脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外放射敏感性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (19): 3455-3460.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.006

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脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外放射敏感性

赵中甫^1，2，樊锐太³，杨永⁴，孙剑瑞²，胡祥⁵，Eileen Shen⁶○，杨波^2，7

1 许昌市中心医院神经外科，河南省许昌市 461000
2郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市　450052
3郑州大学第一附属医院放射治疗中心，河南省郑州市　450052
4 唯尔克干细胞生物科技(辽宁)有限公司，辽宁省本溪市 117003
5 深圳市北科细胞工程研究所，广东省深圳市 518000
6 Dickinson College, Carlisle, PA 17013, U.S.A.
7 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南省郑州市 450052

收稿日期:2012-09-16 修回日期:2012-12-08 出版日期:2013-05-07 发布日期:2013-05-07
通讯作者: 杨波，博士，教授，博士生导师，郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市450052；河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南省郑州市 450052 yangbo96@126.com
作者简介:赵中甫★，男，1968年生，河南省开封市人，汉族，2007年郑州大学医学院毕业，硕士，主任医师，主要从事间充质干细胞和脑肿瘤干细胞方面的研究。 zzf20041986@126.com 并列第一作者：樊锐太☆，男，1963年生，河南省南阳市人，汉族，1985年河南医科大学毕业，博士，主任医师、教授、博士生导师，主要从事肿瘤放射治疗。
基金资助:
河南省科技厅科技攻关项目(112102310173)；郑州大学第一附属医院创新科研团队建设基金项目(TD2011023)

In vitro radiosensitivity of brain cancer stem cells in brain glioma

Zhao Zhong-fu^{1, 2}, Fan Rui-tai³, Yang Yong⁴, Sun Jian-rui², Hu Xiang⁵, Eileen Shen⁶, Yang Bo^{2, 7}

1 Department of Neurosurgery, Xuchang Central Hospital, Xuchang 461000, Henan Province, China
2 Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
3 Radiotherapy Center, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
4 Wei Erke Stem Cell Biotechnology (Liaoning) Co., Ltd., Benxi 117003, Liaoning Province, China
5 Shenzhen Beike Cell Engineering Institute, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
6 Dickinson College, Carlisle, PA 17013, U.S.A
7 Open Laboratory of Key Clinical Disciplines of Henan Province Higher Education, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Received:2012-09-16 Revised:2012-12-08 Online:2013-05-07 Published:2013-05-07
Contact: : Yang Bo, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China; Open Laboratory of Key Clinical Disciplines of Henan Province Higher Education, Zhengzhou 450052, Henan Province, China yangbo96@126.com
About author:Zhao Zhong-fu★, Master, Chief physician, Department of Neurosurgery, Xuchang Central Hospital, Xuchang 461000, Henan Province, China; Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China zzf20041986@126.com Fan Rui-tai☆, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Radiotherapy Center, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China Zhan Zhong-fu and Fan Rui-tai contributed equally to this paper.
Supported by:
Key Science and Technology Program of Henan Science and Technology Department, No. 112102310173*; Innovative Research Team-Building Foundation of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, No. TD2011023*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前放疗治疗脑胶质瘤效果不理想，可能因素有很多。
目的：探讨脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外放射敏感性。
方法：取脑胶质瘤细胞，接种于含生长因子的无血清培养基中培养，取细胞活力最强的位点扩增3-5代的肿瘤球细胞，给予不同X射线剂量照射，检测其细胞活力，以确定最适的放疗剂量。
结果与结论：胶质瘤中不同部位的肿瘤细胞增殖活力有差异；8 Gy以上X射线剂量对脑肿瘤干细胞具有显著的杀伤作用。说明脑胶质瘤具有异质性，部位不同，脑肿瘤干细胞增殖活力不同；不同的放疗剂量对脑肿瘤干细胞有不同的影响。

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 脑肿瘤干细胞, 胶质瘤, 生长因子, 放射敏感性, 放疗, 照射, 剂量, 个体化定位, 增殖活力, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Radiotherapy effect on of brain glioma is not ideal, and there are various possible factors that influence the therapeutic effect.
OBJECTIVE: To investigate the in vitro radiosensitivity of brain cancer stem cells in brain glioma.
METHODS: Glioma cells were isolated and seeded into the serum-free medium containing growth factors for culture. Glioma cells from the most active cell site were subcultured to 3-5 generations. Glioma cell vitality was assessed to determine the optimal dose of X-ray radiation.
RESULTS AND CONCLUSION: Distinct difference in activities of proliferation could be found among cancer stem cells from different sites of glioma. X-ray dosages above 8 Gy had notable killing effect on brain cancer stem cells. Different irradiation dosage had different influence on cancer stem cells.

