干扰素α-2a与肝纤维化大鼠肝星状细胞的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (11): 1987-1992.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.013

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干扰素α-2a与肝纤维化大鼠肝星状细胞的凋亡

刘翠芸，张伟，刘佩佩，叶长根，易珍，孙水林

南昌大学第二附属医院感染科，江西省南昌市 330006

收稿日期:2012-06-13 修回日期:2012-07-12 出版日期:2013-03-12 发布日期:2013-03-12
通讯作者: 孙水林，教授，主任医师，南昌大学第二附属医院感染科，江西省南昌市 330006 sunshuilin2280@126.com
作者简介:刘翠芸★，女，1987年生，江西省南昌市人，汉族，南昌大学医学院在读硕士，主要从事肝病等传染病研究

Interferon alpha-2a and apoptosis of hepatic stellate cells in rats with hepatic fibrosis

Liu Cui-yun, Zhang Wei, Liu Pei-pei, Ye Chang-gen, Yi Zhen, Sun Shui-lin

Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Received:2012-06-13 Revised:2012-07-12 Online:2013-03-12 Published:2013-03-12
Contact: Sun Shui-lin, Professor, Chief physician, Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China sunshuilin2280@126.com
About author:Liu Cui-yun★, Studying for master’s degree, Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：干扰素α-2a改善肝纤维化的机制直到目前仍尚未阐明。
目的：进一步验证干扰素α-2a对 CCl₄诱导大鼠肝纤维化模型中肝星状细胞凋亡的影响。
方法：建立CCl₄诱导肝纤维化模型，健康SD雌性大鼠50只，采用随机对照原则将SD大鼠分成5组，即生理盐水对照组、纤维化模型组、6×10⁴U/kg 干扰素α-2a干预组、12×10⁴ U/kg干扰素α-2a干预组及6×10⁴U/kg干扰素α-2a对照组。造模8周时取肝组织标本，分别进行肝纤维化指标检测；RT-PCR分析肝组织bcl-2、bax的表达；免疫组织化学染色用a平滑肌肌动蛋白对活化的肝星状细胞进行标记。
结果与结论：肝组织病理形态显示CCl₄诱导肝纤维化成功建立，表现为纤维化模型组汇管区周围纤维化明显，有芒状纤维和纤维间隔形成，各干扰素α-2a干预组肝纤维化有不同程度缓解。纤维化模型组有大量a平滑肌肌动蛋白阳性表达，6×10⁴U/kg干扰素α-2a干预组a平滑肌肌动蛋白阳性表达较纤维化模型组减少，12×10⁴U/kg干扰素α-2a干预组更少，6×10⁴ U/kg干扰素α-2a对照组未见a平滑肌肌动蛋白阳性表达。结果提示干扰素α-2a能下调CCl₄诱导肝纤维化bcl-2的表达，及上调bax的表达。提示干扰素α-2a阻断CCl₄诱导肝纤维化机制存在通过调节bcl-2、bax的表达，诱导肝星状细胞凋亡途径，该调节作用可能与干扰素α-2a剂量相关。

关键词: 组织构建, 组织构建与生物活性因子, 肝纤维化, 肝, 干扰素α-2a, Bcl-2, Bax, 肝星状细胞, 细胞凋亡, 省级基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Up to now, the mechanism underlying interferon alpha 2a to improve hepatic fibrosis has not been clarified.
OBJECTIVE: To investigate the effect of interferon alpha 2a on hepatic stellate cells apoptosis in the CCl₄-induced hepatic fibrosis rat model.
METHODS: We established the CCl₄-induced hepatic fibrosis models in rats. Fifty healthy female Sprague-Dawley rats were equally and randomly divided into five groups, certainly each group included 10. Five groups were saline control group, hepatic fibrosis model group (model group), 6×10⁴ U/kg interferon alpha 2a intervention group, 12×10⁴U/kg interferon alpha 2a intervention group and 6×10⁴ U/kg interferon alpha 2a control group. At 8 weeks after modeling, blood and liver tissues were collected to detect the indicators of hepatic fibrosis; the expression of bcl-2 and bax in the liver tissue was analyzed with semi-quantitative reverse transcription-PCR; and immunohistochemical staining was used to mark a-smooth muscle actin in activated hepatic stellate cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Pathological morphology of the liver tissue demonstrated that the hepatic fibrosis model was successfully established. The model group had fibrosis significantly around the portal area; in addition, Mans-like fibers and fibrous septa formed. Different interferon alpha 2a intervention groups had fibrosis relief to different extent. a-smooth muscle actin had a great amount of positive expression in the model group, while the positive expression of a-smooth muscle actin was lower in the interferon alpha 2a intervention groups, especially in the 12×10⁴U/kg interferon alpha 2a intervention group as compared the model group. In addition, there was no expression of a-smooth muscle actin in the 6×10⁴U/kg interferon alpha 2a control group. Interferon alpha 2a could down-regulate bcl-2 expression and up-regulate bax expression in CCl₄-induced hepatic fibrosis models. These findings indicate that the mechanism of interferon alpha 2a blocking CCl₄-induced hepatic fibrosis is mainly present by regulating the expression of bcl-2 and bax to induce apoptosis of hepatic stellate cells, and this regulatory role is possibly related to interferon alpha 2a dose.

