土鳖虫含药血清干预骨髓间充质干细胞的成脂分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.019

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (14): 2597-2602.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.019

• 干细胞与中医药 stem cells and traditional Chinese medicine • 上一篇下一篇

土鳖虫含药血清干预骨髓间充质干细胞的成脂分化

齐振熙¹，李树强²，于涛³

1福建中西医结合研究院骨病研究所，福建省福州市 350108
2内江市第一人民医院，四川省内江市 641000
3福建中医药大学骨伤学院，福建省福州市 350108

收稿日期:2012-07-17 修回日期:2012-08-29 出版日期:2013-04-02 发布日期:2013-04-02
作者简介:齐振熙☆，男，1957年生，福建省福州市人，汉族，2004年福建中医药大学毕业，博士，教授，主要从事股骨头缺血性坏死的研究。 Zxqi@fjtcm.edu.cn
基金资助:
福建省科技计划项目(2007F5060)，课题名称：土鳖虫对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的干预作用。

Eupolyphaga sinensis-containing serum influences the adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Qi Zhen-xi¹, Li Shu-qiang², Yu Tao²

1 Bone Disease Institute, Academy of Integrative Medicine Fujian China, Fuzhou 350108, Fujian Province, China
2 First People’s Hospital of Neijiang, Neijiang 641000, Sichuan Province, China
3 Institute of Traumatology, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, Fujian Province, China

Received:2012-07-17 Revised:2012-08-29 Online:2013-04-02 Published:2013-04-02
About author:Qi Zhen-xi☆, Doctor, Professor, Bone Disease Institute, Academy of Integrative Medicine Fujian China, Fuzhou 350108, Fujian Province, China
Supported by:
Technological Planning Project of Fujian Province, No. 2007F5060

摘要/Abstract

摘要：

背景：实验拟通过土鳖虫对激素诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的影响，解释中药土鳖虫治疗股骨头缺血性坏死的作用机制。
目的：观察土鳖虫对地塞米松诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的干预作用。
方法：通过大剂量地塞米松诱导体外培养的骨髓间充质干细胞成脂分化，在诱导成脂的同时给予土鳖虫含药血清干预。检测干预6 d后细胞内成脂标志物三酰甘油、氧化物酶增殖物激活受体mRNA和脂肪酸相关蛋白mRNA的表达。
结果与结论：土鳖虫可抑制骨髓间充质干细胞分化过程中氧化物酶增殖物激活受体基因和脂肪酸相关蛋白基因的表达，降低三酰甘油水平，说明土鳖虫药物可以逆转因大量激素导致的骨髓间充质干细胞成脂分化增加。

关键词: 干细胞, 干细胞与中医药, 骨髓间充质干细胞, 股骨头坏死, 成脂分化, 中药, 含药血清, 土鳖虫, 地塞米松, 激素, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The experiments try to explain the pathogenesis of Eupolyphaga sinensis for the treatment of avascular necrosis of femoral head through investigating the effect of Eupolyphaga sinensis on the adipogenic differentiation of hormone-induced bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the intervention effect of Eupolyphaga sinensis on the adipogenic differentiation of dexamethasone-induced bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: High-dose dexamethasone was used to induce the adipogenic differentiation of in vitro cultured bone marrow mesenchymal stem cells, and during the adipogenic differentiation, Eupolyphaga sinensis-containing serum was used for intervention. After 6 days intervention, expressions of adipogenic markers, such as triglyceride, peroxisome proliferator-activated receptor mRNA and adipocyte protein 2 mRNA, were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Eupolyphaga sinensis could inhibit the expression of peroxisome proliferator-activated receptor mRNA and adipocyte protein 2 mRNA in the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and could reduce the level of triglyceride, which suggested that Eupolyphaga sinensis drug can reverse the increased adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells caused by high-dose hormones.

Key words: stem cells, stem cells and traditional Chinese medicine, bone marrow mesenchymal stem cells, femoral head necrosis, adipogenic differentiation, traditional Chinese medicine, drug-containing serum, Eupolyphaga sinensis, dexamethasone, hormone, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

齐振熙，李树强，于涛. 土鳖虫含药血清干预骨髓间充质干细胞的成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(14): 2597-2602.

