衰老可导致间充质干细胞氧化损伤修复能力降低

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.015

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (10): 1801-1808.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.015

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衰老可导致间充质干细胞氧化损伤修复能力降低

张岳，余瑾，张艺，石家仲，黄亚琴，杨劲

解放军第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室，重庆市 400038

收稿日期:2012-10-09 修回日期:2013-01-18 出版日期:2013-03-05 发布日期:2013-03-05
通讯作者: 杨劲，博士生导师，教授，解放军第三军医大学基础部细胞生物学教研室，重庆市 400038 zhiwenchen@hotmail.com
作者简介:张岳★，女，1988年生，陕西省榆林市人，汉族，解放军第三军医大学在读硕士，主要从事DNA损伤修复方面的研究。 candice134@163.com
基金资助:
国家自然科学基金(81272822)，项目名称：Nanog调节膀胱癌干细胞DNA损伤应答介导顺铂耐药的作用与机制研究。

Aging reduces oxidative damage repair ability of mesenchymal stem cells

Zhang Yue, Yu Jin, Zhang Yi, Shi Jia-zhong, Huang Ya-qin, Yang Jin

Department of Cell Biology, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University of Chinese PLA, Chongqing 40038, China

Received:2012-10-09 Revised:2013-01-18 Online:2013-03-05 Published:2013-03-05
Contact: Yang Jin, Doctoral supervisor, Professor, Department of Cell Biology, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University of Chinese PLA, Chongqing 400038, China zhiwenchen@hotmail.com
About author:Zhang Yue★，Studying for master’s degree, Department of Cell Biology, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University of Chinese PLA, Chongqinq 400038, China candice134@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：DNA损伤及损伤后的应答异常会导致基因组不稳定，基因组不稳定是肿瘤形成的重要因素之一。在细胞衰老过程中，衰老细胞基因组稳定性下降，对于端粒、端粒酶的研究以及对于原癌基因和抑癌基因的研究，表明细胞衰老和肿瘤有密切的联系。
目的：以氧化损伤为模型，探索DNA损伤应答异常是衰老细胞基因组不稳定性的直接原因。
方法：培养骨髓间充质干细胞，流式细胞术进行检测鉴定。衰老相关β-半乳糖苷酶检测细胞衰老情况，BrdU掺入实验检测细胞增殖情况。建立体外培养人间充质干细胞衰老模型，通过CCK-8法检测细胞存活情况, DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧，单细胞凝胶电泳观察细胞DNA损伤情况。
结果与结论：人间充质干细胞经长期培养发生衰老，培养40代以后，衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多，BrdU掺入能力显著下降，提示间充质干细胞长期培养后发生衰老。生存曲线结果显示H₂O₂作用下，年轻间充质干细胞存活率明显高于衰老间充质干细胞；活性氧及单细胞凝胶电泳结果显示，H₂O₂处理后衰老间充质干细胞DNA损伤更严重，修复时间更长，说明衰老间充质干细胞比年轻间充质干细胞对H₂O₂损伤更为敏感。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 间充质干细胞, 衰老, DNA损伤修复, 氧化损伤, 衰老相关β-半乳糖苷酶, 活性氧, 单细胞凝胶电泳, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The abnormal DNA damage response may result in genomic instability, which is one of the pivotal factors of tumorigenesis. The genomic stability is decreased in senescent cells. Recent studies about telomere, telomerase, oncogenes and cancer suppressor genes indicate that cell aging is closely linked with cancer.
OBJECTIVE: Using an oxidative damage model to determine whether the abnormal DNA damage response is the direct cause of genomic instability in senescent cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured and identified by flow cytometry. Cell aging was detected using senescence-associated β-galactosidase. Cell proliferation was determined using BrdU incorporation test. Human mesenchymal stem cell aging model was established in vitro. Cell Counting Kit-8 was used to observe cell survival, and DCFH-DA fluorescent probe was used to detect intracellular reactive oxygen species. Then the cell damage repair ability was detected by single cell gel electrophoresis assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Human mesenchymal stem cells were found to be senescent after long term culture, implied by increased number of senescence-associated β-galactosidase-positive cells and decreased BrdU incorporation. The growth curve showed that the survival rate of senescent mesenchymal stem cells was lower than that of young mesenchymal stem cells after hydrogen peroxide treatment. Furthermore, supporting evidence from the reactive oxygen species detection and single cell gel electrophoresis assay demonstrates that senescent mesenchymal stem cells underwent more serious DNA damage and required longer repair time. All these results imply that senescent mesenchymal stem cells are more sensitive to hydrogen peroxide injury than their young counterparts.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, mesenchymal stem cells, aging, DNA injury repair, oxidative injury, senescence-associated β-galactosidase, reactive oxygen species, single cell gel electrophoresis assay, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

张岳，余瑾，张艺，石家仲，黄亚琴，杨劲. 衰老可导致间充质干细胞氧化损伤修复能力降低[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(10): 1801-1808.

