2.1 成骨细胞的起源及骨形成机制 成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分化成软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种^[15-16]：①骨髓克隆形成单位。②骨祖细胞，可分化成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力。③前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化为成骨细胞，具有合成和增殖能力^[17-18]。成骨细胞由多能的间充质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来，具体就是诱导间质干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞^[19]。成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成。体外培养的成骨细胞在骨矿化期骨钙素高度增加，此后，骨钙素逐渐降低，与此同时，可观察到胶原酶增加，成骨细胞开始凋亡，并出现代偿性细胞增殖和胶原合成^[20-21]。

2.2 骨钙素的生物学特征 骨钙素是由成骨细胞生成并特异性分泌的含量最多的非胶原蛋白，比较稳定，不受骨吸收因素的影响，是骨细胞外基质的组成成分，可作为评估骨转换率及骨形成的特异性标志^[22-23]。大部分骨钙索沉积在骨基质，小部分分泌进入血循环，血液中骨钙素的浓度可以反映成骨细胞活性，是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊标志物，而且在更大程度上反映骨转换^[24]。通过血清骨钙素可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态，骨钙素值随年龄的变化以及骨更新率的变化而不同，骨更新率越快，骨钙素值越高，反之降低^[25]。在骨质疏松症中，绝经后骨质疏松症是高转换型的，所以骨钙素明显升高，老年性骨质疏松症是低转换型的，因而骨钙素升高不明显，故可根据骨钙素的变化情况鉴别骨质疏松症是高转换型还是低转换型^[26]。

2.3 传统中药对成骨细胞以及骨钙素合成影响的国内外相关研究分析

2.3.1 传统中药对成骨细胞影响的相关研究分析 运用成骨细胞体外培养和中药血清干预实验，研究和发现骨质疏松症治疗药物的方法能客观的阐明中药的药效及作用机理。国内已有文献报道复方中药和单味中药在体内能使患者的骨量增加，骨小梁面积及密度、成骨细胞体密度等增加^[27-28]。但体内实验存在许多复杂因素的干扰，不便于直接观察中药的药理作用^[29]。为此，在临床研究的基础上国内许多学者采用了体外培养的方法来观察中药血清是否有直接促进成骨细胞增殖和分化作用的影响。

单味中药对体外成骨细胞增殖和分化的影响：依据成骨细胞在骨形成中的作用,通过成骨细胞系找到能促进骨形成的物质是开发骨质疏松症治疗药物的重要方法^[30]。人们积极寻找疗效确切、不良反应小、作用机制明确的抗骨质疏松症药物。近10余年来，一些研究者尝试性探讨了单味中药和单味中药化学成分的作用，是中医药实验及临床研究的一种新方向。根据传统中医理论，淫羊藿、黄芪等分别为常用的补肾中药，在骨质疏松症的临床治疗中发挥着重要作用，因此，许多学者应用体外细胞培养技术，观察治疗该疾病的几味常用中药对体外培养成骨细胞增殖和分化的影响，以此筛选有确切作用的单味中药并初步探讨中药治疗骨质疏松症的作用机制^[31]。国内关于单味中药促进成骨细胞增殖和分化的动物实验研究报道，见表1。

复方中药对体外成骨细胞增殖和分化的影响：中药在促进成骨细胞增殖和分化方面具有越来越大的发展前景，但研究大多处于初期阶段，单味药多，复方药少，中药特色未体现，各类中药促进成骨细胞增殖和分化的机制有待进一步深入研究，特别对于从中药中筛选促进成骨细胞增殖和分化的中药复方药物的开发与研究还并不是很多^[37]。国内关于复方中药促进成骨细胞增殖和分化的动物实验研究报道，见表2。

不同稀释比血清对成骨细胞增殖和分化影响的相关研究报道：马涛等^[46]将19月龄SD大鼠24只，随机分为3组，分别为生理盐水组、淫羊藿低剂量组(1 g/mL)、淫羊藿高剂量组(2 g/mL)，按1 mL/kg的量，2次/d，连续灌胃1个月，处死前1 h，再灌胃1次，取血清(灭活，过滤)，最终稀释成1∶20、1∶40、1∶80加入新生大鼠颅骨成骨细胞体系，用四甲基偶氮唑盐法检测成骨细胞增殖和分化，发现不载药血清不同稀释比之间其促进成骨细胞增殖和分化的作用不同，其趋势是1∶20>1∶40>1∶80，载药血清也有相同趋势；但载药血清组与生理盐水组相比，在1∶20和1∶40稀释比血清各组未表现出差异，而在1∶80稀释比载药血清促进成骨细胞增殖和分化作用明显。载药血清对成骨细胞增殖的影响，见表3。

