不同培养基培养人脐血间充质干细胞的差异

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (19): 3449-3454.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.005

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不同培养基培养人脐血间充质干细胞的差异

赵霞，路希敬，刘国强，徐敏，邢健，王椋，丁慧芳

胜利油田中心医院血液科，山东省东营市 257000

收稿日期:2023-12-09 修回日期:2023-12-14 出版日期:2013-05-07 发布日期:2013-05-07
通讯作者: 丁慧芳，硕士，主任医师，胜利油田中心医院血液科，山东省东营市 257000
作者简介:赵霞★，女，1981年生，汉族，山东大学第二医院血液专业在读硕士，主治医师，主要从事干细胞移植方面的研究。 alice-xia@163.com

Differences of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells cultured in different media

Zhao Xia, Lu Xi-jing, Liu Guo-qiang, Xu Min, Xing Jian, Wang Liang, Ding Hui-fang

Department of Hematology, Shengli Oil Field Central Hospital, Dongying 257000, Shandong Province, China

Received:2023-12-09 Revised:2023-12-14 Online:2013-05-07 Published:2013-05-07
Contact: Ding Hui-fang, Master, Chief physician, Department of Hematology, Shengli Oil Field Central Hospital, Dongying 257000, Shandong Province, China
About author:Zhao Xia★, Studying for master’s degree, Attending physician, Department of Hematology, Shengli Oil Field Central Hospital, Dongying 257000, Shandong Province, China alice-xia@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：脐血间充质干细胞为干细胞领域的研究热点，但目前传代及扩增此类细胞尚无简单、有效、完美培养方法。
目的：采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质干细胞，以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质干细胞的方法。
方法：无菌条件下取正常足月剖宫产新生儿的脐血，随机分为5组：低糖DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)组、高糖DMEM组、α-DMEM组、低糖DMEM+干细胞因子组、低糖DMEM +骨髓间充质干细胞培养上清组。用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞。将脐血单个核细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的上述培养基中，放置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养，倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化并用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。
结果与结论：①各组间充质干细胞培养48 h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较：低糖DMEM+干细胞因子组、低糖DMEM +骨髓间充质干细胞培养上清组的贴壁细胞数明显多于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组(P < 0.05)，细胞存活率亦明显高于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组(P < 0.05)。②各组间充质干细胞在不同培养时间下生长状态的比较：培养第3，6，9，12，15，18，21天低糖DMEM+干细胞因子组、低糖DMEM+骨髓间充质干细胞培养上清组细胞增殖的速度均快于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组(P < 0.05)。低糖DMEM+干细胞因子组与低糖DMEM +骨髓间充质干细胞培养上清组比较差异无显著性意义。结果可见人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清或干细胞因子共孵育，对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐血间充质干细胞, 低糖DMEM, 体外培养, 干细胞因子, 骨髓间充质干细胞, 培养上清, 分离培养, 扩增, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells are the hot spot in the field of stem cells, and there is no simple, effective culture method for the passage and amplification of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To explore a better culture method of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in vitro with different media in the separation of mesenchymal stem cells at a confluent status.
METHODS: Human umbilical cord blood was sterilely collected from full-term deliveries scheduled for cesarean section. They were assigned randomly into five groups: low-glucose culture medium group, high-glucose culture medium group, α-culture medium group, low-glucose culture medium + stem cell factor group, low-glucose culture medium + human marrow mesenchymal stem cells supernatant group. All culture medium used was Dulbecco’s modIfied Eagle’s medium. The cord blood mononuclear cells were isolated by lymphocyte separation medium. The monocytes of cord blood were inoculated into the culture medium containing 10% fetal bovine serum at 37 ℃ incubator with 0.05 volume fraction of CO2. Quantity and formation of cells were observed with invert microscope, and surface antigenic features were analyzed with flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Comparison on number of adherent cells and survival rate of mesenchymal stem cells cultured for 48 hours: Number of adherent cells in the low-glucose culture medium + human marrow mesenchymal stem cells supernatant group, and low-glucose culture medium + stem cell factor group were significantly increased (P < 0.05), while the survival rate of cells was also increased compared with low-glucose culture medium group, high-glucose culture medium group and α-culture medium group (P < 0.05). (2) Comparison on growth status of mesenchymal stem cells at different culture time points: Cell proliferation in the low-glucose culture medium + human marrow mesenchymal stem cells supernatant group, and low-glucose culture medium + stem cell factor group was more rapid than that in low-glucose culture medium group, high-glucose culture medium group and α-culture medium group at 3, 6, 9, 12, 15, 18 and 21 days (P < 0.05). There was no significant difference between low-glucose culture medium + human marrow mesenchymal stem cells supernatant group and low-glucose culture medium + stem cell factor group. Experimental findings indicate that, co-culture with low-glucose culture medium + stem cell factor or human marrow mesenchymal stem cells supernatant can promote the in vitro isolation, culture and proliferation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, umbilical cord and umbilical cord blood stem cells, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, ow-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium, culture in vitro, stem cell factor, bone marrow mesenchymal stem cells, supernatant, isolation and culture, proliferation, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

