接种到96孔板，1，3，5，7 d进行MTT法检测细胞增殖情况。

RT-PCR：TRIzol试剂提取瞬时受体电位M7通道shRNA组、阴性对照 shRNA组、空白组人牙髓干细胞总RNA，用2 μg RNA反转录为cDNA，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，取cDNA进行PCR扩增反应。反应条件为95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 共25个循环，72 ℃7 min。引物由Invitrogen公司合成，序列见表1。

Western blot分析：提取人牙髓干细胞总蛋白，蛋白煮沸变性，电泳条件为：5%浓缩胶90 V，10%分离胶，恒压110 V约1.5 h。转至PVDF膜，转膜条件为：200 mA，2 h。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，瞬时受体电位M7通道羊抗人一抗 (工作浓度1∶500) 4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，带HRP标记的兔抗羊二抗(工作浓度1∶5 000)室温孵育1 h，PBST洗膜3次。β-actin小鼠抗人一抗(工作浓度1∶1 000)4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，带HRP标记的兔抗小鼠二抗(工作浓度1∶5 000)室温孵育1 h，PBST洗膜3次，ECL发光试剂盒显影。

MTT检测：每孔加入5 g/L MTT 20 μL， 37 ℃孵育4 h，吸出上清，每孔加入200 μL二甲基亚砜，震荡充分溶解结晶后酶标仪490 nm波长处测量吸光度值。每组6个复孔，至少重复3次。

主要观察指标：通过MTT检测瞬时受体电位M7通道非特异性抑制剂2-APB与特异性抑制慢病毒对人牙髓干细胞增殖的抑制作用。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示，单因素方差分析检验方差齐性，LSD法进行组间两两比较。P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

瞬时受体电位超家族由一系列非选择性的离子通道组成。瞬时受体电位的命名是因为该超家族第一个成员是在果绳光传导系统上被发现的。目前已经有30多个哺乳动物瞬时受体电位通道被发现。根据它们序列结构同源性可以划分为6大亚家族：经典类、黑色素抑制类、香草素受体类、跨膜锚蛋白1、黏脂质类、胱氨酸多聚体类。不同瞬时受体电位通道被不同的物理化学刺激所激活。瞬时受体电位的多样性使它们成为细胞信号整合器，对调节细胞生理病理功能有重要作用^[9-10]。

瞬时受体电位M7通道属于黑色素抑制类亚家族的一员，该亚家族共有8个成员(瞬时受体电位M1通道-瞬时受体电位M8通道)。瞬时受体电位M2通道、瞬时受体电位M6通道、瞬时受体电位M7通道是目前发现的瞬时受体电位中同时具有离子通道和蛋白激酶结构域双功能的蛋白质^[11-12]。

瞬时受体电位M7通道基因位于15号人类染色体q21.2区域，由覆盖127 kb DNA序列的39个外显子编码，小鼠瞬时受体电位M7通道基因和人类的瞬时受体电位M7通道有95%的相似性。人类瞬时受体电位M7通道由 1 864个氨基酸组成，相对分子质量大概为212 000。瞬时受体电位M7通道是由6个跨膜α螺旋(S1-S6)、N末端和C末端均在胞内的亚基组成的同源或异源四聚体，每个亚基的S5-pore-S6结构域与组成该离子通道的其它同源或异源亚基的S5-pore-S6结构域围成一个可让单价或二价阳离子通过的疏水性孔洞^[4,13-16]。胞内C末端的瞬时受体电位盒有25个高度保守的的残基，可能与磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)相互作用。C末端酶区域是瞬时受体电位M7通道最具特征的结构，该区的丝氨酸／苏氨酸激酶结构域和α激酶家族成员同源。尽管该激酶结构域不直接影响离子通道的活性，但是它似乎可以通过Mg²⁺-核苷酸结合物调节离子通道功能。减少胞内的Mg²⁺和Mg²⁺-ATP可以激活瞬时受体电位M7通道。在静息细胞中，Mg²⁺和Mg²⁺-ATP处于生理状态的水平可以抑制瞬时受体电位M7通道活性，仅有少量的二价阳离子内流。因此，瞬时受体电位M7通道又被称为Mg²⁺抑制离子通道或者Mg²⁺-核苷酸结合物调节离子通道。除了Mg²⁺和Mg²⁺-核苷酸结合物调节瞬时受体电位M7通道外，瞬时受体电位M7通道也可以通过磷酸化或者PIP2调节^[4,17-19]。

瞬时受体电位M7通道广泛存在于机体组织当中，学者普遍认为瞬时受体电位M7通道组成性地表达于组织和细胞上。McNulty等比较人类不同组织黑色素抑制类的分布类型，包括了大脑、垂体、心脏、肺、肝脏、胃、肠，脾脏、胰腺、前列腺、骨骼肌、软骨、骨、骨髓、胎盘、外周血单核细胞、巨噬细胞,其中瞬时受体电位M7通道mRNA在心脏、垂体、骨和脂肪组织高表达^[2]。而且和其他瞬时受体电位通道相比，瞬时受体电位M7通道在绝大部分组织都是表达最高的。最近也有研究表明瞬时受体电位M7通道在胚胎干细胞、骨髓来源的间充质干细胞和外周血干细胞均有表达^[3,5,20]。瞬时受体电位M7通道和瞬时受体电位M6通道结构和功能相似，但瞬时受体电位M6通道的表达有一定的组织差异性，目前主要发现在肾组织和小肠组织表达^[21]。前期实验已经证实了人牙髓干细胞表达瞬时受体电位M7通道，而且主要集中于细胞膜和细胞浆。

