1.4.5  Real-time PCR检测大鼠脑海马组织中GFAP mRNA的表达  取出-80 ℃冷冻保存的幼年大鼠海马组织，在EP管中加入50 mg组织与1 mL Trizol，剪碎脑组织并用5 mL注射器抽打，提取细胞沉淀中的总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，按Takara(RR047A)反转录试剂盒条件配20 μL体系进行反转录，取出标本，按Takara(RR047A)扩增试剂盒说明加入引物(Takara公司设计合成，见表1)及试剂配20 μL体系进行PCR扩增，反转录得到cDNA；新鲜稀释阳性模板，取不同梯度上机，得出RT-PCR标准曲线；上样，每个样本2个指标，每个指标3个重复孔。

2.3.1  GFAP+p-ERK荧光显示结果  见图1。癫痫模型组匹鲁卡品致幼年大鼠癫痫持续状态后，其GFAP+p-ERK共表达较正常对照组海马区CA1、CA3和DG区有明显的增加，以CA1区较明显(P < 0.05)，而JWH133组较癫痫模型组有所减少(P < 0.05)，JWH133组与正常对照组相差不多；AM630组在经过激动剂JWH133和拮抗剂AM630处理后，GFAP+p-ERK共表达较JWH133组有明显增多(P < 0.05)，并且较癫痫模型组也有所增加，双重荧光比值分析见表2和图2。

2.3.1  GFAP+p-ERK荧光显示结果  见图1。癫痫模型组匹鲁卡品致幼年大鼠癫痫持续状态后，其GFAP+p-ERK共表达较正常对照组海马区CA1、CA3和DG区有明显的增加，以CA1区较明显(P < 0.05)，而JWH133组较癫痫模型组有所减少(P < 0.05)，JWH133组与正常对照组相差不多；AM630组在经过激动剂JWH133和拮抗剂AM630处理后，GFAP+p-ERK共表达较JWH133组有明显增多(P < 0.05)，并且较癫痫模型组也有所增加，双重荧光比值分析见表2和图2。

2.3.1  GFAP+p-ERK荧光显示结果  见图1。癫痫模型组匹鲁卡品致幼年大鼠癫痫持续状态后，其GFAP+p-ERK共表达较正常对照组海马区CA1、CA3和DG区有明显的增加，以CA1区较明显(P < 0.05)，而JWH133组较癫痫模型组有所减少(P < 0.05)，JWH133组与正常对照组相差不多；AM630组在经过激动剂JWH133和拮抗剂AM630处理后，GFAP+p-ERK共表达较JWH133组有明显增多(P < 0.05)，并且较癫痫模型组也有所增加，双重荧光比值分析见表2和图2。

2.3.2  GFAP+p-p38荧光显示结果  见图3。癫痫模型组匹鲁卡品致幼年大鼠癫痫持续状态后，其GFAP+p-p38共表达较正常对照组海马区CA1、CA3和DG区有明显增加，以CA1区较明显，而JWH133组较癫痫模型组有所减少，JWH133组与正常对照组相差不多；AM630组在经过激动剂JWH133和拮抗剂AM630处理后，GFAP+p-p38共表达较JWH133组有明显增多，并且较癫痫模型组也有所增加，双重荧光比值分析见表2和图4。

2.3.2  GFAP+p-p38荧光显示结果  见图3。癫痫模型组匹鲁卡品致幼年大鼠癫痫持续状态后，其GFAP+p-p38共表达较正常对照组海马区CA1、CA3和DG区有明显增加，以CA1区较明显，而JWH133组较癫痫模型组有所减少，JWH133组与正常对照组相差不多；AM630组在经过激动剂JWH133和拮抗剂AM630处理后，GFAP+p-p38共表达较JWH133组有明显增多，并且较癫痫模型组也有所增加，双重荧光比值分析见表2和图4。

2.3.3  GFAP+p-JNK荧光显示结果  见图5。正常对照组GFAP+p-JNK存在共表达，癫痫模型组匹鲁卡品致幼年大鼠癫痫持续状态后，其GFAP+p-JNK共表达较正常对照组海马区CA1、CA3和DG区有减弱，而JWH133组较癫痫模型组有增强，AM630组在经过激动剂JWH133和拮抗剂AM630处理后，GFAP+p-JNK共表达减弱，与单纯癫痫模型组无明显差异，可见通过调节CB2R会影响JNK在匹鲁卡品致幼年大鼠癫痫持续状态后的海马区表达，见表2和图6。