Key words: stem cells, tumor stem cells, brain cancer stem cells, glioma, growth factors, radiosensitivity, radiotherapy, irradiation, dose, individual positioning, proliferation activity, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R394.2

赵中甫，樊锐太，杨永，孙剑瑞，胡祥，Eileen Shen，杨波. 脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外放射敏感性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(19): 3455-3460.

Zhao Zhong-fu, Fan Rui-tai, Yang Yong, Sun Jian-rui, Hu Xiang, Eileen Shen, Yang Bo. In vitro radiosensitivity of brain cancer stem cells in brain glioma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(19): 3455-3460.

图/表（结果） 4

2.1 纳入样本数量分析 在实验过程中样本无脱落，没有进行剔除，进入结果分析的样本数量9例。

2.2 胶质细胞瘤不同位点的细胞活力测定结果 9例胶质细胞瘤中，有6例3个位点间细胞活力不同，有3例2个位点间细胞活力不同。

某例间变性星形细胞瘤(3级)不同位点的细胞活力测定结果：细胞MTT测定统计分析：方差齐性检验示各样本呈方差齐性，单因素方差分析示各总体均数有不同。LSD检验示：前侧(额叶方向)细胞活力与后侧(枕叶方向)比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，但是前侧(额叶方向)与内(中线方向)、外(皮质方向)、中(瘤体中心)相比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；后侧(枕叶方向)与内(中线方向)、外(皮质方向)、中(瘤体中心)相比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；内(中线方向)、外(皮质方向)相比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，与中(瘤体中心)相比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。综合上述分析结果，各组之间的细胞活力综合排序为：内(中线方向)=中(瘤体中心)>前(额叶方向)=后(枕叶方向)>外(皮质方向)，见表1，图1。

2.3 胶质瘤的放射敏感性 9例胶质细胞瘤细胞活力最强的位点扩增3-5代的肿瘤球细胞X射线照射后3 d的细胞活力测定结果均显示，2，3以及5 Gy组之间放疗效果差异无显著性意义，8 Gy以上组放疗效果比5 Gy以下组差别明显。

同一例间变性星形细胞瘤细胞活力最强的位点扩增3-5代的肿瘤球细胞X线照射后3 d的细胞活力测定结果：细胞MTT测定统计分析显示：方差齐性检验示各样本呈方差齐性，单因素方差分析示各总体均数有不同。见表2。

LSD检验显示：2，3，5 Gy组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；2，3 Gy组分别与8，12，15 Gy组相比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；5，8 Gy组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，但是，5 Gy组与12，15 Gy组相比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；8，12，15 Gy组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。从均数图上看，各剂量组间细胞活力无论有无显著性意义，均随着放射剂量增加，细胞活力逐渐下降，见图2。