赵霞，路希敬，刘国强，徐敏，邢健，王椋，丁慧芳. 不同培养基培养人脐血间充质干细胞的差异[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(19): 3449-3454.

Zhao Xia, Lu Xi-jing, Liu Guo-qiang, Xu Min, Xing Jian, Wang Liang, Ding Hui-fang. Differences of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells cultured in different media[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(19): 3449-3454.

图/表（结果） 4

2.1 脐血间充质干细胞的纯化、扩增及鉴定 从脐血中分离出的单个核细胞接种于低糖DMEM+干细胞因子培养基或低糖DMEM+骨髓间质充质干细胞培养上清培养基后48-72 h开始有细胞贴壁，有的表现为破骨样细胞，有的表现为间充质样细胞，见图1A。6-8 d可见细胞形成集落，细胞体积较前明显增大，呈长梭形或多角形，见图1B。两三周后逐渐形成到几十到几百个细胞的克隆；随着细胞的迅速增殖，三四周后细胞生长达80%-90%融合，每个克隆约几百至几千个细胞。此时的间充质干细胞呈较均一的长梭形，形态类似于骨髓间充质干细胞，但较骨髓间充质干细胞稍小，见图1C。将脐血的原代间充质干细胞用1∶1的2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA混合液消化后，传代培养，一二周左右可达到融合，并表现出较强的传代扩增能力，可继续传代、扩增，传代后形态基本无变化，见图1D。而低糖DMEM、高糖DMEM组、α-DMEM组培养的细胞12 d左右出现小的集落，分化现象较不明显，在培养1个月左右较多细胞凋亡，较少可以继续传代培养，形态同上，且高糖DMEM还具有可使干细胞很快分化，形成巢样细胞，难以维持干细胞特性的特点。

通过流式细胞仪检测结果显示，脐血间充质干细胞均一稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD13、CD105、CD166，但不表达CD34、CD45和HLA-DR，见图2，这与源于骨髓的间充质干细胞的表面抗原标记基本一致。

2.2 各组脐血间充质细胞培养48 h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较 不同培养基培养脐血间充质细胞 48 h后，贴壁细胞和活细胞数有所不同，低糖DMEM+干细胞因子组、低糖DMEM +骨髓间充质干细胞培养上清组明显优于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组 (P < 0.05)，低糖DMEM+干细胞因子组与低糖DMEM+骨髓间充质干细胞培养上清组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 各组脐血间充质细胞在不同培养时间生长状态的比较 分别于培养第3，6，9，12，15，18，21天测定每400倍视野下各组细胞的数量，结果发现低糖DMEM+干细胞因子组、低糖DMEM +骨髓间充质干细胞培养上清组细胞生长迅速且细胞数量明显较多(P < 0.05)，低糖DMEM+干细胞因子组与低糖DMEM +骨髓间充质干细胞培养上清组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.4 各组脐血间充质细胞原代及传代培养达融合时间比较 低糖DMEM+干细胞因子组、低糖DMEM+骨髓间充质干细胞培养上清组的细胞长势好于其余3组细胞，原代融合时间明显较短(P < 0.05)，且成功传代率较高，低糖DMEM+干细胞因子组与低糖DMEM+骨髓间充质干细胞培养上清组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