由表3可见，载药血清在不同稀释比的情况，其稀释比为1∶20和1∶40时作用趋势与生理盐水对照组未表现出差异，而稀释比为1∶80时，载药血清较生理盐水对照血清有明显的刺激细胞生长的作用。出现这种情况，此项研究人员认为可能与细胞接种密度及细胞自身生长有关，因为，对照组血清中也含有各种生长因子有促进其增殖和分化的作用。由于是原代培养，当细胞增殖到一定程度，就会抑制细胞的进一步增殖，因此表现差异不显著^[47]。在稀释比为 1∶80的情况下，血清中的生长因子被大大稀释了，载药血清的作用就能更明显的表现出来。

不同中药载药血清对成骨细胞增殖的影响：秦腊梅等^[48]为探讨几种中药对体外培养成骨细胞增殖的影响，观察单味中药淫羊藿、女贞子、黄芪在 5，10，100，500，1 000 mg/L 5个不同质量浓度对成骨细胞增殖的影响，以及各组与空白组间进行对照，成骨细胞增殖检测结果以吸光度(A)值表示，结果见表4。

由检测结果可见，各组与空白组间均有显著差异，但是3种药物不同浓度之间无显著性差异，淫羊藿、女贞子高浓度组较低浓度组促进成骨细胞增殖的作用有上升趋势。淫羊藿有明显的促进体外培养成骨细胞增殖的作用且高浓度作用有明显增强趋势。女贞子在促进成骨细胞增殖方面，女贞子各浓度组较淫羊藿组各浓度显得作用更强，同时其高浓度较低浓度也有作用上升趋势，提示淫羊藿和女贞子在促进成骨细胞增殖方面有可能存在一定的共性。黄芪各浓度与浓度变化无明显关系，高浓度与低浓度相比，作用无增高趋势，提示其作用机制可能不同于淫羊藿和女贞子，值得进一步深入研究。

体外成骨细胞培养和中药血清干预实验研究中应该注意的问题：①中药血清药理学存在的问题。为了保证中药血清药理学实验结果与在体实验的一致性，血清供体动物必须进行造模。②体外成骨细胞培养中细胞来源是需要不断完善的关键。

对于载药血清的保存问题，周明眉等^[49]探讨了载药血清低温保存和血清灭活的影响。研究结果显示载药血清较长时间低温保存后药效均显著较低，血清灭活后使其药效作用有所提高，但无明显差异。因此，提示载药血清进行低温冰冻保存仍影响其药效，进行血清药理学实验以使用新鲜血清和保存时间较短的载药血清为宜。崔晓兰等^[50]研究证实，进行体外成骨细胞培养和中药血清干预实验时宜使用新鲜或保存时间较短的载药血清。而对于体外实验中如何确立载药血清的添加量，使之既要避免高浓度血清对成骨细胞的毒副作用，又要使载药血清的浓度接近于血药浓度，以便较客观的反映中药药效是十分有必要的。

体外成骨细胞培养的问题^[51-52]：①细胞的来源。不同种属或同一种属不同年龄段，以及取材部位的不同均可导致体外成骨细胞培养和中药血清干预实验结果不一致。②实验方法。培养方法的不同，例如酶消化法可获得大量细胞，便于培养细胞浓度的调整，但操作方法较复杂，酶处理后对细胞膜表面受体和抗原成分有损坏，影响了培养细胞的贴壁和成活率，故需要掌握合适的消化时间。组织块培养法可靠简便，且所得细胞较纯，但细胞产出率低，一定程度上限制了它的应用。

2.3.2 中药对成骨细胞骨钙素分泌的影响

中药对成骨细胞骨钙素分泌影响的相关实验研究分析：既往研究曾用中药作用于骨质疏松症的动物模型，骨生物力学检测证实可增加骨的强度，骨密度检测和骨形态计量学证明可增加骨密度，提高骨骼抵抗外力的能力^[53]。由于成骨细胞分泌的骨钙素主要生理功能是保持骨的正常矿化和抑制由于异常的羟磷灰石结晶沉积所致的生长软骨矿化加速。因此，近年来以防止骨质疏松症为目的探讨各种中药对成骨细胞作用、骨钙素合成的影响研究极为活跃[^54]。中药对成骨细胞分泌骨钙素的影响，见表5。