Qi Zhen-xi, Li Shu-qiang, Yu Tao. Eupolyphaga sinensis-containing serum influences the adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(14): 2597-2602.

图/表（结果） 6

2.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞形态和标志抗原CD45和CD90表达阳性率 细胞接种后随即在倒置显微镜下观察，培养液中存在着很多大小不等的圆形细胞，其中，造血细胞为主要成分，见图1。

随着培养时间延长，造血细胞逐渐死亡，其余细胞24 h后开始贴壁，见图2。3 d后，细胞发生明显变化，贴壁的基质细胞伸出突起变为梭形，体积增大，以后细胞突起相互连接。10-12 d后细胞长满瓶底，见图3。传代细胞为圆形，接种五六个小时即迅速贴壁，伸展，重新恢复梭形。24 h基本完成贴壁，五六天细胞即可长满瓶底。各组血清干预五六天后，细胞体积增大，突触变长，形状极不规则。

生长良好的贴壁细胞在第3代时行表面标记物检测。第3代骨髓间充质干细胞CD45阳性率约1.9%，CD90阳性率达99.1%，见图4。

2.2 含药血清干预后骨髓间充质干细胞内三酰甘油水平 各组细胞经药物干预6 d后，模型组细胞内的三酰甘油水平较空白组明显上升，而中药各组较模型组均有明显下降，且随着药量的加大三酰甘油水平呈下降趋势。与模型组比较，空白组和中药低、中、高剂量组差异均有非常显著性意义(P < 0.01)。与空白组比较，中药低剂量组差异有显著性意义(P < 0.05)，中药中剂量组差异无显著性意义(P > 0.05)，中药高剂量组差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表2。

2.3 含药血清干预后骨髓间充质干细胞PPARγ mRNA及aP2 mRNA表达 各组细胞经含药血清干预处理6 d，以GAPDH为对照，PCR扩增产物经电泳分离后在紫光灯下观察，可见在288 bp和312 bp各出现一条带，见图5。

通过凝胶成像扫描系统做半定量分析，以PPARγmRNA与GAPDH的吸光度比值作为该产物的相对值。结果显示：细胞内的PPARγ mRNA含量模型组明显高于空白组，而中药各组较模型组均有明显降低，且随着药量的增加细胞内PPARγ mRNA含量呈下降趋势。与模型组比较，空白组差异有非常显著性意义(P < 0.01)，中药低剂量组差异无显著性意义(P > 0.05)，中药中剂量组差异有显著性意义(P < 0.05)，中药高剂量组差异有非常显著性意义(P < 0.01)。与空白组比较，中药低剂量组差异有非常显著性意义(P < 0.01)，中药中剂量组差异有显著性意义(P < 0.05)，中药高剂量组差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。各组细胞经含药血清干预处理6 d后，以GAPDH为对照，PCR扩增产物经电泳分离后在紫光灯下观察，可见在288 bp和349 bp各出现一条带，见图6。