设计：多样本观察的实验对比研究。

时间及地点：实验于2010年6月至2011年6月在胜利油田中心医院中心实验室完成。

材料：

脐血标本：均来源于胜利油田中心医院产科，获得产妇同意。肝炎病毒、艾滋病毒、梅毒螺旋体感染、胎膜早破和血型不合溶血者均不作为采纳对象。

不同培养基培养人脐血间充质干细胞实验所用的主要试剂和仪器：

Main experimental reagents and instruments:

实验方法：

标本采集和分组：新生儿娩出后，立即断脐，消毒母侧脐带断端，60 mL无菌注射针穿刺脐静脉取血，立即导入肝素抗凝的无菌采血袋内(肝素抗凝终浓度为20-30 U/mL)。同时送检血常规。66份脐血按不同的培养基培养随机分为5组：低糖DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)组13份、高糖DMEM组11份、α-DMEM组12份、低糖DMEM+干细胞因子组15份、低糖DMEM +骨髓间充质干细胞培养上清组15份，所有标本均详细记录来源、采集容量、采集与种板时间间隔、血常规参数等。

骨髓间充质干细胞的采集：取正常志愿者骨髓5 mL，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，接种于含体积分数为10%胎牛血清、低糖DMEM培养基的培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，收集培养上清，过滤备用。

脐血间充质干细胞的分离培养：将采集的新鲜脐血，用体积分数为70%乙醇擦拭采血袋的塑料导管，用无菌注射器将脐血转移入15 mL离心管，2 000 r/min离心 20 min，弃去上清，取沉降红细胞以上含白膜的一部分血液缓缓加入密度为1.077 g/cm³的淋巴细胞分离液上形成一明显的界面，上下液体勿混合，分离液与血液比为2∶3，密度梯度2 000 r/min离心20 min分离脐血单个核细胞，小心吸取中间白膜层，加入2倍体积PBS，1 000 r/min离心10 min洗涤2次，彻底弃上清。

低糖DMEM组加入低糖DMEM培养基(含葡萄糖 1.0 g/L)；高糖DMEM组加入高糖DMEM培养基 (含葡萄糖4.5 g/L)；低糖DMEM+干细胞因子组加入低糖DMEM培养基与干细胞因子；低糖DMEM +骨髓间充质干细胞培养上清组加入低糖DMEM与骨髓间充质干细胞培养上清，各组培养基均加入体积分数为10%胎牛血清。

脐血间充质干细胞的扩增：锥虫蓝染色后光学显微镜下计数各组活细胞数目。以1.0×10¹¹ L^-¹细胞浓度接种于塑料培养瓶内，置37 ℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿度培养箱内培养。培养过程中用日本OLMPUS IX71倒置显微镜观察细胞形态的变化，3 d后全量换液，以后根据细胞生长情况，每3-5 d半量换液1次。期间显微镜下分别记录各组培养3，6，9，12，15，18，21 d细胞生长形态，细胞达到80%-90%融合，胰蛋白酶消化，计数。待细胞达到80%-90%融合时，用1∶1的2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA混合液消化，然后按2∶1的比例进行传代接种培养。

流式细胞仪检测：取扩增传代后的第4-7代脐血间充质干细胞，以上方法消化、收获细胞以流式缓冲液冲洗细胞，分别与荧光抗体标记的CD34-PE，CD45-PE，HLA-DR-PE，CD13-PE，CD29-PE，CD105-FITC，CD166-FITC单克隆抗体室温下孵育30 min，再以1 mL流式缓冲液冲洗细胞，10 g/L多聚甲醛于4 ℃固定 30 min，使用FACSCalibur流式细胞仪进行检测。

主要观察指标：①各组间充质干细胞培养48 h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较。②各组间充质细胞不同培养时间下生长状态的比较。③原代及传代培养达融合时间的比较。

统计学分析：数据以x(_)±s表示。数据分析采用多个样本均数比较的方差分析和两独立样本均数比较的t 检验。以上检验中，0.05为显著性水平界值，应用SPSS 13.0软件系统进行统计学分析。