2.3.3  GFAP+p-JNK荧光显示结果  见图5。正常对照组GFAP+p-JNK存在共表达，癫痫模型组匹鲁卡品致幼年大鼠癫痫持续状态后，其GFAP+p-JNK共表达较正常对照组海马区CA1、CA3和DG区有减弱，而JWH133组较癫痫模型组有增强，AM630组在经过激动剂JWH133和拮抗剂AM630处理后，GFAP+p-JNK共表达减弱，与单纯癫痫模型组无明显差异，可见通过调节CB2R会影响JNK在匹鲁卡品致幼年大鼠癫痫持续状态后的海马区表达，见表2和图6。

2.4  癫痫幼年大鼠海马GFAP mRNA的动态表达  癫痫模型组GFAP的mRNA表达较正常对照组减少，JWH133组较癫痫模型组有明显增多，而AM630组GFAP的表达降低，见图7。

颞叶癫痫是难治性癫痫最常见的类型，占癫痫总发病率的20%^[1]，严重影响患者的学习、生活及家庭，成为神经系统疾病的一个顽疾。癫痫的发病机制十分复杂，至今未完全搞清楚，目前认为癫痫的发病机制与离子通道、神经递质、免疫、神经胶质细胞的改变有关^[2]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是众多信号蛋白的一种，其激活调控一系列细胞活动。活化的MAPK通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节^[3-5]。MAPK通路包括4种下游途径：细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、P38和ERK5/BMK1。大麻素2型受体(cannabinoid receptor type 2，CB2R)属于G蛋白偶联受体超家族，在中枢神经系统中有广泛的分布，比如大脑皮质、胼胝体、海马、基底节区、小脑。研究显示，CB2R在癫痫持续状态下幼年癫痫大鼠海马区呈现高表达，随癫痫发作后时间的延长达到高峰；CB2R通过调节PI3K/AKT通路增加“癫痫微环境”下星形胶质细胞增殖活性。由此可见，大麻素类物质对癫痫的发作有抑制作用，能够减轻癫痫对局部脑组织的损害。基于以上研究背景，该研究旨在通过检测MAPK通路中的不同蛋白来阐明CB2R对幼年大鼠癫痫持续状态后的作用，以此来研究CB2R对癫痫的意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年9月至2018年9月在中国医科大学附属盛京医院实验室完成。

1.3  材料  健康雄性SD大鼠40只，18-21 d龄，体质量30-50 g，购自辽宁长生生物有限公司，保持12 h/12 h明/暗周期，室温维持在22-24 ℃，自由进食和饮水。40只SD大鼠随机分为4组，每组10只：正常对照组、癫痫模型组、CB2R激动剂JWH133组和CB2R拮抗剂AM630组。

1.4  实验方法

1.4.1  癫痫动物模型建立  首先大鼠经腹腔注射氯化锂 (3 mEq/kg，即127 mg/kg)，18-20 h后腹腔注射匹鲁卡品(30 mg/kg)，在注射匹鲁卡品前30 min腹腔注射溴化甲基东莨菪碱(1 mg/kg)以拮抗匹鲁卡品外周胆碱能反应，每 30 min腹腔注射1次10 mg/kg匹鲁卡品，直到出现癫痫持续状态，每只大鼠匹鲁卡品注射剂量≤60 mg/kg。正常对照组以生理盐水代替氯化锂及匹鲁卡品，其他处理同上。观察大鼠腹腔注射匹鲁卡品后行为学变化，痫性发作等级评价标准采用Racine(1972年)分级标准：0级：无反应；Ⅰ级：耳面部肌肉抽搐；Ⅱ级：以点头或甩尾为主的肌肉抽搐；Ⅲ级：单侧肢体的阵挛及抽搐；Ⅳ级：双侧肢体阵挛或全身强直阵挛发作，伴有身体直立；Ⅴ级：抽搐，持续站立、身体背曲强直、跌倒。根据以上评价标准，经过Ⅳ级以上发作后进入惊厥持续状态认为造模成功，为减少动物死亡率，在癫痫持续状态后90 min给予地西泮(10 mg/kg)腹腔注射以终止癫痫持续状态，监测癫痫持续状态脑电图。

