墨西哥钝口螈脊髓全切后胶质细胞的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：墨西哥钝口螈脊髓切断可以再生，再生过程伴随胶质细胞数目及分布的改变，研究墨西哥钝口螈脊髓全切后胶质细胞的变化，对进一步探讨其脊髓切断再生机制有重要意义。
目的：观察墨西哥钝口螈脊髓全切后小胶质细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞的变化。
方法：选用成年墨西哥钝口螈，分为脊髓全切组和对照组，利用免疫组织化学法观察脊髓全切后1，3和10 d的损伤脊髓及周围区cd11b标记的小胶质细胞、胶质细胞原纤维酸性蛋白标记的星形胶质细胞及髓鞘碱性蛋白标记的少突胶质细胞的变化。
结果与结论：脊髓全切后短期内cd11b染色阴性；脊髓损伤后胶质细胞原纤维酸性蛋白及髓鞘碱性蛋白阳性细胞染色强度，1 d组阳性细胞染色强度与对照组比较无显著差异，3及10 d组阳性细胞染色强度较对照组低。墨西哥钝口螈小胶质细胞染色阴性，可能存在不同于哺乳动物的标记蛋白；脊髓全切后3及10 d在损伤脊髓及周围区的胶质细胞原纤维酸性蛋白及髓鞘碱性蛋白阳性细胞染色强度较对照组低，提示钝口螈脊髓急性损伤早期未见星形胶质细胞及少突胶质细胞增生，无胶质瘢痕形成。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 脊髓全切, 小胶质细胞, 星形胶质细胞, 少突胶质细胞细胞, 墨西哥钝口螈, cd11b, 胶质细胞原纤维酸性蛋白, 髓鞘碱性蛋白, 国家自然科学基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The spinal cord of Ambystoma mexicanum can regenerate after transection, and the number and distribution of gliacytes alter during regeneration. So it is important to observe the changes of gliacytes following spinal cord transection in Ambystoma mexicanum in order to further discuss the mechanism of spinal cord regeneration.
OBJECTIVE: To observe the changes of microglias, astrocytes and oligodendrocytes following spinal cord transaction in Ambystoma mexicanum.
METHODS: Adult Ambystoma mexicanum was selected and divided into spinal cord transection group and control group. Immunohistochemistry assay was performed to observe the changes in cd11b-labeled microglias, glial fibrillary acidic protein labeled astrocytes and myelin basic protein labeled oligodendrocytes in the injured region and peripheral region at 1, 3 and 10 days after spinal cord transection.
RESULTS AND CONCLUSION: After transaction, the staining results of cd11b were negative. The staining intensity results of glial fibrillary acidic protein and myelin basic protein positive cells at 3 and 10 day were lower to the control group, but showed no significant difference from the control group at 1 day after transection. Microglias were negative in Ambystoma mexicanum, indicating the marker proteins of microglia in salamander may be different from those in the mammals. The staining intensity results of glial fibrillary acidic protein and myelin basic protein positive cells at 3 and 10 days were lower to the control group, which suggested that astrocytes and oligodendrocytes hyperplasia were not seen and no glial scar formed in early stage of spinal cord injury in Ambystoma mexicanum.

Key words: tissue construction, cytology experiment in tissue construction, spinal cord transecion, microglias, astrocytes, oligodendrocytes, Ambystoma mexicanum, cd11b, glial fibrillary acidic protein, myelin basic protein, the National Natural Science Foundation of China, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

李敏，刘佳，钟玉华，彭福华. 墨西哥钝口螈脊髓全切后胶质细胞的变化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(11): 1993-2000.

Li Min, Liu Jia, Zhong Yu-hua, Peng Fu-hua. Changes of gliacytes after spinal cord transection in Ambystoma mexicanum[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(11): 1993-2000.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 实验动物分为对照组和手术组，各48条。在实验过程中由于感染等因素有脱失，每组最多不超过3条。在0，1，3及10 d每个时间点每组保证取6条。

2.2 脊髓全切后损伤脊髓周围小胶质细胞和巨噬细胞数量的变化 见图2。

cd11b为小胶质细胞单克隆抗体，可作为小胶质细胞标记^[11]。免疫组化结果显示，对照组脊髓不表达cd11b，而脊髓全切后1，3，10 d时，损伤脊髓附近也未见cd11b的表达，说明损伤脊髓周围没有小胶质细胞和巨噬细胞。

2.3 脊髓全切后损伤脊髓周围星形胶质细胞数量的变化 见图3。

胶质细胞原纤维酸性蛋白被广泛证实仅识别星形胶质细胞，可作为星形胶质细胞的标记^[12-19]。免疫组化结果显示，对照组脊髓大量表达胶质细胞原纤维酸性蛋白，脊髓全切后1 d时，损伤脊髓附近胶质细胞原纤维酸性蛋白未发生明显变化(P > 0.05)，而3，10 d后，损伤脊髓附近胶质细胞原纤维酸性蛋白表达明显减少(P < 0.05)，提示脊髓全切将减少损伤脊髓周围星形胶质细胞数量，见表1。

