甲状旁腺素相关蛋白亚基因对骨骺干细胞的调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.017

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (10): 1814-1820.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.017

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

甲状旁腺素相关蛋白亚基因对骨骺干细胞的调控

张树威，金伟，祝少博，成昊，金林，陶圣祥

武汉大学中南医院骨科、武汉大学医学院显微外科研究所，湖北省武汉市 430071

收稿日期:2012-06-10 修回日期:2012-07-18 出版日期:2013-03-05 发布日期:2013-03-05
通讯作者: 陶圣祥，博士，副主任医师，副教授，武汉大学中南医院骨科、武汉大学医学院显微外科研究所，湖北省武汉市 430071 zn-taoshengxiang@163.com
作者简介:张树威☆，男，1980年生，河南省漯河市人，汉族，2009年华中科技大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨病及干细胞研究。 soovycn@hotmail.com
基金资助:
中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(4101052)

Parathyroid hormone-related protein sub-gene regulates precartilagenous stem cells

Zhang Shu-wei, Jin Wei, Zhu Shao-bo, Cheng Hao, Jin Lin, Tao Sheng-xiang

Department of Orthopedics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Institute of Microsurgery, Wuhan University School of Medicine, Wuhan 430071, Hubei Province, China

Received:2012-06-10 Revised:2012-07-18 Online:2013-03-05 Published:2013-03-05
Contact: Tao Sheng-xiang, Doctor, Associate chief physician, Associate professor, Department of Orthopedics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Institute of Microsurgery, Wuhan University School of Medicine, Wuhan 430071, Hubei Province, China zn-taoshengxiang@163.com
About author:Zhang Shu-wei☆, Doctor, Attending physician, Department of Orthopedics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Institute of Microsurgery, Wuhan University School of Medicine, Wuhan 430071, Hubei Province, China soovycn@hotmail.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：甲状旁腺素相关蛋白-印第安刺猬蛋白两者相互作用调节着骨骺区软骨的分化成熟及增殖，促使骨骺区细胞处于一种相对稳定的状态。
目的：分析甲状旁腺相关蛋白亚基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)对骨骺干细胞的调控作用以及PTHrP(107-139)与其他调控因子的影响。
方法：用脂质体介导的基因转染技术将质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)分别转染pTet-on骨骺干细胞株，放入诱导分化培养基中进行培养，加入1 mg/L的强力霉素进行诱导，以RT-PCR的方法检测增殖细胞核抗原基因的表达变化。再次将质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染pTet-on骨骺干细胞株，加入不同浓度的强力霉素进行诱导，应用RT-PCR的方法检测Ⅱ型胶原、X型胶原、印第安刺猬蛋白、Ptc、Sox9、骨形态发生蛋白6基因的表达变化。
结果与结论：强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染组的增殖细胞核抗原表达明显高于质粒pTRE-PTHrP(1-36)转染组和质粒pTRE-PTHrP(38-94)转染组；在强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP (107-139)转染组中Ⅱ型胶原、Sox-9表达明显增强，Ihh表达未见明显变化，而 Ptc、X型胶原、骨形态发生蛋白6表达明显降低。而且其表达量与强力霉素存在剂量依赖性。提示PTHrP (107-139) 可能是通过调控Sox-9、Ptc、骨形态发生蛋白6的表达来促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的，而PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)对前癌干细胞的增殖并无明显作用。pTet-on质粒系统在前癌干细胞能有效的调控外来基因的表达。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 甲状旁腺相关蛋白, 印第安刺猬蛋白, 骨骺干细胞, 增殖, 分化, 增殖细胞核抗原, 其他基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The interaction between parathyroid hormone-related protein and Indian hedgehog protein both can regulate the differentiation, maturation and proliferation of cartilage in epiphyseal zone, which can help the cells in the epiphyseal stay in the relatively stable state.
OBJECTIVE: To analyze the regulatory effects of parathyroid hormone-related protein sub-gene (1-36), (38-94) and (107-139) on precartilaginous stem cells and the relationship between parathyroid hormone-related protein (107-139) and other regulating factors.
METHODS: The pTRE-parathyroid hormone-related protein (1-36), pTRE-parathyroid hormone-related protein P(38-94) and pTRE-parathyroid hormone-related protein (107-139) were transfected into pTet-on precartilagenous stem cells by liposome transfection method. The cells were cultured by differentiation-induced medium and the Tet-on was induced by 1 mg/L doxycycline respectively. Then the changes of expression of proliferating cell nuclear antigen gene were examined by reverse transcription-PCR. Plasmids pTRE-parathyroid hormone-related protein (107-139) were transfected into pTet-on precartilagenous stem cells which were induced by doxycycline with different concentrations respectively. Then the changes of expression of genes such as collagen type Ⅱ, collagen type Ⅹ, Indian hedgehog protein, Ptc, Sox-9 and bone morphogenetic protein 6 were examined by semiquantitative reverse transcription-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the group transfected with pTRE-parathyroid hormone-related protein (1-36) and pTRE-parathyroid hormone-related protein (38-94), the group transfected with pTRE- parathyroid hormone-related protein (107-139) expressed more proliferating cell nuclear antigen. For the group transfected with pTRE-parathyroid hormone-related protein (107-139), the expressions of collagen type Ⅱ and Sox9 were significantly increased, while the expression of Indian hedgehog protein did not change, and the expressions of Ptc, collagen type X and bone morphogenetic protein 6 were decreased. The expression of the genes showed a dose-dependent manner. As parts of parathyroid hormone-related protein, parathyroid hormone-related protein (107-139) may promote the proliferation and inhibit the differentiation of precartilagenous stem cells by regulating the expression of Sox-9, Ptc and bone morphogenetic protein 6. However, parathyroid hormone-related protein (1-36) and (38-94) were useless in proliferation of precancerous stem cells. pTet-on system can regulate the expression of alien genes effectively.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, parathyroid hormone-related protein, Indian hedgehog protein, precartilaginous stem cells, proliferation, differentiation, proliferating cell nuclear antigen, other grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R318