讨论

目前，对于脐血间充质干细胞的存在及能否传代扩增，仍有较大争议^[5]，有关人脐血间充质干细胞培养方法的报道很多，很多实验室力图通过改变培养基成分来获得较多数量的干细胞，但效果都不甚理想。糖是细胞培养液中最主要的能量来源。细胞培养基中含糖的高低直接影响干细胞的生长，而实验证明高糖可使干细胞很快分化，难以维持干细胞特性。过低糖分或无糖的培养基又不能维持干细胞正常生长，所以寻求一种较为合适的培养基对脐血间充质干细胞培养、增殖、纯化至关重要。而脐血间充质干细胞在体外培养过程中，由于其生长周期相对缓慢，其原代细胞培养时间较长，也成为制约脐血间充质干细胞应用的障碍。

目前关于脐血间充质干细胞培养方法的报道很多，很多研究者曾通过改变细胞培养基的成分获得较多数量的干细胞，但效果都不甚理想。一些实验室采用L-DMEM培养人脐血间充质干细胞^[6-7]，有的采用DMEM培养基及高糖DMEM培养基^[8-10]，而一些研究者则使用Mesencult ^TM专用培养基得到较高比例的间充质干细胞^[11-12]。还有研究者研究表明，低糖DMEM、IMDM 培养基有利于脐血间充质干细胞的生长^[13]。鉴于此，实验通过使用不同培养基培养脐血间充质干细胞，并比较其优缺点，旨在为脐血间充质干细胞体外分离、培养、扩增，寻找一种较好的培养基。通过有效途径成功分离出较多的脐血单个核细胞，并培养出融合状态的间充质细胞，并且分别采用了5种不同的培养基对人脐血间充质干细胞进行培养。结果发现低糖DMEM+干细胞因子组和低糖DMEM+骨髓间充质干细胞培养上清组细胞生长旺盛，提示这两种方法较好，但是由于干细胞因子用量较大，价格较贵，所以低糖DMEM联合应用干细胞因子的方法并不十分适用。而人骨髓间充质干细胞培养上清提供了脐血间充质干细胞最佳的生长条件，由于目前国内骨髓间充质干细胞的研究日益成熟，证实骨髓间充质干细胞中分泌的多肽类物质，能特异性地与某些细胞膜上的受体结合，激活细胞内某些酶，引起一系列连锁反应，从而调节细胞生长、分化。骨髓间充质干细胞其培养上清中所含有的一些生长因子如：白细胞介素3、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子、干细胞因子、促红细胞生成素、血小板生成素通过协同作用能促进脐血间充质干细胞增殖^[14-15]，刺激其增殖及分化，加快其集落的形成，延长细胞的存活时间，这就为脐血间充质细胞培养成功创造了条件。实验通过流式细胞仪观察了间充质干细胞7种表面分子抗原的表达：CD13、CD166(间质细胞表达阳性)、黏附分子CD105、CD29 (整合素家族的成员)、CD34(造血干细胞/祖细胞及内皮细胞呈阳性)、CD45(白细胞阳性)。CD34、CD45、HLA-DR均为阴性，表明脐血间充质干细胞是脐血中区别于造血细胞的处于未分化状态的非定向干细胞/祖细胞，它的表型与骨髓间充质干细胞一致。

目前，多数使用的种子细胞主要为来源于骨髓的间充质干细胞，但其数量随着标本来源人群年龄的增长而明显下降。本文中为脐血来源的间充质干细胞，存在很大的优势，主要在于：①脐血中含有的间充质干细胞较人骨髓中间充质干细胞更为原始，具有更强的分化能力。②脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集。其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单，对于新生儿及产妇没有任何痛苦和不良影响。也不会涉及社会、伦理及法律方面的更多争论。③脐血受胎盘屏障的保护。其成分被病毒、细菌污染的概率低。④脐血包含丰富的间质干细胞，不仅可用于造血系统疾病，也可用于非造血系统疾病的治疗。⑤脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应。⑥收集的脐血不仅可做异基因移植的供体，而且还可将之低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。而且随着世界各国脐血库的建立完善及脐血体外扩增技术的成熟，为脐血的临床应用奠定了坚实的基础。

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