2.4 脊髓全切后损伤脊髓轴突髓鞘细胞的变化 见表2，图4。

髓鞘碱性蛋白是组成中枢神经系统髓鞘的主要蛋白质单克隆抗体，可特异地显示轴突髓鞘，可作为少突胶质细胞标记。由图4及表2可见，对照组脊髓大量表达髓鞘碱性蛋白，脊髓全切后1 d时，损伤脊髓轴突髓鞘碱性蛋白未发生明显变化(P > 0.05)，而3，10 d后，损伤脊髓轴突髓鞘碱性蛋白表达明显减少(P < 0.05)，提示脊髓全切将减少损伤脊髓轴突髓鞘细胞数量。

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引言

材料方法

设计：模型动物形态学观察。
时间及地点：于2012年3至6月在中山大学附属第三医院神经科实验室完成。
材料：
墨西哥钝口螈脊髓全切后细胞观察的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments for cell observation after spinal cord transection in Ambystoma mexicanum:

动物：96条三四个月龄墨西哥钝口螈，体质量24- 27 g，体长18-20 cm，雌雄不限，购自广州花鸟鱼虫市场。饲养于27 cm×38 cm×45 cm玻璃缸，除氯淡水，温度20-24 ℃，红虫3次/1周喂养。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
方法：
墨西哥钝口螈脊髓全切模型的建立：将钝口螈用鱼安定(0.1%间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)麻醉10 min，术前置冰水中30 min。所有手术操作过程在无菌条件下完成。将钝口螈以俯卧式置于弯盘中，湿润洞巾覆盖，用10%聚维酮碘消毒皮肤，暴露手术部位，先在朝头方向距后肢1 cm的地方切掉脊髓上所覆的皮肤、肌肉，然后行椎板切除，切掉的椎板数目要足以可以使用显微解剖剪刀将脊髓提起并切断。切开腔用无菌生理盐水冲洗至能看清切断的脊髓的两断端，用无菌棉球擦拭椎管清理椎管内残留的组织。当切断手术完成，脊髓两断端回缩，产生1.0-2.0 mm的空隙，见图1。

一旦证实切断，伤口用4-0缝线缝合。
术后将钝口螈放在冰上15 min，苏醒后将钝口螈放在水箱里，水箱水要能形成一浅滩。在恢复期每一两天清理水箱并换不含氯的自来水^[9]。对照组仅行椎板切除，脊髓不切断。
免疫组织化学染色检测损伤脊髓附近cd11b，胶质细胞原纤维酸性蛋白和髓鞘碱性蛋白的表达：分别在脊髓全切后1，3，10 d，鱼安定麻醉，置于冰上至少15 min。1.5 mL 85%PBS及3 mL高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液(含75 mmol/L赖氨酸，10 mmol/L高碘酸钠，0.5%多聚甲醛的85% PBS，pH 7.4；0.1 mol/L赖氨酸及 20 g/L多聚甲醛-20 ℃保存，使用时混合并在2 h内使用)连续灌注。所有操作在室温下进行，清洗20-30 min，重复3次，除非有特殊要求。
获取损伤上下约4 mm脊髓包括脊髓腔。于高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛中后固定2 h，用新配PBS清洗20-30 min，重复3次，4 ℃过夜。在Morse's溶液中(22.5%甲酸，10%柠檬酸钠) 置24 h脱钙，用新配PBS清洗20-30 min，重复3次。将组织取出，浸泡体积分数为50%，75%，95%，100%乙醇脱水，每梯度30 min，浸泡二甲苯替代物透明，每次5 min，3次。浸蜡包埋，常规石蜡切片。按SP试剂盒说明行免疫组织化学染色，滴加一抗(浓度1∶100，4 ℃过夜)、二抗(浓度1∶80，37 ℃，1 h)，DAB显色，苏木精复染。
每张切片随机取5个400倍视野，每个视野均进行阳性细胞百分比计分与着色强度记分。根据着色强度，按阳性细胞着色(抗原含量)无、弱、中、强依次记为0，1，2，3分。
阳性细胞百分比记分按视野内阳性细胞所占总细胞数的比例记分≤25%，26%-50%，51%-75%，>75%分别计分为1，2，3，4分。
结果将上述2种记分结果相加，0分为阴性(-)；2或3分为弱阳性(+)；4或5分为中等阳性(++)；6或7分为强阳性(+++)^[10]。
cd11b阳性细胞为小胶质细胞；胶质细胞原纤维酸性蛋白阳性细胞为星形胶质细胞；髓鞘碱性蛋白阳性细胞为少突胶质细胞。
主要观察指标：墨西哥钝口螈脊髓正常及损伤后不同时间损伤处及周围区小胶质细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞的变化情况。
统计学分析：结果采用有序资料非参数秩和检验比较。统计数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