Key words: tissue construction, tissue construction and bioactive factor, hepatic fibrosis, liver, interferon alpha-2a, Bcl-2, Bax, hepatic stellate cells, cell apoptosis, provincial grants-supported paper, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

刘翠芸，张伟，刘佩佩，叶长根，易珍，孙水林. 干扰素α-2a与肝纤维化大鼠肝星状细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(11): 1987-1992.

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图/表（结果） 5

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2010年1月至2011年12月在南昌大学医学院重肝实验室完成。
材料：
实验动物：6周龄清洁级健康雌性SD大鼠50只，体质量(200±20) g，由南昌大学医学院动物科学部提供，许可证号：SYXX(赣)2009-0001。
试剂及仪器：
Reagents and instrument:

方法：
建立大鼠肝纤维化模型：SD大鼠于清洁条件下喂养。实验前适应性喂养5 d。随机分为5组：①生理盐水对照组(n=10)：予2 mL/kg生理盐水肌肉注射，隔日1次，共8周。②6×10⁴U/kg干扰素α-2a对照组(n=10)：除予 2 mL/kg生理盐水肌肉注射，隔日1次，第7周再给予6×10⁴U/kg干扰素α-2a，肌肉注射，隔日1次，至第8周。③其余30只首先建立CCl₄诱导的SD大鼠肝纤维化模型，每只大鼠给予50%CCl₄(花生油稀释)2 mL/kg腹腔注射，共6周。第7周随机分为：纤维化模型组(n=10)：继续每只大鼠给予50%CCl₄腹腔注射，2次/周，至8周。6×10⁴U/kg干扰素α-2a干预组(n=10)：继续每只大鼠给予50%CCl₄皮下注射，2次/周，再给予6×10⁴ U/kg干扰素α-2a，肌肉注射，隔日1次，至第8周。12×10⁴U/kg干扰素α-2a干预组(n=10)：继续每只大鼠给予50%CCL₄腹腔注射，2次/周，再给予12×10⁴ U/kg干扰素α-2a，肌肉注射，隔日1次，至第8周。
标本收集：造模8周时，处死SD大鼠前，乙醚吸入麻醉大鼠，采眼球内眦静脉血5 mL，静置离心后取上层血清送肝纤维化指标检测。固定大鼠，断颈、开腹，在无菌情况下，迅速切除一小叶肝脏置预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中，剪成小块(约20 mg)置RNA Store样本保存液中，并放置4 ℃条件下过夜渗透，然后将肝组织从RNA Store保存液中取出后放入-86 ℃冰箱保存，以备半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测；其余肝组织用甲醛固定后送病理科进行病理形态学Masson染色及a平滑肌肌动蛋白标记肝星状细胞的免疫组织化学检测。
分子学检测：将各组大鼠肝组织进行RT-PCR检测，分析bcl-2及bax基因的表达情况。
半定量RT-PCR分析。引物设计借助Pubmed Nucleotide 获取目的基因全序列，由引物设计软件分析设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
bcl-2、bax及β-actin引物序列：
Primer sequences:

肝脏病理形态学检测：用石蜡切片进行Masson染色，观察肝脏纤维化程度，并在光学显微镜下观察，拍照。
肝星状细胞活化标记物a平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色：采用4 μm石蜡切片常规脱蜡至水，使用H₂O₂阻断内源性过氧化物酶的活性，修复后以正常山羊血清封闭，与鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，37 ℃孵育一两个小时后，滴加生物素标记二抗，后滴加辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色，复染后封固观察并拍照。细胞显示棕褐色或棕黄色为阳性细胞。
主要观察指标：①肝纤维化指标透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原的改变。②肝脏组织病理形态观察肝脏纤维化程度。③bcl-2及bax基因的mRNA表达情况。④肝星状细胞活化标记物a平滑肌肌动蛋白阳性表达率。
统计学分析：实验数据用SPSS 17.0统计软件处理，对各个实验组数据进行方差分析及多重比较(最小显著差法，LSD)，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

