健骨颗粒促进成骨细胞增殖的分子机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.003

中国组织工程研究

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健骨颗粒促进成骨细胞增殖的分子机制

林煜¹，卢天祥²，吴银生³，黄云梅³，林燕萍³

1厦门大学附属福州第二医院骨科，福建省福州市 350007
2泉州市第一医院骨科，福建省泉州市 362000
3福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350108

收稿日期:2012-09-13 修回日期:2012-10-28 出版日期:2013-04-09 发布日期:2013-04-09
通讯作者: 林燕萍，博士，教授，福建中医药大学中西医结合研究院骨病研究所，福建省福州市 350108 lyp66@126.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(81173282)；福建省科技厅重点项目(2009Y0028)资助。

Molecular mechanism by which Jiangu granules promote osteoblast proliferation

Lin Yu¹, Lu Tian-xiang², Wu Yin-sheng³, Huang Yun-mei³, Lin Yan-ping³

1 Department of Orthopedics, Second Hospital of Fuzhou City, Xiamen University, Fuzhou 350007, Fujian Province, China
2 Department of Orthopedics, First Hospital of Quanzhou City, Quanzhou 362000, Fujian Province, China
3 Institute of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, Fujian Province, China

Received:2012-09-13 Revised:2012-10-28 Online:2013-04-09 Published:2013-04-09
Contact: Lin Yan-ping, Doctor, Professor, Institute of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, Fujian Province, China lyp66@126.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：ERK是依赖于Ras途径激活的一个蛋白激酶，在成骨细胞增殖和分化过程中发挥重要作用。而PD98059是MEK特异性抑制剂，它可通过抑制MEK的活性来抑制ERK的磷酸化，从而起到阻断ERK信号通路的作用。目前有关ERK在大鼠成骨细胞增殖和分化过程中的作用研究甚少。ERK在健骨颗粒促进大鼠成骨细胞增殖和分化过程中调控的作用更未被阐明。
目的：观察ERK信号转导通路在健骨颗粒促成骨细胞增殖和分化过程中的作用。
方法：取第3代SD大鼠头盖骨成骨细胞，空白组加入生理盐水血清；中药组加入最佳浓度的健骨颗粒含药血清；阻滞剂组添加PD98059阻断剂，中药加阻断剂组添加PD98059阻断剂与健骨颗粒含药血清。用MTT法测定细胞的增殖能力，比色法测碱性磷酸酶、羟脯氨酸水平。收集细胞实时荧光定量PCR-SYBR GREEN法检测Cbfa1、Ⅰ型胶原、OSX mRNA的表达，Westren blot法检测成骨细胞ERK的表达情况。
结果与结论：添加PD98059阻断剂后，阻滞剂组和中药加阻滞剂组中ERK的表达显著低于空白组和中药组。阻断剂组的成骨细胞内碱性磷酸酶、羟脯氨酸的表达以及Cbfa1、Ⅰ型胶原、OSX mRNA表达显著低于空白组和中药组。ERK在健骨颗粒促进大鼠成骨细胞增殖和分化过程中发挥重要作用，ERK信号通路可能是健骨颗粒促进成骨细胞增殖和分化的主要途径。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, ERK, PD98059, 健骨颗粒, 成骨细胞, 增殖, 分化, 碱性磷酸酶, 羟脯氨酸, Cbfa1, Ⅰ型胶原, OSX, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Extracellular signal-regulated kinase is a protein kinase dependent on Ras pathway activation, and plays an important role in the proliferation and differentiation of osteoblasts. PD98059 is a specific MEK inhibitor, and inhibits phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase through inhibition of MEK activity, thus blocking extracellular signal-regulated kinase signaling pathway. At present, the role of extracellular signal-regulated kinase in the process of proliferation and differentiation of rat osteoblasts is reported less. It is still unclear about the role of extracellular signal-regulated kinase in the regulation of osteoblast proliferation and differentiation promoted by Jiangu granules.
OBJECTIVE: To observe the role of extracellular signal-regulated kinase signaling pathway in the promotion of osteoblast proliferation and differentiation after intervention with Jiangu granules.
METHODS: Passage 3 osteoblasts from the skull of Sprague-Dawley rats were harvested and divided into four groups. Control group was intervened with saline serum. Drug group was intervened with the best concentration of serum containing Jiangu granules. Inhibitor group was intervened by PD98059. Combination group was intervened with PD98059 plus serum containing Jiangu granules. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide assay was used to determine proliferative capacity of osteoblasts. Alkaline phosphatase and hydroxyproline levels were measured by colorimetric method. Expression of core binding factor alpha 1, type Ⅰ collagen, Osterix mRNA was measured by PCR-SYBR GREEN. Expression of extracellular signal-regulated kinase in osteoblasts was detected using western blot method.
RESULTS AND CONCLUSION: After blocking extracellular signal-regulated kinase signal pathway, the expression of extracellular signal-regulated kinase in the inhibitor and combination groups was significantly lower than that in the control and drug groups. Levels of alkaline phosphatase and hydroxyproline, as well as core binding factor alpha 1, type Ⅰ collagen, Osterix mRNA expression in osteoblasts, in the inhibitor group were significantly lower than those in the control and drug groups. It is indicated that extracellular signal-regulated kinase exerts an important role in promoting osteoblast proliferation and differentiation after intervention with Jiangu granules.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, extracellular signal-regulated kinase, PD98059, Jiangu granules, osteoblasts, proliferation, differentiation, alkaline phosphatase, hydroxyproline, core binding factor alpha 1, type Ⅰ collagen, Osterix, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