1.4.2  造模后各组干预情况  正常对照组：正常大鼠腹腔注射生理盐水；癫痫模型组：腹腔注射氯化锂和匹鲁卡品造模，发生癫痫持续状态后24 h处死采集标本；JWH133组：腹腔注射氯化锂和匹鲁卡品造模，癫痫终止后，每6 h腹腔注射CB2R激动剂JWH133(参考剂量1.5 mg/kg)，发生癫痫持续状态后24 h处死采集标本；AM630组：模型+ CB2R激动剂+CB2R拮抗剂：腹腔注射氯化锂和匹鲁卡品造模，癫痫终止后，每6 h先腹腔注射拮抗剂AM630(参考剂量1 mg/kg)，15 min后注射CB2R激动剂JWH133 (参考剂量1.5 mg/kg)，发生癫痫持续状态后24 h处死采集标本。

1.4.3  标本采集及制备  实验动物分别于癫痫持续状态后24 h处死。先将实验动物(每组10只)给予10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，经左心室灌流(生理盐水和40 g/L多聚甲醛)后迅速开颅取脑，一部分脑组织于40 g/L多聚甲醛中低温避光固定，脱水、透明、浸蜡、包埋，制成5 μm厚的组织切片用于免疫荧光等检测，另一部分脑组织放入液氮速冻转至-80 ℃保存用于后续Real-time PCR检测。

1.4.4  免疫荧光检测大鼠脑海马组织中GFAP与p-ERK、p-p38、p-JNK的共表达  以GFAP来标记星形胶质细胞，应用免疫荧光方法对海马组织中星形胶质细胞进行鉴定。p-ERK、p-p38、p-JNK是GFAP通路中的主要3个通路分支，分别是ERK、p38、JNK的活化形式，所以检测p-ERK、p-p38、p-JNK的免疫荧光表达。

  取出多聚甲醛固定的脑组织，进行石蜡包埋、切片、免疫荧光前准备，抗原热修复，体积分数为3%过氧化氢以及体积分数为5%-10%血清封闭非特异性抗体，一抗稀释浓度GFAP/p-P38(1∶50/1∶200)，GFAP/p-ERK1/2   (1∶50/1∶50)，GFAP/p-JNK(1∶50/1∶100)。按照上述组合滴加抗体共同孵育，滴加至完全覆盖细胞，4 ℃孵育过夜，浸泡在PBS中5 min×3次，滴加荧光二抗，二者均用PBS(1∶200)稀释(以下操作注意避光)，滴加至完全覆盖组织，室温孵育90 min；浸泡在PBS中5 min×3次，滴加DAPI至完全覆盖组织以复染核，浸泡在PBS中5 min×3次，胶头滴管滴加半滴抗荧光淬灭剂，盖玻片封固。

  随机选取5个视野，分别计数每个视野p-ERK、p-p38、p-JNK与GFAP共表达的星形胶质细胞数，并除以总GFAP阳性的细胞数，计算出双重荧光表达率，最后取平均值。

1.4.5  Real-time PCR检测大鼠脑海马组织中GFAP mRNA的表达  取出-80 ℃冷冻保存的幼年大鼠海马组织，在EP管中加入50 mg组织与1 mL Trizol，剪碎脑组织并用5 mL注射器抽打，提取细胞沉淀中的总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，按Takara(RR047A)反转录试剂盒条件配20 μL体系进行反转录，取出标本，按Takara(RR047A)扩增试剂盒说明加入引物(Takara公司设计合成，见表1)及试剂配20 μL体系进行PCR扩增，反转录得到cDNA；新鲜稀释阳性模板，取不同梯度上机，得出RT-PCR标准曲线；上样，每个样本2个指标，每个指标3个重复孔。

1.5  主要观察指标  ①CB2R对癫痫发作的影响；②CB2R对大鼠海马星形胶质细胞MAPK通路的影响；③癫痫幼年大鼠海马GFAP mRNA的动态表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 12.0软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，两组均值比较在方差齐时用t 检验，若方差不齐用K个样本独立检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

颞叶癫痫是难治性癫痫最常见的类型，占癫痫总发病率20%^[1-6]，严重影响患者的学习、生活及家庭，成为神经系统疾病的一个顽疾。在儿童期可发病的癫痫疾病中，颞叶癫痫对抗癫痫药物不敏感，使患儿的癫痫发作控制不良，对其神经系统的正常发育产生较严重的影响，故应当积极控制在儿童期发作的颞叶癫痫，以减少对患儿生长发育的不良影响。

癫痫的发病机制十分复杂，至今未完全搞清楚，目前认为癫痫的发病机制与离子通道、神经递质、免疫、神经胶质细胞的改变有关^[7-12]。该实验应用匹鲁卡品致癫痫持续状态模型，该模型较点燃模型及海人酸致痫大鼠模型在行为、脑电图、病理等特性上与人类颞叶癫痫有很高的相似性^[13-20]，在此基础上研究CB2R对幼年大鼠发生癫痫持续状态的作用，以及对癫痫持续状态海马组织中星形胶质细胞和MAPK信号通路的影响。