以上相关实验研究结果分析成骨细胞+载药血清组与成骨细胞+正常血清组成骨细胞分泌骨钙素的量，成骨细胞+载药血清组显著增多，有显著性意义(P < 0.01)。结果说明成骨细胞在中药的作用下，合成并分泌大量骨钙素，参与成骨细胞形成新骨的过程，被固定在新生骨质中，使成骨细胞的合成功能增强。因此，中药对成骨细胞的骨形成有促进作用，这可能是中药防治骨质疏松症的机制之一^[58]。

不同浓度载药血清对成骨细胞骨钙素分泌影响的相关研究结果分析：骨钙素是骨转化的特异性标志物，由成骨细胞合成和分泌，其大部分沉积在骨基质中，约20%进入血液循环，血清中骨钙素水平变化，直接反映成骨细胞活性。血清中骨钙素只来源于骨骼，当骨形成或骨吸收能力增强时，血清骨钙素普遍增加，而且骨钙素容易检测，因此，骨钙素可用于骨质疏松及其他骨病的诊断及药效的监测。李楠等^[59]取新生SD大鼠头盖骨，使用福建南靖科技局提供5年生巴戟天，探讨中药对成骨细胞骨钙素合成的影响，观察细胞内骨钙素含量测定显示，载药血清中在巴戟天低浓度范畴内随药物浓度的增高而表达逐渐增强，至100 mg/L时达到最大效应，继续提高浓度则骨钙素含量表现呈现下降趋势。因此，认为载药血清不同药物浓度组与正常血清组相比，差异有显著性意义，其中药物浓度在100 mg/L的载药血清作用更明显，提示载药血清促进骨钙素分泌，加速骨形成。不同浓度载药血清对成骨细胞骨钙素分泌的影响，见图1。

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骨质疏松症是一种多病因所致的全身性骨病，是全身功能退行性变的一种表现，其特点为单位体积内的骨量减少，骨强度降低，骨组织显微结构异常，脆性增加导致骨折易感性增高为特征的系统性骨骼病变^[1-2]。在骨质疏松症发生过程中，主要表现为骨形成功能相对不足，而成骨细胞是骨形成的主要细胞，该细胞可合成、分泌骨钙素，促进骨质矿化，对骨组织的生长发育、损伤修复、骨代谢平衡与骨量维持起着重要作用^[3-4]。现在医学认为，原发性骨质疏松症是由于成骨细胞的骨形成能力相对弱于破骨细胞的骨吸收能力，使骨吸收大于骨形成，从而造成了骨量的丢失，其功能减退使新骨量减少，对骨吸收陷窝的修补能力减弱，造成骨小梁变细、薄弱、穿孔，皮质骨出现多孔性改变，引起骨质疏松症的发生^[5]。因此，促进成骨细胞的骨形成就成为防治骨质疏松症的关键。

目前尚缺乏有效的措施使骨质疏松症患者的骨量恢复正常，药物应用也十分有限，且存在许多争议。以往应用雌激素、钙剂、钙盐、双膦酸盐、维生素D、氟化物、降钙素等治疗结果发现，存在如内分泌紊乱、癌变、疗效不确定、受生理因素限制、长期副等均受到质疑^[6-7]。近年来经过国内众多学者在中药防治骨质疏松的研究中发现某些中药能够使患者的骨量增加，骨小梁面积及密度、成骨细胞分泌骨钙素增加^[8]。因此，认为中药具有不良反应少，远期疗效较佳的等优点，具有多途径、多靶向的整体调节作用，可以针对活化成骨细胞和抑制破骨细胞活性从而达到治疗骨质疏松症的目的^[9-10]。

骨钙素是成骨细胞分化时所分泌的一种非胶原蛋白质，是成骨细胞的特异性产物，为人体骨骼所释放的一种激素，由49个氨基酸构成，具有维持骨的正常矿化速率的作用^[11]。既往的研究认为骨钙素不但能反映成骨细胞活性和骨的转换水平，并能反映骨质疏松患者对中药治疗情况的反应^[12-13]。因此，探讨中药对成骨细胞骨钙素分泌合成的影响，阐明中药治疗骨质疏松症的作用机制，是目前中药治疗骨质疏松症研究的主要内容之一。