林煜，卢天祥，吴银生，黄云梅，林燕萍. 健骨颗粒促进成骨细胞增殖的分子机制[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.003.

Lin Yu, Lu Tian-xiang, Wu Yin-sheng, Huang Yun-mei, Lin Yan-ping. Molecular mechanism by which Jiangu granules promote osteoblast proliferation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.003.

图/表（结果） 6

2.1 成骨细胞的鉴定结果采用重氮盐法碱性磷酸酶染色后，在显微镜下可见成骨细胞胞浆内含紫蓝色颗粒。随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，结果表明细胞纯度为(90.2±3.64)%。
2.2 不同浓度PD98059、血清对成骨细胞增殖的影响 MTT检测显示，各组细胞均随血清浓度增加而表现为增殖加快，当血清浓度至20%时增殖速度最快，其后随着血清浓度继续增加，增殖速度下降。且中药组与同浓度空白组相比，有显著性的增高(P < 0.05)，见图1。故20%为最佳浓度，用于以下实验。
PD98059干预72 h后发现，细胞的增殖能力下降，并且随着浓度的上升增殖能力下降，呈浓度依赖性，与空白组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)，故可确定50 μmol/L为最佳阻滞剂浓度，见表1。

2.3 细胞培养液中碱性磷酸酶、羟脯氨酸的含量各组碱性磷酸酶水平随时间的增加逐渐增加，差异均有显著性意义，且各时间点比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。而培养液中的羟脯氨酸表达结果为：中药组高于中药加最佳浓度阻滞剂组与空白组，最佳浓度阻滞剂最低。并且除空白组外，各组均随时间的增加羟脯氨酸含量逐渐增加，组间比较差异均有显著性意义，且各时间点比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.4 各组成骨细胞中Cbfa1、Ⅰ型胶原和OSX mRNA相对表达水平的荧光定量RT-PCR分析 Cbfa1、Ⅰ型胶原、OSX和β-actincDNA的荧光定量PCR扩增曲线，见图2。同时，荧光定量RT-PCR产物的溶解曲线分析也表明，各基因的荧光定量RT-PCR均为特异性扩增，表现为单一的溶解峰，见图3。

荧光定量RT-PCR的结果显示：空白组Cbfa1基因mRNA的相对表达水平明显低于中药组。PD98059阻滞剂组干预第1至3天差异无显著性意义。最佳阻滞剂加中药组与空白组的Cbfa1 mRNA表达随着时间延长而呈上升趋势。中药组第2天含量最高。空白组Ⅰ型胶原基因mRNA的相对表达水平明显低于中药组，PD98059阻滞剂组明显低于最佳阻滞剂加中药组，各组Ⅰ型胶原基因mRNA表达随着时间延长而呈上升趋势。空白组OSX基因mRNA的相对表达水平明显低于中药组。PD98059阻滞剂组干预第1、2天差异无显著性意义(P > 0.05)。空白组的OSX mRNA表达随着时间延长而呈上升趋势，见表3。

2.5 成骨细胞ERK蛋白表达结果 Western blot结果显示：中药组的ERK表达最高，最佳浓度阻滞剂加中药组次之，以上两组均高于各浓度阻滞剂组与空白组，各组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，空白组为0.676±0.011；中药组为0.987±0.037；50 μmol/L PD98059阻滞剂组为0.538±0.027；50 μmol/L PD98059阻滞剂+中药组为0.703±0.011，P < 0.05，见图4。