通过凝胶成像扫描系统做半定量分析，以aP2 mRNA与GAPDH的吸光度比值作为该产物的相对值。结果显示：细胞内的aP2 mRNA含量模型组明显高于空白组，而中药各组较模型组均有明显降低，且随着药量的增加细胞内aP2 mRNA含量呈下降趋势。与模型组比较，空白组差异有非常显著性意义(P < 0.01)，中药低剂量组差异无显著性意义(P > 0.05)，中药中、高剂量组差异均有非常显著性意义(P < 0.01)。与空白组比较，中药低、中、高剂量组差异均有非常显著性意义(P < 0.01)，见表2。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2007年6月至2009年3月在福建省中西医结合研究院完成。
材料：
实验动物：清洁级成年SD大鼠40只，体质量200-250 g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物合格证号SYXK(沪) 2007-0005。30 d龄清洁级SD大鼠4只，雌雄各半，体质量约100 g。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
实验试剂：低糖DMEM培养基(DMEM-LG)、胎牛血清及胰蛋白酶等细胞培养试剂(美国Hyclone)。
实验方法：
土鳖虫含药血清制备：选用优质中药土鳖虫1 kg，由福建中医学院第二附属医院制剂中心一次性加工完成，制成含生药0.5 g/mL浓缩液，4 ℃保存备用。
SD大鼠随机分为4组，分别为中药低、中、高剂量组和空白组，每组10只。根据人鼠用药量及体表面积换算得出灌胃量。空白组灌胃3.6 g/kg生理盐水，中药低、中、高剂量组灌胃1.8，3.6，7.2 g/kg土鳖虫药液，各组灌胃2次/d，早晚各半量，连续灌胃10 d。于第10天一次给予1 d的量，灌胃1 h后腹主动脉采血，3 000 r/min(离心半径15 cm)离心20 min。吸取上层血清，每组放入同一个无菌血清瓶内。经56 ℃，水浴30 min灭活。用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，置-20 ℃保存备用。
骨髓间充质干细胞体外培养与传代：取30 d龄SD大鼠4只，剖取双侧股骨和胫骨，用DMEM液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，按Bereford培养骨髓细胞的方法^[2]，通过细胞贴壁分离，获取骨髓间充质干细胞。置37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养。每3 d换液1次。原代细胞培养12-16 d融合传代，用0.02% EDTA及0.25%胰蛋白酶联合消化细胞，吹打成单细胞液，以5×10⁷ L^-1的浓度，传3代细胞进行以下实验。
骨髓间充质干细胞鉴定^[4]：①形态学鉴定：光镜观察细胞的形态。②细胞表面标志抗原鉴定：取长满瓶底的第3代骨髓间充质干细胞，用流式细胞仪检测其表面标志抗原CD45和CD90阳性表达率。
药物干预骨髓间充质干细胞：第3代骨髓间充质干细胞随机分中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、模型组和空白组。中药各组分别加入含不同浓度含药血清的培养液(1 L培养基中含100 g含药血清)，同时加地塞米松至终浓度10^-6 mol/L；模型组加入含生理盐水血清的培养液，同时加地塞米松至终浓度10^-6 mol/L；空白组加入含生理盐水血清的培养液，不加地塞米松。
成脂标志物检测：
细胞内三酰甘油水平测定：5组细胞干预6 d后，每组取8个样本，用0.02% EDTA及0.25%胰蛋白酶联合消化，1 000 r/min(离心半径15 cm)离心10 min。收集细胞，反复冻融3次裂解，3 000 r/min(离心半径15 cm)，离心10 min。收集上清液，参照试剂盒说明书在酶标仪上检测三酰甘油水平。
氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferation- activated receptor γ，PPARγ)mRNA和脂肪酸相关蛋白(adipocyte protein 2，aP2)mRNA表达的测定：①总RNA提取：5组细胞干预6 d后，每组取8个样本。一步法提取总RNA，按Trizol Reagent 说明书操作。②反转录：按照Promega A3500试剂盒换算得如下反应体系：10×buffer 2 µL、25 mmol/L MgCl₂ 4 µL、10 mmol/L dNTP 2 µL、500 U/mL Random Primer 1 µL、40 U/mL RNA inhibitor 0.5 µL、25 U/mL AMV 0.6 µL、总RNA 1 µg，DEPC处理水补至20 µL。加样后放入PCR扩增仪里反转录，程序设定为：25 ℃× 10 min，42 ℃×60 min，99 ℃×5 min，4 ℃保存。反应完即得到反转录产物cDNA。③PCR：均由Oligo6软件设计，上海生工合成，序列见表1。应用一步法进行RT-PCR反应。20 µL PCR体系的组成：10×buffer 2 µL (含镁离子)，10 mmol/L dNTP 0.4 µL，上、下游引物各0.51 µL，Taq酶 0.2 µL，cDNA 1 µL，DEPC处理水补至20 µL。反应条件：94 ℃灭活反转录酶5 min。94 ℃变性 30 s、X ℃退火 30 s(注：退火温度X因基因不同而异，PPARγ：51℃；aP2：53 ℃；GAPDH：55 ℃)、72 ℃延伸 30 s，共循环35次。4 ℃保存产物。④电泳与成像分析：各组RT-PCR产物应用1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果采用紫外-凝胶成像分析系统记录，Quality One软件半定量分析电泳结果，以PPARγ/GAPDH和aP2mRNA/GAPDH比值表示基因的相对表达水平。