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引言

脑胶质瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，占成人所有恶性肿瘤的2%，主要呈浸润性生长，其病理特征与恶性程度有很大差异，易复发及侵袭性强是其生物学特征。虽有大量的基础和临床研究，但患者的预后仍不满意^[1]。近年来，随着人们对肿瘤细胞研究的不断深入，提出了“肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)学说”^[2-3]，认为肿瘤细胞具有异质性，在肿瘤组织中存在数量极少的瘤细胞，在肿瘤的发生、发展中充当着干细胞的角色，具有无限增殖的潜能，在肿瘤的发生和生长中起着决定性作用，而其余大多数细胞为肿瘤干细胞的分化细胞，不具有成瘤能力，经过短暂的分化，最终死亡，并认为正常干细胞是肿瘤干细胞形成的靶细胞。Singh等^[3-6]从髓母细胞瘤等脑肿瘤组织内分离并鉴定出一种新的肿瘤干细胞，并证实其为“脑肿瘤干细胞”。研究证实，脑胶质瘤细胞存在异质性，有恶性程度相对高的区域肿瘤组织的异质性是由于脑肿瘤干细胞比例或活力不同造成的，细胞活力强的部位脑肿瘤干细胞的比例或活力一定会高^[2-7]。目前放疗治疗脑胶质瘤效果不理想，可能与瘤床中或瘤床周围肿瘤增生活跃区不明确、因而未能靶向性聚焦、给予摧毁性瞄准照射有关，也可能与脑肿瘤干细胞的放射敏感性明显降低有关^[8]，也可能与单次大剂量放疗产生的严重并发症有关^[9-11]。为了寻找胶质瘤放疗的具体靶点和最适当的放疗剂量，课题组设计了此实验。用MTT法检测一个胶质瘤中不同位点的细胞增殖情况以确定放疗的具体靶点，取细胞活力最强的位点扩增3-5代的肿瘤球细胞，给予不同X射线剂量照射，检测其细胞活力，以确定最适的放疗剂量。期待为脑胶质瘤的个体化定位化放疗提供基础实验依据。

材料方法

设计：细胞学体外实验。时间及地点：实验于2010年4至10月在郑州大学医学院实验中心完成。

材料：

标本来源：脑肿瘤组织来自郑州大学第一附属医院神经外科手术术中切除的脑胶质瘤标本，共9例。其中星形细胞瘤4例，WHOⅢ级2例，Ⅳ级2例；髓母细胞瘤2例，WHOⅣ级；室管膜瘤2例，WHOⅢ级；少突胶质细胞瘤1例，WHOⅢ级。

纳入标准：①全部标本均经郑州大学第一附属医院病理科检验证实，并按WHO2007年中

枢神经系统肿瘤分类分级标准进行分类^[12]。②均为初发病例，术前未行放化疗等抗肿瘤治疗，标本获取均征得患者知情同意，并经过医院伦理委员会批准。

排除标准：肿瘤组织囊性变、坏死、电凝的标本。

脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外放射敏感性实验的主要试剂：

Main reagents and instrument:

实验方法：

细胞取材、培养及鉴定：方法参照Singh等^[4,13-14]的悬浮培养法。对本组所有病例，均在显微神经外科手术中，结合影像学资料与术中瘤体显露，确定肿瘤相对最大层面上的5个位点：前(额叶方向)、后(枕叶方向)、内(中线方向)、外(皮质方向)、中(瘤体中心)。要求肿瘤组织无囊性变、无坏死、未电凝。取上述5个位点的肿瘤组织标本各1块，直径5-10 mm，立即置入无菌注射器中，外加无菌包布严密包裹，送实验室进行分离培养。鉴定方法同文献报道^[4,6,15-19]。

胶质瘤中不同位点的细胞增殖测定：结合影像学资料与术中瘤体显露，确定肿瘤相对最大层面上的5个位点：前(额叶方向)、后(枕叶方向)、内(中线方向)、外(皮质方向)、中(瘤体中心)。取制成单细胞悬液即原代肿瘤干细胞悬液，按5×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于96孔板中，每个位点重复10孔，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中过夜。取-20 ℃冻存的MTT溶液37 ℃水浴融化，每孔内加入该溶液20 μL(终浓度约0.5 g/L)，轻轻拍打96孔板边缘混匀，在体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱培养内放置4 h。4 h后倒置显微镜观察见96孔培养板底部大量紫蓝色结晶，小心地将培养液吸除100 μL，每孔加入溶解液(二甲基亚砜)100 μL，轻轻拍打96孔板边缘混匀，振荡使晶体充分溶解后，在酶标仪(Bio-Rad公司，550型)570 nm处测定吸光度(A值)。