资料来源：传统中药干预对成骨细胞及骨钙素合成影响研究的相关文献^[14]，研究文献范围1990至2011年，检索词为“中药；复方中药；单味中药；提取液；成骨细胞；骨钙素；骨质疏松；碱性磷酸酶；载药血清；增殖；矿化；骨密度”，选取文献28篇^[32-59]。
纳入标准：①成骨细胞体外培养研究。②碱性磷酸酶比活性测定相关研究。③成骨细胞增殖测定的相关研究。④细胞内骨钙素含量测定的相关研究。
排除标准：①综述及循证医学类型的文章。②重复性研究类型文献。
分析指标：①单味中药对体外成骨细胞增殖和分化的影响。②中药复方药物对体外成骨细胞增殖和分化的影响。③不同稀释比血清对成骨细胞增殖和分化的影响。④不同浓度载药血清对成骨细胞骨钙素分泌的影响。⑤传统中药对成骨细胞骨钙素分泌的影响相关实验研究。

3.1 传统中药对成骨细胞作用、骨钙素合成影响研究所面临的问题 目前中药对成骨细胞作用、骨钙素合成的影响的研究是防治骨质疏松症研究的热点之一，并且已经取得了一定成果，为中医药防治骨质疏松症提供了细胞分子学依据，但仍面临不少问题需要解决^[60]：①大多数科研处于初步探讨阶段，尚无系统、深入的研究，并且缺乏统一而有特色的量化指标，使各项临床研究成果可比性差，重复性差^[61]。②单味药的研究多集中于补肾药，对健脾活血、化痰通络中药研究比较少，这方面尚需要进一步加强^[62]。③中药载药血清方法虽然采用类同体内的过程，比较接近于服药后的实际情况，但是在血清药理学应用过程中依然存在着诸如给药时间、采血时相、血清添加量等争论，有待进一步的研究。④成骨细胞原代培养存在成骨细胞群体的不均一性问题，并且这种异质性可导致细胞群体对一些调节因子的不同反应性。而且如何排出成纤维细胞的污染尚未找到有效方法，而这些势必影响对实验结果的分析，采用生物学性状均一的细胞群有望可以解决上述问题^[63-64]。⑤中药防治骨质疏松症的骨骼系统可以在骨吸收和骨形成两方面体现调整作用，对全身则是在整体调节背景上的多靶点、多环节发挥作用。⑥单一观察中药对体外培养成骨细胞的直接作用是不够的，而且其作用机制尚待深入探讨。

3.2 小结 在机体的生命活动中，成骨细胞一旦生成不足或功能降低，则不能及时补充由于破骨细胞活动所导致的骨量丢失，直接导致骨形成减少，从而引起骨质疏松症的发生。目前，通过对成骨细胞体外培养的方法进行筛选，找出对成骨细胞增殖分化以及骨钙素合成有促进作用的药物，然后提取有效成分联合用药或根据中药配伍进行配方找到有效治疗骨质疏松症的方法已经取得了一定成果。但是，不同类别中药治疗骨质疏松症的具体作用机制到底有何不同，以及具体某单味中药、中药复方药物与常用西药作用机制之间有何区别，均是值得进一步深入探讨的问题。

基金资助：河北省中医药管理局资助项目(2012068)。
作者贡献：李瑞玉进行实验设计，魏双平、李蒙、进行实验实施及评估，资料收集为吴丽萍、孙艳孚、颜军礼，李瑞玉成文，李瑞玉对实验进行审校并对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验获得所在单位的伦理委员会批注，符合伦理学标准。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

1  骨钙素是反映骨更新的一项特异性生化指标，检测骨钙素水平，既可反映成骨细胞的活性，又可观察到干预因素治疗骨质疏松症的情况。

2  因体内实验存在干扰因素较多，难以确切的从细胞生物学方面了解传统中药对成骨细胞及对骨钙素分泌的影响。因此，收集了既往研究曾用传统中药作用于骨质疏松症的动物模型，抽取载药血清进行体外实验检测骨钙素水平的相关文献，分析传统中药对成骨细胞及骨钙素合成的影响，阐明传统中药治疗骨质疏松症的作用机制。

3  通过血清药理学的方法，从分子生物学水平，讨论传统中药治疗骨质疏松症的作用途径，提供临床应用借鉴。

成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种：
(1)骨髓克隆形成单位；(2)骨祖细胞，可分化成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力；(3)前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化成成骨细胞，具有合成和增殖能力。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来，调控因素主要有BMP-2，BMP-2能诱导基质细胞向成骨细胞分化，具体就是诱导间质干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞。

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