目前认为肝细胞外基质过度合成及沉积是肝纤维化形成的主要机制^[12]。肝纤维化经过急性肝损伤，实质细胞再生和替代坏死或凋亡细胞3个阶段，其中肝星状细胞的活化是肝纤维化形成的中心环节，诱导活化的肝星状细胞凋亡在抗肝纤维化研究中也成为了热点。干扰素α-2a阻断CCl₄诱导性肝纤维化的作用机制是否也能通过诱导活化的肝星状细胞凋亡实现，实验进行了一些探讨。

Che等^[13]体外实验发现干扰素α对肝星状细胞凋亡有促进作用，且主要是促进肝星状细胞凋亡的起始阶段，并具有浓度依赖性，从而发挥抗肝纤维化的作用。目前关于干扰素α体内能否促进或诱导肝星状细胞的凋亡鲜见报道；a-平滑肌肌动蛋白是肝星状细胞激活的标志和敏感指标^[14-15]，实验经a平滑肌肌动蛋白标记肝星状细胞的免疫组织化学切片显示肝纤维化模型组有大量a平滑肌肌动蛋白的阳性表达，提示纤维化模型组有大量活化的肝星状细胞，6×10⁴U/kg干扰素α-2a干预组a平滑肌肌动蛋白的阳性表达较纤维化模型组明显减少，12×10⁴ U/kg干扰素α-2a干预组更少，对照组未见a平滑肌肌动蛋白的阳性表达(见图3)，由此可见干扰素α-2a能抑制或减少活化的肝星状细胞的增殖，且作用效果可能与干扰素α-2a的剂量相关。

分子水平研究还发现：各实验组之间bcl-2基因家族的凋亡抑制基因bcl-2及凋亡促进基因bax的表达差异有显著性意义(P < 0.01)，纤维化模型组中肝组织中bcl-2 基因表达最高，生理盐水对照组、6×10⁴U/kg干扰素α-2a对照组bcl-2基因表达较弱；6×10⁴U/kg及12×10⁴U/kg干扰素α-2a干预组bcl-2基因的表达量介于纤维化模型组及对照组之间，12×10⁴ U/kg干扰素α-2a干预组bcl-2的表达量低于6×10⁴ U/kg 干扰素α-2a干预组，由此可见干扰素α-2a能下调CCl₄诱导肝纤维化肝组织中bcl-2 基因表达，作用效果可能还与干扰素α-2a的剂量相关。在肝纤维化时, 肝星状细胞凋亡障碍与bcl-2表达上调导致细胞对CD95等凋亡信号敏感性降低有关^[16-17]，Bcl-2在人肝纤维化过程中呈过表达,导致肝星状细胞持续活化,造成慢性肝病迁延难愈^[18]。 Bcl-2的过度表达能使活化的人肝星状细胞对预凋亡刺激产生抵抗^[19]。此外，bax基因作为凋亡促进基因，它的表达上调能促进细胞凋亡，各实验组肝组织中干扰素α-2a干预组bax基因的表达较肝纤维化模型组有所上调，12×10⁴ U/kg干扰素α-2a干预组bax基因的表达高于6×10⁴ U/kg干扰素α-2a干预组，以上结果提示干扰素α-2a能上调CCl₄诱导肝纤维化肝组织中bax基因的表达，作用效果亦可能与干扰素α-2a的剂量相关。

有研究表明 bcl-2、bax的表达失衡可使肝星状细胞增殖和凋亡失衡^[20]。肝星状细胞凋亡抑制基因bcl-2与促凋亡基因bax的比例是凋亡决定因素，肝星状细胞激活转化为肌成纤维样母细胞后其凋亡敏感性增加可能与bcl-2表达明显下降，使促凋亡基因表达占优势有关。各实验组之间bcl-2/bax值有差别，纤维化模型组bcl-2/bax值最高，生理盐水对照组最低，干扰素α-2a干预组bcl-2/bax值介于B、6×10⁴ U/kg干扰素α-2a对照组之间；12×10⁴ U/kg干扰素α-2a干预组bcl-2/bax值低于6× 10⁴U/kg干扰素α-2a干预组，提示干扰素α-2a能下调CCl₄诱导肝纤维化肝组织中bcl-2/bax值，其作用效果可能与干扰素α-2a剂量相关。生理盐水对照组、6×10⁴U/kg干扰素α-2a对照组之间bcl-2/bax值相近(P > 0.05)，提示干扰素α-2a作为单因素干预不影响本实验结果。

综上所述，干扰素α-2a存在通过调节bcl-2、bax基因的表达，诱导活化的肝星状细胞凋亡途径,从而阻断CCl₄诱导的肝纤维化，且该调节作用可能与干扰素α-2a的剂量相关。

基金资助：江西省科技厅基金资助项目(2009BSB11115)。
作者贡献：课题设计由通讯作者主持，实施由第一至五作者共同完成；论文写作由第一作者和通讯作者共同完成。评估为第二作者，采用盲法评估。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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