胶质瘤的放射敏感性测定^[20-21]：取上述测定的细胞活力最强的位点扩增3-5代的肿瘤球细胞，按5×10⁸ L^-¹的细胞浓度先接种于6孔板中，每孔5 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中过夜，分别给予分别给予2，3，5，8，12，15 Gy的直线加速器产生的6 MV X射线照射。照射后，吹打混匀，再分别接种于96孔板，每板每个剂量组重复10孔，继续培养3 d，同上法测定吸光度(A值)。

主要观察指标：细胞的吸光度值(A值)。

统计学分析：用统计软件SPSS 17.0处理数据，采用单因素方差分析及LSD法，α=0.05。

讨论

目前放疗治疗脑胶质瘤效果不理想，可能与瘤床中或瘤床周围肿瘤增生活跃区不明确、因而未能靶向性聚焦、给予摧毁性瞄准照射有关，也可能与脑肿瘤干细胞的放射敏感性明显降低有关^[8]，脑肿瘤干细胞即为CD133⁺细胞，对肿瘤的生长、播散、复发等临床行为起决定性作用，并且难以通过传统放化疗根除^[21]。这样的“肿瘤增生活跃区”，相当于肿瘤中的根基，称之为“肿瘤巢”，与肿瘤干细胞的生物学特性高度一致。实验已经提示，脑胶质瘤内有肿瘤干细胞根基的存在^[7]。脑肿瘤干细胞和神经干细胞一样均表达Nestin和CD133^[7]，这与文献报道一致^[2^，^12]。同时发现，在进行肿瘤球培养时，也出现大量的非聚集的单个细胞，这些细胞都沉淀于培养瓶底，均不表达CD133和Nestin。9例胶质细胞瘤中，有6例3个位点间细胞活力不同，有3例2个位点间细胞活力不同。这个结果提示脑胶质瘤细胞的异质性，每例脑胶质瘤可能有二三个“肿瘤巢”。因此，作者进行术后X刀等放射治疗时，就要以这些“肿瘤巢”为靶点。

脑胶质瘤放疗目前多主张采用局部野照射，根据术前MRI/CT，先给予肿瘤瘤床及周围水肿带外2 cm的区域照射，然后缩野在瘤外2 cm的区域追加剂量^[23-25]。临床研究显示，常规分割剂量小于60 Gy，患者生存期降低；而大于60 Gy，放射性脑损伤增加，但生存期差异无统计学意义^[26]，尽管有多种超分割方案，但不能明显提高生存率^[28-30]。实验研究结果提示，2 Gy，3 Gy以及5 Gy组之间放疗效果没有明显差别，8 Gy以上组放疗效果比5 Gy以下组差别明显。常规放疗效果差，可能与定位差和单次剂量放疗剂量过小有关，因此不能定点清除“肿瘤巢”，难免导致肿瘤复发。

精确瘤床放疗技术可做到定位准确，解决了常规放疗定位差的问题，可明显降低正常脑组织剂量，从而降低辐射相关并发症^[31-33]。三维适形放疗(Three- dimensional conformal radiotherapy，3DCRT)和立体定向放射外科(stereotactic radiosurgery，SRS)均可精确定位，可大剂量集中照射病灶区，实现治疗体积内高剂量辐射，而对周围正常脑组织的辐射剂量较小^[26,34]，三维适形放疗组1年，2年和3年生存率与立体定向放射外科组相似^[9]。资料显示，立体定向放射外科放射性脑水肿反应明显高于三维适形放疗，并可产生严重并发症^[9-11]。三维适行放疗总剂量为36-50 Gy，每次分割剂量6.0-7.0 Gy，隔日1次，共需6-8次完成；光子刀治疗时80%的边缘剂量为15-25 Gy，一次完成。低单次放疗剂量造成放射性脑损害轻微，高单次放疗剂量造成放射性脑损害严重。因此，实验有必要探求单次放疗的最适剂量。