张树威，金伟，祝少博，成昊，金林，陶圣祥. 甲状旁腺素相关蛋白亚基因对骨骺干细胞的调控[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(10): 1814-1820.

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图/表（结果） 7

参考文献

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2010年10月至2012年4月在武汉大学医学院显微外科研究所完成(实验室的生物安全的防护水平：BSL-3)。
材料：
引物设计：根据GeneBank中大鼠Ⅱ型、X型胶原、Sox9、Ihh、Ptc、骨形态发生蛋白6、增殖细胞核抗原及GAPDH的基因序列设计引物材(上海英骏生物工程公司合成)，见表1。

甲状旁腺素相关蛋白亚基因与骨骺干细胞增殖分化及调控实验所需试剂及仪器：
Reagents and instruments:

实验方法：
质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE- PTHrP(107-139)转染pTet-on骨骺干细胞：①细胞培养：高表达、低背景的pTet-on骨骺干细胞(获赠于华中科技大学同济医院骨科郭风劲教授^[9])在含10 μg/L碱性成纤维生长因子、10 μg/L表皮生长因子和0.9%胎牛血清的EmbryoMax^TM-DMEM培养基中置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。用Complete^TMTrypsin Solution消化传代至六孔板中，1×10⁶/孔，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养至细胞贴壁后更换为全培养基[含体积分数10%胎牛血清、维生素C(50 mg/L)、地塞米松(10^-8 mol/L)的EmbryoMax^TM-DMEM]培养。②全培养基培养24 h后，细胞长至80%-90%融合度，吸去六孔板中旧培养液，D-Hanks液洗3遍，加2 mL无血清无抗生素的DMEM。③取4支洁净的1.5 mL Ep管中分别将4 μg质粒pTRE- PTHrP(1-36)、pTRE- PTHrP(38-94)、pTRE-PTHrP (107-139)和5 μL D-Hanks与250 μL无血清无抗生素的DMEM轻轻混匀。在另4支洁净的1.5 mL Ep管中将5 μL脂质体Lipofectamine ^TM2000与250 μL无血清无抗生素的DMEM轻轻混匀。室温孵育5 min，分别将上述Ep管中液体两两混合(含质粒的培养基与含脂质体的培养基)，上下翻转混匀，室温孵育20 min，将上述混合物分别加入已加无血清无抗生素DMEM的六孔板中，轻轻地来回晃动培养板，混匀所加试剂，在37 ℃、体积分数5%培养箱培养5 h后换为全培养基继续培养，24 h后分别加入1 g/mL强力霉素进行诱导培养48 h。
RT-PCR检测增殖细胞核抗原的表达：
总RNA提取：诱导培养48 h提取转染组及D-Hanks对照组细胞的总RNA，提取过程按Trizol试剂盒说明操作。以紫外分光光度计DU650测定质粒溶液浓度和纯度，读取其在分光光度计260 nm和280 nm处的吸收值，根据RNA浓度计算公式：浓度(g/L)=A₂₆₀×40×稀释倍数/ 1 000计算得浓度分别为1.024 3，1.315 6，1.132 5，0.946 5 g/L，纯度为1.796 0，1.836 5，1.695 0，1.753 6，符合反转录要求。
反转录：取上述RNA模板各5 μg，分别加Oligo_(dT)18 (质量浓度为0.5 g/L)1 μL，再加DEPC处理水至12 μL，温和离心混匀，置70 ℃孵育5 min后立即置冰上，加5× reaction buffer 4 μL、Rnasin1 μL、dNTP 2 μL；温和离心混匀后置37 ℃反应5 min；加反转录酶M-MLV 1 μL 42 ℃反应1 h后70 ℃反应10 min后4 ℃保存。