Zhang Yue, Yu Jin, Zhang Yi, Shi Jia-zhong, Huang Ya-qin, Yang Jin. Aging reduces oxidative damage repair ability of mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(10): 1801-1808.

图/表（结果） 13

细胞学实验结果

2.1 间充质干细胞的培养及鉴定原代培养首次换液后，贴壁细胞多为单个长梭形细胞，偶尔见几个细胞的克隆，细胞在传代3次后，形态均一，呈长梭形，融合时呈旋涡状生长，见图1。

流式细胞检仪检测发现细胞表达阳性标志CD44、CD90，不表达阴性标志CD19、CD45，说明已成功建立骨髓来源的原代间充质干细胞培养体系。见图2。

2.2 细胞衰老情况 培养早期(P1-P20)，细胞约2 d增殖1代，倍增30代以后间充质干细胞增殖速度逐渐下降，细胞胞体增大、扁平，出现衰老迹象，培养晚期(P40-P50)细胞增殖1代7-10 d，衰老相关β-半乳糖苷酶检测细胞染色阳性率可达到90%以上。选取培养20代以前，衰老相关β-半乳糖苷酶阳性率<10%的间充质干细胞作为年轻间充质干细胞，见图3A；选取培养40代以后，衰老相关β-半乳糖苷酶阳性率>70%的间充质干细胞作为衰老间充质干细胞，见图3B。

2.3 BrdU掺入实验结果 见图4。掺入BrdU培养1.5 h时，年轻间充质干细胞和衰老间充质干细胞细胞阳性率无明显差别；掺入BrdU培养4 h时，年轻间充质干细胞的BrdU掺入率为(12.667±1.202)%，衰老间充质干细胞的BrdU掺入率为(6.667±0.667)%，差异有显著性意义(P < 0.05)。说明充质干细胞长期培养后细胞增殖能力明显下降，发生衰老。

2.4 细胞生存实验结果 CCK-8测定间充质干细胞被H₂O₂损伤后的细胞生存率见图5。

H₂O₂浓度低于100 μmol/L时，衰老间充质干细胞和年轻间充质干细胞细胞死亡不明显，存活率接近100%；当H₂O₂浓度高于100 μmol/L剂量以上时，衰老间充质干细胞和年轻间充质干细胞细胞均出现明显的细胞死亡；以较高剂量(100-600 μmol/L)H₂O₂处理后衰老间充质干细胞的存活率明显低于年轻间充质干细胞。

2.5 细胞内活性氧检测 见图6。相比对照组，H₂O₂组细胞内活性氧水平明显增高；衰老间充质干细胞荧光高于年轻间充质干细胞。表明衰老间充质干细胞内活性氧水平明显高于年轻间充质干细胞，并且与H₂O₂剂量呈正相关。

2.6 单细胞凝胶电泳 见图7，8。

结果显示，对照组年轻间充质干细胞和衰老间充质干细胞均无明显彗星细胞，H₂O₂组H₂O₂处理后1 h后年轻间充质干细胞和衰老间充质干细胞均出现大量彗星细胞；年轻间充质干细胞的彗星尾矩值为20.4±1.97，衰老间充质干细胞彗星尾矩值为35.0±2.40，衰老间充质干细胞彗星尾矩值较高，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明衰老间充质干细胞组DNA损伤较重。

文献分析

3.1 CNKI数据库2002至2011年收录干细胞衰老的文献数量 见图9。

CNKI数据库2002至2011年一共收录干细胞衰老的文献552篇。由图9可看出，在2002至2006年之间数量变化不明显，处于平台期，2007年与2006年相比文献数量大幅增加，而文献数量在2007至2010年之间数量变化不明显，2011年文献数量再次大幅增长。

3.2 CNKI数据库2002至2011年收录干细胞衰老文献的机构 见表1。

由表1可看出，解放军第四军医大学和南方医科大学分别发表了26篇文献是关于干细胞衰老方面的，居全国之首。重庆医科大学排在第3位，发表了23篇文献。其余发表相关文献较多的机构有解放军第三军医大学、暨南大学、中国协和医科大学、中国医学科学院放射医学研究所、郑州大学、浙江大学、山东大学。

3.3 CNKI数据库2002至2011年收录干细胞衰老文献的基金资助情况 见表2。

由表2可看出，在CNKI数据库2002至2011年收录干细胞衰老的552篇文献中，国家自然科学基金资助了77篇，资助比例很高。国家重点基础研究发展计划(973计划)和国家高技术研究发展计划(863计划)分别资助了17和13篇相关文献，其余基金资助的相关文献不足10篇。