在匹鲁卡品诱导持续状态癫痫模型组幼年大鼠，给予地西泮注射终止其惊厥持续状态后仍有间断的Ⅳ级、Ⅴ级惊厥发作，而在给予CB2R激动剂JWH133后，其再次发生Ⅳ级、Ⅴ级惊厥的频率较癫痫模型组有明显减少(P < 0.05)，而这种保护作用在给予CB2R拮抗剂AM630后被明显抑制，JWH133组与AM630组再次发生Ⅳ级、Ⅴ级惊厥的概率也有明显差异(P < 0.05)，可见激活CB2R可以减轻癫痫大鼠的临床发作，而抑制CB2R后大鼠癫痫发作加重，可见调控CB2R可以影响癫痫的发作。

在既往的研究中多针对神经元的活性和增殖情况，对于星形胶质细胞的研究较少，虽然癫痫的发生是因为大脑神经元异常放电所引起的，但是作为中枢神经系统中数量最多、体积最大的星形胶质细胞在癫痫发生中的作用也是至关重要的^[21-28]。既往认为星形胶质细胞主要是对神经元提供营养和支持作用。现在随着研究的深入，发现星形胶质细胞可以通过调动离子和神经递质来作用于神经元，例如星形胶质细胞调控信号通路、谷氨酸受体、水和钾、钙离子代谢、缝隙连接和炎症免疫反应，这些作用都与癫痫的发病密切相关^[29-34]。现在对癫痫的信号通路研究较为广泛，如MAPK、NF-κB、mTOR、Wnt等^[33-37]，该实验主要对MAPK通路进行研究。

      MAPKs是众多信号蛋白的一种，其激活调控一系列细胞活动。活化的MAPK通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节^[14-22]。MAPK 信号转导是以三级激酶级联的方式进行的，首先MAPK激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAKKK)受有丝分裂原刺激磷酸化而激活，在此基础上MAPKKK 转而磷酸化激活MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)，最后由MAPKK磷酸化激活MAPK，使其活化进而转入核内。MAPK通路包括4种下游途径：ERK、JNK、P38和ERK5/BMK1。XU等^[38]通过对脊髓基因的扩增、表达分析，显示CB2R激活可以通过MAPK途径对紫杉醇导致的神经病理改变起到保护作用。BALENQA等^[39]通过对人类特殊易感细胞HEK293细胞进行实验，发现CB2R可以激活ERK1/ERK2信号通路。SU等^[40]发现CB受体激动剂WIN55、212-2和脂肪酸酰胺水解酶抑制剂URB597对慢性低灌注导致的神经元凋亡有抑制作用，是通过抑制c-Jun N端激酶信号通路而实现的。WANG等^[41]在实验性膀胱炎中发现有CB2R的激活，是通过MAPK通路而实现的，其中ERK1/2、p38和JNK均有参与，但是3条通路之间的交叉并未提及。该实验通过检测MAPK通路中的不同蛋白来阐明CB2R对幼年大鼠癫痫持续状态后的作用，以此来研究CB2R对癫痫的意义。

GFAP作为星形胶质细胞特异性的表达蛋白，Real-time PCR结果显示：癫痫模型组较正常对照组GFAP mRNA表达减少，考虑在癫痫持续状态后24 h处死大鼠，星形胶质细胞仍处于缺血缺氧状态，故GFAP表达减少，而JWH133能够减少癫痫持续状态对星形胶质细胞的损害，然而通过何种作用机制来保护AST，需要进一步研究。实验以GFAP与MAPK通路中ERK、JNK和P38活化后的形式，即p-ERK、p-JNK和p-p38进行双标检测。GFAP与p-ERK双标在CA1、CA3、DG区均有共同表达，癫痫模型组较正常对照组增多，说明癫痫持续状态后可以促使星形胶质细胞内的ERK激活，使其磷酸化，继续进行下一步通路的传递，而JWH133组GFAP与p-ERK的共表达较癫痫模型组有所减少，但在AM630组中共表达再次增多，说明应用CB2R选择性激动剂JWH133可以抑制星形胶质细胞中ERK的活化，而这种作用可以被CB2R抑制剂AM630所减弱，CB2R可以对癫痫持续状态后的星形胶质细胞的ERK进行调控；而同样在GFAP与p-p38的共表达中，癫痫模型组较正常对照组明显增多，说明星形胶质细胞内的p38激活，而这种激活却在应用JWH133后有所缓解，在AM630组中再次增多，可见CB2R同样可以作用星形胶质细胞中的p38通道；但是在p-JNK与GFAP的共表达中，却没有得到与GFAP与p-ERK和p-p38共表达相类似的结果。癫痫模型组中p-JNK与GFAP表达较正常对照组有所减少，JWH133组较癫痫模型组增多，而AM630组再次减少，说明在癫痫持续状态后MAPK通路中的JNK被抑制，但是在JWH133的作用下却可以引起JNK的活化增多，使用AM630后进一步抑制其活化作用。整体可见CB2R在癫痫中有一定作用，其可作用于海马区的星形胶质细胞，并且可以作用MAPK通路中的ERK、JNK和P38分支通路。