PCR反应：反应体系为：三蒸水14.2 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol/L) 2.5 μL，上游引物(10 μmol/L) 1 μL，下游引物(10 μmol/L) 1 μL，Taq DNA酶(2.5 U/μL) 0.3 μL，MgCL2 (25 mmol/L) 1.5 μL，cDNA 2 μL，反应总体积 25 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min；58 ℃退火45 s；72 ℃延伸45 s；经20个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳照相见pTRE-PTHrP(107-139)转染组增殖细胞核抗原表达明显强于pTRE-PTHrP(1-36)转染组、pTRE-PTHrP(38-94)转染组和对照组。
质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染pTet-on骨骺干细胞：同样的方法将质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染第4部分获得的高表达、低背景的pTet-on骨骺干细胞，24 h后分别加入0.1，0.5，2.0 mg/L 强力霉素进行诱导，用PBS设置空白对照一组。
RT-PCR检测骨形态发生蛋白6(50 ℃，26)、Ⅱ型胶原(54 ℃，28)、X型胶原(55 ℃，24)、Ihh(52 ℃，23)、Ptc (54 ℃，25)、Sox9(53 ℃，22)的表达：方法同上，括号中数值分别各引物及退火温度及循环次数，内参GAPDH退火温度及循环次数分别为54 ℃，23。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，方法同上。分析软件Quantity one(版本4.6)测定各实验组目的基因与内参的吸光度值，并以其吸光度值的比值做为该目的基因的相对转录量，观察在转染后，不同浓度强力霉素诱导组基因表达改变。
统计学分析：各实验组之间是否存在差异应用统计软件SPSS 13.0进行统计学分析，多组间比较用Student-Newman-Keuls法检验，两组间比较采用t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

Tet-off/Tet-on基因表达系统是Gossen和Bujard等构建的，它可以有效调控基因表达的时间和水平^[10]。pTet-on质粒是转染真核细胞后表达RTTA，RTTA必须与四环素衍生物强力霉素结合后才能成为顺式作用元件，并作用于反应质粒pTRE-2Hyg上的TRE，从而激活转录，启动下游的目的基因的表达。TRE具有开关功能严密、特异性强、诱导效率高、基因表达水平高、对细胞无毒性等特点。该系统不仅能提供高水平的表达，而且可以实现剂量依赖调控^[11]。该表达体系包含2 个关键质粒：一个是表达转录调控蛋白的质粒(pTet-on)；另一个是携带并表达外源基因的质粒(pTRE-2hyg)，即当加入强力霉素时外源基因表达，去除强力霉素时外源基因的表达关闭，而且表达水平随四环素浓度的增加而增加。

PTHrP是一种具有复杂结构和功能的激素原，它广泛分布于机体的多个组织器官，通过自分泌、旁分泌以及胞分泌的方式发挥不同的生理作用。PTHrP的结构非常复杂，可以被激素原转化酶家族加工为至少3个功能片断，即氨基酸末端的PTHrP(1-36)，中间片断的PTHrP(38-94)，以及羧基端的PTHrP(107-139)。研究表明PTHrP(1-36)是PTHrP的保守分泌形式，可以促进肾脏钙的重吸收和延缓骨质疏松的发生^[6]，PTHrP (38-94)可以通过激活IP(3)-DAG-PKC通路来维持局部钙离子浓度，钙离子的浓度又对成骨分化起着重要的作用^[7]。其中羧基端的PTHrP(107-139)具有抑制破骨细胞活性、促进成骨细胞增殖和促进成骨的特性，又被成为骨抑制素^[6，8]，但它在骨骺干细胞和软骨细胞的生长和分化中是否有作用、有何作用尚不清楚。