3.4 CNKI数据库2002至2011年收录国家自然科学基金资助干细胞衰老的文献分析 见表3。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外实验，两组间样本比较。
时间及地点：实验于2011年5月至2012年7月在解放军第三军医大学基础部细胞生物学教研室肿瘤生物实验室完成。
材料：细胞学体外实验所用细胞来源于健康志愿者，年龄为18-30岁。
细胞学体外实验所用主要试剂及仪器：α-DMEM培养基，胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；25 cm细胞培养瓶，24孔、96孔细胞培养板(美国Coning公司)；干细胞鉴定试剂盒(SC0170，美国R＆D systems公司)；鼠IgG-FITC、鼠抗BrdU单克隆抗体(北京中杉公司)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(C0602，江苏碧云天公司)；550型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；离心机(美国Beckman公司)；倒置显微镜(Nikon eclipse Ti)，显微镜(Nikon eclipse E600)，荧光显微镜(Nikon eclipse E600，日本Nikon 公司)；流式细胞仪(Becton Dickinson FACSCalibur，美国Becton Dickinson公司)。
实验方法：
间充质干细胞的培养：收集骨髓悬液于15 mL离心管中，在室温下离心5 min，离心半径8 cm，转速1 000 r/min；离心后去上清，用5 mL新鲜含体积分数为10%胎牛血清的α-DMEM完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至10 cm培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿度培养箱中培养。约48 h后首次换液，7-10 d后细胞达到融合，进行传代，此时记为P1代，以后每两三天换液1次，每次传代时计数，计算细胞倍增代数，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。
间充质干细胞的鉴定：根据干细胞鉴定试剂盒说明书操作，流式细胞术检测间充质干细胞表面标志CD44、CD90、CD19、CD45表达情况。将原代培养的间充质干细胞用胰酶消化后置于10 mL离心管中用PBS漂洗1次；在室温下离心5 min，转速1 000 r/min，然后吸弃PBS，加预冷的2%牛血清白蛋白(BSA)2 mL，快速混匀，4 ℃封闭30 min；加入试剂盒中的一抗抗体，使其加入比例为1∶10，4 ℃孵育30 min；在室温下离心5 min，转速1 000 r/min，然后吸弃上清液；用PBS洗涤2次后用PBS重悬，加入二抗(鼠IgG-FITC)，使其加入比例为1∶100，4 ℃避光孵育30 min。用PBS洗涤2次后用 400 μL PBS重悬；流式细胞仪检测。
衰老相关β-半乳糖苷酶检测细胞衰老情况：将细胞接种至预置盖玻片的24孔板，培养24 h后取出细胞爬片用PBS漂洗2次，固定15 min，然后再PBS漂洗2次，按照说明书配方配置反应液，作用于细胞，37 ℃孵育过夜，光学显微镜下观察细胞染色情况，计数200个细胞计算染色阳性细胞百分比。
BrdU掺入实验检测细胞增殖情况：在生长细胞培养液中加入终浓度为10 μmol/L的BrdU，分2组分别培养1.5 h和4 h；用PBS清洗细胞，并用甲醇固定10 min；0.25%TritonX-100处理10 min；PBS清洗；2 mol/L HCL溶液中培养1 h；用0.1 mol/L硼酸溶液(pH=8.5)冲洗中和3次；用0.1%BSA对细胞进行非特异性封闭，然后一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜；二抗(鼠IgG-FITC)室温孵育1 h漂洗后DAPI染色后荧光显微镜下观察，每组计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。
细胞生存实验：以3 000个/孔的密度接种细胞于96孔板中，待细胞贴壁过夜后进行不同浓度过氧化氢(H₂O₂)处理，浓度分别为0，50，100，150，200，300，400，600，800 μmol/L。处理细胞2 h后换新鲜培养基继续培养48 h。CCK-8检测细胞存活情况，酶标仪波长为450 nm处测定各孔吸光度值，以吸光度值求细胞存活率并绘制细胞生存曲线。
细胞内活性氧检测：将细胞接种于24孔板，对照组细胞不进行药物处理，体积分数10%胎牛血清的α-DMEM完全培养液中培养；H₂O₂组细胞，以100 μmol/L H2O2处理细胞2 h，去除细胞培养液，加入按照1∶1 000稀释的DCFH-DA，终浓度为10 μmol/L。37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，荧光显微镜下观察。
单细胞凝胶电泳：H₂O₂组细胞用25 μmol/L H₂O₂处理，于处理后1 h收集细胞进行碱性单细胞凝胶电泳，对照组细胞不经过药物处理直接收集；收集完的细胞溶于1%低熔点胶中，迅速滴于提前制备的1%正常熔点琼脂糖凝胶的载玻片上，立即盖上盖玻片，凝固后将载玻片浸入新配制的4 ℃预冷的细胞裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na₂EDTA，10 mmol/L Tris，10% DMSO，1% TritonX-100，调pH 10.0)，4 ℃下裂解2 h；然后解旋液(300 mmol/L NaOH，1 mmol/L Na₂EDTA，调pH>13.0)中避光解旋20 min；0.5×TBE电泳液中0.7-1.0 V/cm 电泳20 min；PBS中和3次；无水乙醇固定15 min，溴化乙锭染色，荧光显微镜下观察^[12]。用CASP软件统计彗星尾矩作为判断损伤程度的指标。
主要观察指标：①长期培养间充质干细胞的衰老及增殖情况。②年轻间充质干细胞和衰老间充质干细胞对H₂O₂损伤的应答反应。
统计学分析：应用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析，数据以x(_)±s表示，组间比较采用两独立样本t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞是来源于中胚层的具有多向分化能力的干细胞，在全身结缔组织和器官间质中都有分布。其具有多向分化的潜能，除了成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞外，还可以分化为肌腱细胞、肌管、神经细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、心肌细胞等细胞^[23-26]，被广泛应用于组织工程及创伤修复研究中。目前间充质干细胞研究主要采用骨髓组织、真皮及胎儿脐血来源的间充质干细胞[27]，但在进行组织工程应用时尚需进行体外扩增后，方能达到细胞数量要求^[28-29]。干细胞在体外培养的过程中，不可避免的受到外界各种影响，近来有多项研究指出，间充质干细胞经长期体外培养后可能在基因表达^[30-31]、分化能力^[32]、扩增潜能和免疫表型方面发生变化甚至发生恶性转化^[33]。实验也发现间充质干细胞长时间体外培养至40代后，细胞体积明显增大，细胞的生长缓慢，衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞增加，BrdU掺入实验显示细胞增殖能力明显下降，提示间充质干细胞长期培养后发生衰老^[34-36]。