胶质瘤常规放疗总剂量为60 Gy，常规分割每次为 2 Gy，超分割每次1.2-1.8 Gy/次，加速超分割每次1.9-2.65 Gy/次；三维适行放疗总剂量为36-50 Gy，每次分割剂量6.0-7.0 Gy，隔日1次，共需6-8次完成；光子刀治疗时80%的边缘剂量为15-25 Gy，一次完成。实验以这几个剂量为基础，设计了实验组。9例胶质细胞瘤病例，结果均显示，2 Gy，3 Gy，5 Gy组间差异无显著性意义；2 Gy，3G y组分别与8 Gy，12 Gy，15 Gy组相比较差异均有显著性意义；5 Gy，8 Gy组间差异无统计学意义，但是，5 Gy组与12 Gy，15 Gy组相比较差异均有显著性意义；8 Gy，12 Gy，15 Gy组间差异无显著性意义。从均数图上看，各剂量组间细胞活力无论有无显著性意义，均随着放射剂量的增加，细胞活力逐渐下降。结果可以看出，一次放疗剂量越大，肿瘤周边正常组织的放射性损伤越严重，因此放疗时不应该选择一次放疗剂量过大的放疗方案。因此说，每次8 Gy的放疗剂量可能是胶质瘤放疗的最佳剂量，此剂量的三维适形调强放疗方案可能既有助于提高疗效还能减少脑部并发症的发生。手术切除肿瘤干细胞根基后，残余组织里面有可能仍然存在肿瘤干细胞，可作为后续立体定向放射治疗的重要靶区；同时测定该活力位点扩增3-5代脑肿瘤干细胞的放射敏感性，能够发现对应的最适放疗剂量；总之，最适放疗剂量的三维适形调强放疗方案可能是最佳的放疗方案。如果同时对活力位点扩增3-5代的脑肿瘤干细胞的化疗敏感性进行测定，那么应该能够发现较适合的化疗药物和剂量。同时，应用海洋单细胞海藻的有效成分结合人脐带沃顿胶间充质干细胞移植^[35]，就可以实现脑胶质瘤的个体化定位化治疗，提高胶质瘤的临床治愈率。

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已发表文章：中国临床神经外科杂志.2009；14（6）：348-352
主要观察指标：采用 TUNEL、Annexin-FITC 等方法检测多形性胶质母细胞瘤中肿瘤干细胞凋亡及观察照射后肿瘤干细胞裸鼠颅内移植的致瘤性的变化。
结论：多形性胶质母细胞瘤经过放射治疗后原位复发可能是由于其中的脑肿瘤干细胞对射线抗拒而导致。

已发表文章：山东医药.2011；51（25）：12-14.
主要观察指标：采用不同剂量放射线照射 U87 细胞及其 CSCs，应用集落形成实验和生存曲线检测其生存情况。
结论：在体外条件下，CSCs 的放射敏感性明显低于 U87 细胞，其可能是恶性脑胶质瘤放疗抵抗的主要原因。。

已发表文章：郑州大学学报( 医学版).2011；46（6）：900-903.
主要观察指标：对人脑胶质瘤干细胞及其分化后的胶质瘤细胞分别以 0、2、3、5、8、12 Gy 的 6 MV X 线照射后，继续培养72 h，采用 MTT 法检测细胞的增殖情况。
结论：脑胶质瘤干细胞分化后，对放射治疗的耐受性下降。

已发表文章：现代医学.2010;38(2):107-112.
主要观察指标：CCK8法检测化疗药物顺铂及长春新碱分别作用后胶质瘤细胞及其干细胞活性的变化；
结论：胶质瘤干细胞较胶质瘤细胞化疗敏感性降低。

拟发表文章：《中国组织工程研究》
主要观察指标：取脑胶质瘤细胞，接种于含生长因子的无血清培养基中培养，取细胞活力最强的位点扩增3-5代的肿瘤球细胞，给予不同X射线剂量照射，检测其细胞活力，以确定最适的放疗剂量。
结论：胶质瘤中不同部位的肿瘤细胞增殖活力有差异；8 Gy以上X射线剂量对脑肿瘤干细胞具有显著的杀伤作用。说明脑胶质瘤具有异质性，部位不同，脑肿瘤干细胞增殖活力不同；不同的放疗剂量对脑肿瘤干细胞有不同的影响。

脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外放射敏感性

In vitro radiosensitivity of brain cancer stem cells in brain glioma

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