实验在成功应用匹鲁卡品诱导癫痫持续状态后，应用CB2R选择性激动剂JWH133及抑制剂AM630，观察癫痫持续状态发作后的癫痫发作强度。所有动物均在癫痫持续状态后24 h处死，癫痫本身除了惊厥急性期对大鼠有影响，并且随着年龄增长，对大鼠的认知及行为也均有影响，所以在以后的研究中要对大鼠的生长进行一个动态监测，同时检测不同时间段MAPK通路中一系列蛋白表达变化情况。MAPK通路非常复杂，最重要的3条通路分别是ERK、p38和JNK，而通路中各蛋白之间的相互作用非常复杂，该研究只针对通路中的3个主要蛋白进行研究，但是也只对蛋白的激活做了检测，并未对蛋白通路阻断后星形胶质细胞的变化及CB2R的激活进行研究。癫痫持续状态后急性期有MAPK通路中3个分支通路的改变，分别是ERK、p38和JNK与星形胶质细胞间的共表达，发现癫痫持续状态后急性期海马组织中p-ERK、p-p38激活状态与星形胶质细胞共表达明显增加，增加CB2R的活性可以抑制星形胶质细胞中p-ERK、p-p38激活，而p-JNK在癫痫持续状态后的表达有所减少，增加CB2R的活性却能够促进星形胶质细胞中p-JNK激活。该实验是应用动物标本进行研究，为明确星形胶质细胞的作用与影响因素，将在细胞层面进行深一层次研究。

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文题释义：

癫痫持续状态：指连续癫痫发作、持续时间超过10-30 min以上或每次癫痫发作间隔时间短、没有意识清醒期，或者是出现了短暂的意识清醒马上又出现二次发作。分型如下：①局灶性癫痫持续状态：意识清醒，仅局部某个部位抽动或者感觉异常，对人体的影响相对较小；②全面性癫痫持续状态：在发作期间意识完全丧失或稍有缓解马上又出现意识丧失，对人体损害较大，易引起脑组织大量的缺氧，严重时可以造成患者的死亡，应及早干预。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)：是众多信号蛋白的一种，其激活调控一系列细胞活动。活化的MAPK通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节。

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大麻素2型受体(cannabinoid type 2 receptor，CB2R)属于G蛋白偶联受体超家族，在中枢神经系统中有广泛的分布。研究显示，大麻素2型受体在癫痫持续状态下幼年癫痫大鼠海马区呈现高表达，随癫痫发作后时间的延长达到高峰；大麻素2型受体通过调节PI3K/AKT通路增加“癫痫微环境”下星形胶质细胞增殖活性。由此可见，大麻素类物质对癫痫的发作有抑制作用，能够减轻癫痫对局部脑组织的损害。基于以上研究背景，该研究旨在通过检测MAPK通路中的不同蛋白来阐明大麻素2型受体对幼年大鼠癫痫持续状态后的作用。癫痫持续状态后急性期有MAPK通路中3个分支通路的改变，分别是ERK、p38和JNK与星形胶质细胞间的共表达，发现癫痫持续状态后急性期海马组织中p-ERK、p-p38激活状态与星形胶质细胞共表达明显增加，增加大麻素2型受体的活性可以抑制星形胶质细胞细胞中p-ERK、p-p38激活，而p-JNK在癫痫持续状态后的表达有所减少，增加大麻素2型受体的活性却能够促进星形胶质细胞中p-JNK激活。该实验是应用动物标本进行研究，为明确星形胶质细胞细胞的作用与影响因素，将在细胞层面进行深一层次研究。

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