衰老是原代细胞培养过程中不可避免的细胞事件，然而衰老细胞基因及蛋白谱表达均会出现变化，从而对细胞功能产生影响^[37]。之前有报道指，衰老细胞的细胞周期、细胞复制、有丝分裂相关基因表达降低^[38]，尤其是DNA损伤修复基因表达明显下调^[39]，研究也发现，由老年个体分离出的间充质干细胞在增殖、抗凋亡能力等方面都低于年轻个体细胞^[9]。为了观察人骨髓间充质干细胞的衰老是否对其DNA损伤应答产生影响，本组实验以H₂O₂这种常见的氧化剂对体外培养年轻间充质干细胞及衰老间充质干细胞进行药物处理。药物生存曲线结果显示，在较高剂量(100-600 μmol/L)H₂O₂处理后年轻间充质干细胞存活率明显高于衰老间充质干细胞。活性氧检测发现损伤后衰老间充质干细胞活性氧水平明显高于年轻间充质干细胞，说明衰老细胞对氧化损伤更敏感。正常细胞代谢产生的氧自由基通常被内源性抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等清除^[40]，但在损伤严重或自身抗氧化防御系统功能下降的情况下，活性氧会在细胞内大量聚集，为了进一步检测H₂O₂对两种细胞DNA的损伤情况，实验进行了单细胞凝胶电泳实验，结果显示H₂O₂作用下衰老间充质干细胞的DNA损伤更为严重。

间充质干细胞自发现以来一直是干细胞领域的研究热点，然而长期的体外培养过程对细胞生物学特性产生影响并导致实验结果的不确定性和临床应用危险性。实验初步表明，长期体外培养可引起间充质干细胞衰老，对H₂O₂引起的氧化损伤更敏感，细胞DNA损伤修复能力降低，其机制可能为衰老引起细胞DNA损伤修复基因表达的下调，但具体的内在机制还需更深入的研究。

基金资助：国家自然科学基金(81272822)，项目名称：Nanog调节膀胱癌干细胞DNA损伤应答介导顺铂耐药的作用与机制研究。
作者贡献：实验设计为杨劲；实验实施为张岳，余瑾，石家仲，黄亚琴；实验评估为张岳；资料收集为张岳；张岳，余瑾成文；张艺和杨劲审校；张岳对文章负责。
利益冲突：课题不涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验获得解放军第三军医大学的伦理委员会批准。
知情同意：参与实验的患病个体及其家属自愿参加，所有供者对实验过程完全知情同意，在充分了解治疗方案的前提下签署“知情同意书”。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

衰老可导致间充质干细胞氧化损伤修复能力降低

Aging reduces oxidative damage repair ability of mesenchymal stem cells

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