统计学分析：计量资料均以x±s表示，进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义，以上数据分析均由统计软件包SPSS 14.0完成。

讨论

3.1 骨髓间充质干细胞成脂分化与激素性股骨头缺血坏死的关系　临床组织学及病理学研究证明，激素性股骨头缺血性坏死的早期病理变化是股骨头骨髓内造血组织减少，脂肪组织增多，骨小梁内骨细胞数目减少。脂肪代谢紊乱是激素性股骨头缺血性坏死的主要病理改变。研究表明大剂量激素可抑制骨髓间充质干细胞成骨分化、促进其向脂肪细胞分化。激素对骨髓间充质干细胞成脂分化增加可能是引起激素性股骨头缺血性坏死脂肪代谢紊乱的根本原因^[5-6]，目前被很多学者用来解释激素性股骨头缺血性坏死的发病机制。

3.2 骨髓间充质干细胞的培养与鉴定 目前获得骨髓间充质干细胞的方法主要有：骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠分选法^[7]。因为骨髓间充质干细胞目前还没有公认的独特抗原表型，尚无法直接进行鉴定^[8]。一些学者通过细胞形态与生长特性进行鉴定^[9]。对骨髓间充质干细胞免疫学研究显示其细胞SH2，SH3，CD29，CD44，CD71，CD90，CD124，CD166阳性，CD34，CD45，HLA-DR和荆豆素则呈阴性表达^[10]。因此亦有学者用表面抗原CD45，CD90的阳性率鉴定[^4,11]。实验结合细胞形态和生长特性加表面抗原测定，证明所培养的细胞为骨髓间充质干细胞，且有较高的纯度。

3.3 骨髓间充质干细胞的成脂分化　骨髓间充质干细胞是骨髓中的一种多潜能干细胞，在一定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞﹑脂肪细胞、肌小管、肝细胞﹑心肌细胞﹑肾细胞﹑胰岛细胞等^[12-14]。自然条件下，骨髓间充质干细胞大多分化为成骨细胞，很少分化为脂肪细胞^[15]。但在一定的物理或化学条件可促使其分化为脂肪细胞。大量的研究表明，地塞米松是一种诱导骨髓间充质干细胞及髓外前脂肪细胞分化成脂肪细胞的良好诱导剂。

3.4 成脂标志物PPARγ和aP2 PPARγ属激素核受体超家族成员，主要在脂肪组织表达，是诱导脂肪细胞特异性基因表达和调节脂肪细胞分化的重要因子。aP2是PPARγ下游的涉及到脂类储存并调节脂类代谢的靶基因，脂肪组织PPARγ表达的增减可能会影响该目标基因的表达，继而影响能量代谢的平衡^[16]。aP2的启动子含有对C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein-α)和PPARγ这两个主要的成脂转录因子的结合部位，并且仅在脂肪细胞分化过程中表达^[17]。PPARγmRNA及aP2 mRNA是骨髓间充质干细胞成脂分化的较特异性的标记物，它们的表达可直接反映成脂分化情况，在动物的骨髓间充质干细胞培养中，加入激素后导致了脂肪细胞转录因子PPARγ及aP2基因的表达明显增加，激素成为骨髓间充质干细胞由成骨分化转变为成脂分化的诱导因素^[18-20]。

3.5 土鳖虫对激素诱导下骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用　实验结果显示：①大剂量激素干预骨髓间充质干细胞6 d后细胞内PPARγmRNA和aP2 mRNA的表达均有显著增加。证明激素可能在某个环节控制着骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。②中药各组应用大剂量激素和土鳖虫含药血清共同干预6 d后细胞内PPARγmRNA和aP2 mRNA的表达均有显著降低。表明土鳖虫含药血清可抑制骨髓间充质干细胞分化过程中PPARγ基因和aP2基因的表达，说明土鳖虫药物可以逆转因大量激素导致的骨髓间充质干细胞成脂分化增加。可见土鳖虫防治激素性股骨头缺血坏死的机制不仅是改善股骨头的微循环，同时还与其抑制激素诱导下的骨髓间充质干细胞成脂分化有关。

土鳖虫含药血清干预骨髓间充质干细胞的成脂分化

Eupolyphaga sinensis-containing serum influences the adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

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