钝口螈具有很强的再生能力，脊髓切断后可再生^[4]。成年哺乳动物脊髓损伤后再生困难，主要由于星形胶质细胞、小胶质细胞及少突胶质细过度增生和胶质瘢痕形成，导致机械性障碍，影响轴突的再生、延长和融合^[20]，并且胶质瘢痕可以形成微血管套，压迫微血管，影响局部的血液供应^[21]。星形胶质细胞在瘢痕组织的形成中起主要作用^[3]，利用基因敲除技术将小鼠星形胶质细胞中胶质细胞原纤维酸性蛋白和中间丝弹性蛋白基因敲除掉，结果抑制了胶质细胞原纤维酸性蛋白和中间丝弹性蛋白在小鼠脊髓损伤处表达，胶质瘢痕明显减少^[22]。少突胶质细胞中枢神经系统髓鞘的形成细胞，损伤后有一过性增生，参与胶质瘢痕的形成，分泌抑制性蛋白^[23]。巨噬细胞和活化的小胶质细胞在中枢神经系统损伤和修复中发挥双重作用^[24-28]。一方面，能够清除损伤局部坏死的细胞及组织残骸，刺激细胞分泌再生修复所需的营养物质，如神经生长因子、白细胞介质1/6、胰岛素样生长因子1^[29-46]，调控轴突再生所需的基质蛋白，对损伤细胞起保护和修复作用；另一方面，损伤后早期灰质神经元和轴突的变性坏死与小胶质细胞活化后，增加血脊髓屏障的通透性，释放炎性细胞因子、神经毒素、化学激动剂等物质有关。

实验将脊髓全切后，行免疫组织化学染色示，标记小胶质细胞的蛋白cd11b阴性，可能由于钝口螈小胶质细胞结构及蛋白表达不同于哺乳动物，国外曾有人报道钝口螈脊髓切断后主要存在3种细胞，星形胶质细胞、少突胶质细胞及室管膜细胞^[47]。标记星型胶质细胞的胶质细胞原纤维酸性蛋白蛋白及髓鞘碱性蛋白标记的少突胶质细胞的阳性强度在3及10 d与对照组比较降低，提示钝口螈脊髓全切后短期内无星形胶质细胞及少突胶质细胞增生，没有形成胶质瘢痕的基础，提示钝口螈脊髓全切后无阻碍轴突延伸的瘢痕形成，这可能是钝口螈脊髓比哺乳动物更容易再生的一个原因。这与国外有报道称钝口螈切断后未见星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成相一致^[48]。

哺乳动物脊髓损伤后，胶质细胞同时会分泌一些抑制性蛋白，抑制再生过程，主要有NogoA、髓磷脂相关脂蛋白及硫化软骨素蛋白多糖等^[49-52]。Zuhor等^[48]报道虽然钝口螈脊髓切断再生过程中，同样有细胞外基质抑制性蛋白硫化软骨素蛋白多糖的存在，但其未在损伤脊髓灰质或白质发现并形成屏障阻碍轴突延伸，提示钝口螈脊髓星形胶质细胞不表达硫酸软骨素，及硫酸软骨素未参与致密瘢痕的形成。这些均提示钝口螈胶质细胞结构及分泌蛋白可能不同于哺乳动物，损伤后胶质细胞的改变亦不同于哺乳动物，可能正是由于这些不同，决定了钝口螈较强的再生能力。

综上，文章利用免疫组织化学方法，初步探讨了钝口螈脊髓全切后短期内胶质细胞的变化，与哺乳动物不同，小胶质细胞可能表达不同的蛋白，未见星形胶质细胞及少突胶质细胞增生，无胶质瘢痕形成，提示钝口螈脊髓全切后再生可能由于存在有利于神经元再生的微环境。可以进一步研究钝口螈胶质细胞超微结构及蛋白表达的差异，揭示钝口螈脊髓再生的分子机制，为研究哺乳动物脊髓再生提供新思路。

基金资助：本文获得国家自然科学基金项目(编号81271327) “BTLA修饰的未成熟树突状细胞对EAE免疫耐受作用及机制的研究”，及广东省科技计划项目(编号2011B031800015) “未成熟DC诱导抗原特异性调节性T细胞及其对EAE的影响”的支持。
作者贡献：李敏、钟玉华负责脊髓切断、再生过程观察及免疫组化，李敏和刘佳负责本研究的设计、数据统计和论文的撰写与修改。彭福华负责对文章进行指导并对本文负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置应符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。