增殖细胞核抗原是一种反应细胞增殖状况的指标^[12]，实验中观察到随着加入强力霉素后，质粒pTRE-PTHrP (107-139)转染组的增殖细胞核抗原表达明显高于质粒pTRE-PTHrP(1-36)转染组、pTRE-PTHrP(38-94)转染组和对照组，证实了PTHrP(107-139)有促进细胞增殖的作用，而质粒pTRE-PTHrP(1-36)转染组、pTRE-PTHrP (38-94)转染组和对照组之间增殖细胞核抗原的表达没有显著差异，说明PTHrP(1-36)和PTHrP(38-94)对细胞的增殖能力没有明显影响。

Ⅱ型胶原是骨骺细胞增殖时的特异性增殖基因，也是骨骺干细胞的标志蛋白之一^[13]，而X型胶原的高表达则一般认为是肥大软骨细胞的标志^[14]。在实验中，相对于空白对照组，高表达PTHrP(107-139)诱导组中的Ⅱ型胶原表达增加，而X 型胶原表达减少，说明PTHrP (107-139)有抑制软骨细胞分化的作用。

骨形态发生蛋白有诱导软骨细胞发生和促使软骨细胞终末分化的作用。有研究发现骨形态发生蛋白6参与了骨骺生长板中PTHrp-Ihh信号轴的负反馈调控，骨形态发生蛋白6可促使骨骺区细胞成熟，并上调的Ihh表达，而PTHrP抑制软骨细胞成熟是间接通过抑制骨形态发生蛋白6的表达来完成的^[2]。实验中也观察到随着强力霉素的诱导浓度增加，即PTHrP(107-139)表达的增加，骨形态发生蛋白6的表达逐渐降低。

Ihh通过PTHrP信号来调控软骨细胞分化的速率和促进软骨细胞增值^[1]。Ptc是其受体，在骺板中广泛分布[15]。当Ihh与Ptc结合后，激活Ptc等目的基因的转录调控，促进了关节周围软骨膜中PTHrP的分泌，而PTHrP在前肥大软骨期的大量表达又会抑制Ihh的分泌，即PTHrp-Ihh负反馈信号轴(也被称为负反馈信号环)^[1]。在0.5 mg/L、2 mg/L强力霉素诱导组中，Ptc表达下调，可能是因为一种负反馈调节机制。而Ihh的表达未发现明显改变，这与以往报道的PTHrP表达增加会抑制Ihh的表达(即负反馈调节)这一结论不符，可能是因为实验方法的影响，也可能是PTHrP(107-139)与完整PTHrP区别点所在，这有待于进一步的研究去证实。

Sox基因是编码转录因子的高迁移组盒子超家族中的一员^[5]，其中Sox9在软骨发育、成熟过程中对维持细胞的表型及增强Ⅱ型胶原基因表达和促进Ⅱ型胶原合成增加方面发挥重要作用。有研究表明PTHrP通过Sox9来抑制软骨前体细胞向肥大软骨细胞转化^[4]。在实验中，在PTHrP(107-139)高表达组中(即2mg/L 强力霉素组)，Sox9的表达也明显增强。

从以上研究结果可以看出：质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染组骨骺干细胞的增殖细胞核抗原、Ⅱ型胶原表达明显增加，而X型胶原表达减少，说明PTHrP (107-139) 在促进骨骺干细胞增殖、抑制骨骺干细胞分化中发挥着重要作用。而质粒pTRE-PTHrP(1-36)、质粒pTRE-PTHrP(38-94)转染组骨骺干细胞的增殖细胞核抗原表达与对照组相比差异无显著性意义，说明亚基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)对PCSCs的增殖并无明显作用。在强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染组中Sox-9表达明显增强，Ihh表达未见明显变化，而 Ptc、骨形态发生蛋白6表达明显降低。说明THrP(107-139) 可能是通过调控Sox-9、Ptc、骨形态发生蛋白6的表达来促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的。而且上述因子的表达量与强力霉素存在剂量依赖性，再次表明了pTet-on质粒系统在PCSCs能有效的调控外来基因的表达。

由于多质粒的稳定转染成功率比较低，实验中尝试瞬时转染的方法，初步探讨了PTHrP亚基因在骨骺干细胞的增殖和分化中所发挥的作用，也揭示了PTHrP(107-139)与其他相关因子调控关系，对于PTHrP(107-139)表达增加未能使Ihh的表达发生明显改变这一点，还有待于进一步实验研究。

基金资助：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(4101052)。
作者贡献：设计由第一、六作者完成，实施由第一、二、三、四、五作者完成，评估由第一、六作者完成，均经过系统培训。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：未涉及与相关伦理道德冲突的内容。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

甲状旁腺素相关蛋白亚基因对骨骺干细胞的调控

Parathyroid hormone-related protein sub-gene regulates precartilagenous stem cells

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