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引言

材料方法

设计：随机对照细胞实验。
时间及地点：实验于2007年9月至2010年9月在福建省中西医结合研究院实验室，福建医科大学分子医学研究中心完成。
材料：
实验动物：新生SD大鼠2只，由福建医科大学动物房提供，合格证号：医动字第2006-002；清洁级3月龄雄性SD大鼠20只，体质量(180±20) g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2003- 0003。实验过程中对动物处置均符合中华人民共和国科学技术部颁布《关于善待实验动物的指导性意见》相关要求。
实验药物：健骨颗粒主要由淫羊藿、煅狗骨、党参、山药、山茱萸等组成，原药材购自福建省医药公司，制剂由福建省中医药研究院中试车间负责加工制备，每克颗粒含生药2.9 g。
ERK信号转导通路干预健骨颗粒促成骨细胞增殖和分化实验所用主要试剂与仪器：
Main reagents and instruments:

方法：
成骨细胞培养、纯化与鉴定[11-14]：取24 h内新生SD大鼠2只，置于体积分数为75%乙醇中消毒5 min，无菌条件下分离其颅盖骨，刮除骨膜及软组织，用PBS漂洗3次。将洗净的颅盖骨剪成1 mm×1 mm的小片，用含0.1%Ⅰ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶的混合消化液预消化20 min，弃去消化液，再加入0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，37 ℃条件下将骨片消化30 min，每隔10 min摇晃1 min，收集消化液，重复操作3次。将收集的消化液以 1 000 r/min离心5 min，用完全培养基重新调成细胞悬液移进培养瓶中，在37 ℃，体积分数为5%CO2、饱和湿度下培养，次日换液，以后每2 d换全液1次，直至细胞长成融合状态进行细胞传代。采用差速贴壁法使成纤维细胞先贴壁可以纯化成骨细胞。当细胞生长融合后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，置培养瓶中培养贴壁8-10 min，轻吸培养液于另一培养瓶中，重复此过程二三次，取悬浮于培养液中的细胞分瓶培养，下次传代时重复此法。取第3代细胞进行实验，检测前进行成骨细胞鉴定。采用倒置相差显微镜每日观察细胞的生长情况及形态特征，用重氮盐法(改良Kaplow氏法)进行碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞。
分组：PD98059溶于二甲基亚砜后，分别加入含生理盐水血清或健骨颗粒血清的培养基中。取第3代细胞以1×108 L-1传代接种于培养瓶中，分为空白组(加入生理盐水血清)、阻断剂组(加入ERK阻断剂PD98059)、中药组(加入健骨颗粒含药血清)和中药加阻断剂组(加入健骨颗粒含药血清和PD98059)，干预1，2，3 d后收集上清液或细胞用于检测。
不同浓度含药血清对成骨细胞增殖的影响：取第3代成骨细胞，以2×109 L-1接种于96孔板中，分别加入1%，5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%生理盐水血清或健骨颗粒含药血清的DMEM培养基，每个浓度设6孔，培养72 h。72 h后用MTT法分析细胞增殖情况，结果以酶标仪570 nm处测得吸光度值表示。并根据MTT结果筛选血清最佳浓度，用于以下实验。
比色法检测细胞液中碱性磷酸酶的水平：取1，2，3 d收集的培养液0.05 mL加入各试管中，同时取0.1 g/L酚标准应用液0.05 mL、蒸馏水0.05 mL加入空试管中，然后各管中再分别加入缓冲液、基质液0.5 mL充分混匀，37 ℃水浴15 min，最后加入1. 5 mL显色剂，混匀，在酶标仪上520 nm处，0.5 cm光径比色，空白管调零，检测各管的吸光度。
比色法检测细胞液中羟脯氨酸的水平：取1，2，3 d收集的培养液0.25 mL，另外取2 mg/L标准应用液0.25 mL及蒸馏水0.25 mL加入空试管中，以上各管再分别加入消化液0.05 mL混匀，37 ℃水浴3 h，每管加入试剂一 0.5 mL混匀，室温静置10 min，加入试剂二0.5 mL，混匀室温静置5 min，加入试剂三1 mL混匀，60 ℃水浴 15 min，流水冷却后3 500 r/min离心10 min，取上清液在酶标仪上550 nm，1 cm光径比色，空白管调零，测各管的吸光度。
SYBR GREEN法检测Cbfa1、Ⅰ型胶原、OSX mRNA的表达：收集干预后1，2，3 d的细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳，结果通过凝胶图像分析系统分析电泳结果，确定RNA无降解后，检测RNA的吸光度值，计算RNA的浓度，根据浓度计算出体积后取 500 ng的RNA，按试剂盒步骤进行反转录。
引物序列：
Primer sequence:

反转录后在ABI7500PCR仪上按以下条件反应进行扩增：95 ℃预变性10 min后，95 ℃变性34 s，60 ℃延伸1 min，共45个循环。将得到的各组目的基因及β-actin基因的Ct值分别代入各自的标准曲线，换算出各自的起始模板量。以β-actin作为参比基因对所有样品进行RNA校正，以空白组mRNA的表达量作为“1”，再根据校正值计算出其他各组的相对量，最后进行组间相对量的比较。
Western Blot检测ERK表达水平：弃去细胞培养液，采用RIPA裂解细胞，抽提总蛋白，考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。常规电泳、转膜后，加入抗体孵育1 h，加入二抗在室温下封闭膜30 min、洗膜，最后将AP化学发光底物与膜室温下孵育反应5 min，暗室中压上X射线片曝光、显影。采用Phoretix 1D生物电泳图像分析系统读取并记录胶片中目的条带的吸光度值。
主要观察指标：①PD98059、健骨颗粒含药血清对成骨细胞增殖的影响。②各组培养液中碱性磷酸酶、羟脯氨酸的含量。③各组成骨细胞Cbfa1、Ⅰ型胶原、OSX mRNA的表达。④各组成骨细胞ERK蛋白水平的表达。
统计学分析：由第一作者应用SPSS 15.0软件包进行统计学分析，参数值用x(_)±s表示，多组间比较先采用F检验，而后两组间比较进行q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

ERK的功能是控制细胞分化，ERK激活后可磷酸化许多不同的靶蛋白，并通过影响细胞周期机制来调节细胞增殖[15-19]。ERK参与了对OSF2/Cbfa1的转录调节并且在成骨细胞特异基因表达中发挥重要作用：Ge等[20]已通过用转基因技术确定ERK-MAPK途径通过调节Cbfa1mRNA的表达而刺激成骨细胞的分化及骨骼发育的作用。有学者采用显性失活法，将ERK-DN转染入成骨细胞，其碱性磷酸酶表达及骨基质沉积均受了抑制，同时由于细胞和Ⅰ型胶原、OPN的黏附降低，抑制了细胞的伸展、移位。因此ERK在成骨细胞的分化和增殖中发挥着重要的作用，并且对成骨细胞的黏附、伸展位移也具有重要意义[21]。

成骨细胞碱性磷酸酶的表达是成骨细胞增殖及早期分化成熟的重要指标，是细胞骨化所必须的的酶，能促进细胞外基质的矿化[22]。Ⅰ型胶原也是成骨细胞早期形成的标志蛋白。骨的有机质90%由Ⅰ型胶原构成，Ⅰ型胶原表达其他蛋白质所没有的羟脯氨酸，也是反映成骨细胞分化成熟的重要指标[23-24]。在成骨细胞分化过程中，OSX位于Cbfa1的下游，Cbfa1主要调控间质细胞向前成骨细胞的分化，而OSX在成骨细胞分化、成熟、矿化的中起作用[25-27]。

PD98059是MAPK信号传导通路的特异性阻断剂，能特异地抑制ERK的上游激酶，即通过与非活性形式的MEK1结合来抑制MEK1 的激活与磷酸化，因而具有阻断ERK信号通路的作用[28-31]。本实验结果显示，阻断ERK信号转导通路后，阻滞剂组内成骨细胞内ERK、AKP的表达以及Cbfa1、OSX、Ⅰ型胶原mRNA和羟脯氨酸的表达显著低于空白组，表明ERK信号通路是成骨细胞增殖、分化所必须的。而ERK抑制剂PD98059对其有一定的效果，能抑制成骨细胞磷酸化和钙沉积的出现。同时含药血清作用于阻滞剂后成骨细胞内碱性磷酸酶的表达高于单纯信号阻断组，说明健骨颗粒能促进成骨细胞的增殖和分化。中药组以及中药加阻滞剂组Cbfa1和OSX的表达高于阻断剂组和空白组，同时阻断剂组、中药加阻滞剂组的Cbfa1和OSXmRNA的表达低于空白组和中药组。这说明了健骨颗粒能促进成骨细胞的增殖和分化。然而中药组以及中药加阻滞剂组Cbfa1和OSX的表达高于阻断剂组和空白组，提示健骨颗粒促成骨细胞增殖分化，还可能通过其他信号传导通路发挥作用，有待于进一步的研究。

综上分析，ERK是大鼠成骨细胞增殖和分化过程中不可缺少的信号蛋白，采用PD98059阻断ERK信号通路后，健骨颗粒能上调成骨细胞ERK的表达，说明其在一定程度上通过ERK信号通路促进成骨细胞的增殖和分化。

健骨颗粒促进成骨细胞增殖的分子机制

Molecular mechanism by which Jiangu granules promote osteoblast proliferation

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