Gronthos等^[22]首次报道从人的第三磨牙获取牙髓组织，利用酶消化法进行体外培养，获得集落状生长的、体内可诱导分化形成成牙本质样结构的牙髓干细胞，证实牙髓组织中设想的干细胞群体是存在的。牙髓干细胞存在于机体牙髓组织中，是具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞，同机体组织成体干细胞有相似的生物学特性，可以分化为成牙本质细胞、成骨细胞、神经细胞和脂肪细胞等^[23-26]。Paino等^[27]报道了牙髓干细胞自然状态下可向黑素细胞分化；Gomes等^[28]报道了利用未成熟的牙髓干细胞细胞重建兔子的角膜组织；有报道指出牙髓干细胞有向血管内皮细胞分化的功能，这一发现对心脏疾病、心血管系统疾病治疗相关的组织工程研究具有重大意义^[29-30]。

瞬时受体电位M7通道是维持细胞内外钙镁离子平衡的重要通道，目前研究表明其对于维系细胞生存、增殖起到关键作用。2-APB是一种瞬时受体电位通道抑制剂，广泛地被应用于瞬时受体电位M7通道电生理和功能的研究。它在一定浓度范围内(<1 mmol/L) 能关闭瞬时受体电位M7通道，当浓度超过2 mmol/L则可激活瞬时受体电位M7通道^[31-32]，通过首先发现2-APB可以在蛋白水平抑制瞬时受体电位M7通道的表达 MTT检测发现 50 μmol/L 2-APB和100 μmol/L 2-APB可以显著抑制人牙髓干细胞增殖，提示瞬时受体电位M7通道可能参与调控人牙髓干细胞增殖过程。2-APB可能通过关闭胞膜的瞬时受体电位M7通道并且抑制该通道的表达，减少细胞外镁离子和钙离子的内流，从而抑制细胞的增殖。shRNA是具有短发夹结构的干扰RNA，它包括两个短反向重复序列，重复序列之间由茎环结构分开。近十年来，慢病毒搭载的shRNA已经广泛应用于基因功能研究。它大大提高对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分裂的细胞等感染效率；具有抑制作用周期长；细胞毒性小；稳定性高等特点^[33-35]。通过构建特异性抑制瞬时受体电位M7通道的慢病毒并感染人牙髓干细胞，实现了对人牙髓干细胞瞬时受体电位M7通道的有效沉默。MTT检测发现沉默人牙髓干细胞瞬时受体电位M7通道表达后，在7 d的人牙髓干细胞生长周期内其增殖能力明显下降，说明瞬时受体电位M7通道对维系人牙髓干细胞增殖能力极其重要，并且在这个时间段内似乎没有形成有效的基因代偿。在Jin等^[36]的报道中，胚胎发育早期，瞬时受体电位M7通道的敲除可以使胚胎停止发育，而在发育晚期对其敲除对胚胎发育影响显著减少。这说明了瞬时受体电位M7通道在组织或细胞不同分化时期的对其生理功能影响存在差异，细胞分化成熟后可能存在其他蛋白补偿或替代瞬时受体电位M7通道的作用。

目前报道瞬时受体电位M7通道对细胞增殖能力的影响主要集中于肿瘤细胞株，在干细胞方面的研究甚少。Schmitz 等^[37]发现完全敲除DT-40B细胞瞬时受体电位M7通道基因后，细胞无法存活；部分敲除瞬时受体电位M7通道基因，细胞增殖停止且随着培养时间延长凋亡数量增多。在人类头颈部肿瘤、视网膜肿瘤、乳腺癌、胰腺癌、胃癌中均发现瞬时受体电位M7通道在肿瘤细胞上较正常细胞表达增高，提示瞬时受体电位M7通道在肿瘤细胞的增殖发挥重要作用，而且抑制瞬时受体电位M7通道后，肿瘤细胞增殖会变慢，细胞增殖停留在G₁-S期内，并且可以诱导肿瘤细胞死亡^[38-41]。Nelson S. Yee等在斑马鱼模型上发现瞬时受体电位M7通道通过镁离子敏感信号Socs3a调节胰腺上皮细胞的增殖和胰腺的发育，瞬时受体电位M7通道突变的胰腺细胞停止G₀-G₁的分裂周期上^[42]。在干细胞方面Andreas BecK等发现瞬时受体电位M7通道对于骨髓干细胞的增殖是必须的，敲除瞬时受体电位M7通道后，发现骨髓干细胞的增殖能力明显降低^[5]，这和本组实验观察的结果相似，而Lillia V.Ryazanova等则发现瞬时受体电位M7通道对胚胎干细胞存活和胚胎发育是必须的。小鼠敲除瞬时受体电位M7通道激酶区域后，瞬时受体电位M7通道激酶被敲除的纯合子胚胎在早期就死亡，而杂合子的胚胎可以存活，但是杂合子小鼠有低镁血症的体征并且小肠吸收镁离子下降，他们认为瞬时受体电位M7通道在调节机体和细胞镁离子平衡有重要作用^[3]。

实验首次表明瞬时受体电位M7通道对于维持人牙髓干细胞增殖能力有重要作用，但该通道影响人牙髓干细胞增殖的具体机制需要进一步研究。

人牙髓干细胞增殖与瞬时受体电位M7通道的作用

Role of transient receptor potential melastatin 7 in the proliferation of human dental pulp stem cells

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