激素性股骨头坏死模型中凋亡相关因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.010

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (7): 1189-1195.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.010

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激素性股骨头坏死模型中凋亡相关因子的表达

张锐东，张澜，毛洪刚，刘国栋

内蒙古医科大学第三附属医院骨科，内蒙古自治区包头市 014000

收稿日期:2012-10-19 修回日期:2013-01-31 出版日期:2013-02-12 发布日期:2013-02-12
通讯作者: 张澜，硕士，副主任医师，内蒙古医科大学第三附属医院骨科，内蒙古自治区包头市 014000 Zhangqian.li@yahoo.com
作者简介:张锐东★，男，1969年生，内蒙古自治区包头市人，汉族，1992年包头医学院毕业，硕士，主任医师。主要从事骨科疾病的基础与临床研究。 Xiaoyutian_321@163.com

Apoptosis-related factors in a model of steroid-induced necrosis of the femoral head

Zhang Rui-dong, Zhang Lan, Mao Hong-gang, Liu Guo-dong

Department of Orthopedics, Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2012-10-19 Revised:2013-01-31 Online:2013-02-12 Published:2013-02-12
Contact: Zhang Lan, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China Zhangqian.li@yahoo.com
About author:Zhang Rui-dong★, Master, Chief physician, Department of Orthopedics, Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China Xiaoyutian_321@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年研究发现，激素性股骨头坏死模型中存在大量凋亡骨细胞，而Caspase-3 及Bcl-2 为调节细胞凋亡的两个重要因子。
目的：观察Bcl-2和Caspase-3在激素性股骨头坏死大鼠模型中的表达及二者的相关性。
方法：选取健康Wistar大鼠60只随机分为2组，实验组臀肌注射泼尼松龙12.5 mg/kg，每周2次，制备激素性股骨头坏死模型；对照组注射等量生理盐水。分别于给药后4，8，12周获取离体大鼠股骨头，采用苏木精-伊红染色观察骨组织形态学改变，免疫组织化学染色观察Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达水平，并采用直线相关分析Bcl-2和Caspase-3的相关性。
结果与结论：对照组及实验组股骨头外形均完整，软骨面平整、光滑。随着给药时间的延长，实验组大鼠股骨头内骨小梁逐渐变细，脂肪细胞增多，骨陷窝空虚率明显升高。免疫组织化学染色显示：与对照组比较，实验组大鼠股骨头Caspase-3表达明显增高(P < 0.01)，且随给药时间的延长呈逐渐增高趋势；而Bcl-2的表达显著低于对照组(P < 0.01)。相关分析结果显示Bcl-2和Caspase-3在各组内的表达不具有相关性。提示激素可提高Caspase-3的表达促进骨细胞凋亡，降低Bcl-2的表达抑制抗凋亡作用，进而导致激素性股骨头坏死的发生和发展。

关键词: 组织构建, 组织构建实验造模, 激素性股骨头坏死, Bcl-2, Caspase-3, 相关分析, 细胞凋亡, 股骨头, 骨细胞, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have shown that a large amount of apoptotic osteocytes in the model of steroid-induced necrosis of the femoral head. Caspase-3 and Bcl-2 are two important factors for regulation of cell apoptosis.
OBJECTIVE: To observe Bcl-2 and Caspase-3 levels in a rat model of femoral head necrosis and their correlation.
METHODS: Sixty healthy Wistar rats were randomly divided into two groups (n=30). Experimental group was treated with gluteal muscle injection of prednisolone 12.5 mg/kg, twice per week, for establishing a femoral head necrosis model; control group was injected with the same amount of normal saline. Rat femoral head was removed after 4, 8 and 12 weeks respectively. Bone tissue morphological changes were observed by hematoxylin-eosin staining and the protein expression levels of Bcl-2 and Caspase-3 were observed using immunohistochemical staining. Linear correlation analysis was performed for analysis of correlation between Bcl-2 and Caspase-3.
RESULTS AND CONCLUSION: Femoral heads were complete in the experimental and control groups with smooth and flat cartilage surface. In the experimental group, the trabecular bone in the femoral head gradually became thinner, the number of adipose cells increased and percentage of empty lacunae significantly increased with the time of administration. Caspase-3 expression increased significantly in the experimental group compared with the control group (P < 0.01), trending to gradually increase with the time of administration. Conversely, the expression of Bcl-2 was lower in the experimental group than the control group (P < 0.01). The linear correlation analysis showed that there was no correlation between Bcl-2 and Caspase-3. These findings indicate that steroids can increase the expression of Caspase-3 promoting apoptosis of osteocytes and reduce the expression of Bcl-2 inhibiting anti-apoptotic role, which leads to the occurrence and development of steroid-induced necrosis of the femoral head.

Key words: tissue construction, experimental modeling in tissue construction, seroid-induced necrosis of the femoral head, Bcl-2, Caspase-3, correlation analysis, apoptosis, femoral head, osteocytes, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

张锐东，张澜，毛洪刚，刘国栋. 激素性股骨头坏死模型中凋亡相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(7): 1189-1195.

Zhang Rui-dong, Zhang Lan, Mao Hong-gang, Liu Guo-dong. Apoptosis-related factors in a model of steroid-induced necrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(7): 1189-1195.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 实验共纳入60只大鼠，无死亡，全部纳入结果分析。

2.2 大体观察结果 对照组和实验组股骨头外形均完整，软骨面平整、光滑。对照组及给药4周的实验组大鼠股骨头剖面均呈红色，无明显区别，给药8，12周的大鼠股骨头剖面呈浅红色。

2.3 激素性股骨头坏死大鼠股骨头的病理学改变 对照组软骨下骨板厚而连续，毛细血管网丰富。股骨头内骨小梁粗大，骨陷窝内骨细胞形态正常，髓腔内脂肪细胞少见，有大量造血组织，空虚骨陷窝较少，见图1A。

给药4周，实验组软骨下骨板厚而连续，股骨头内骨小梁较粗大，骨髓腔内脂肪细胞稍增多，红细胞较丰富，见图1B，骨陷窝空虚率低。

给药8周，实验组软骨下骨板稍变薄，连续性可，股骨头内骨小梁稍变细，骨髓腔内可见脂肪细胞增多，见图1C，骨陷窝空虚率较4周时增加。

给药12周，实验组软骨下骨板变薄，骨小梁变细、稀疏。骨髓腔内脂肪细胞急剧增多，变大，骨陷窝空虚率增加更明显，见图1D。

骨细胞生长于骨陷窝内，骨细胞坏死后，原有骨陷窝空虚，骨陷窝空虚率增高被认为是股骨头坏死的诊断标准(骨陷窝空虚率>20%)，对照组各时间点间骨陷窝空虚率差异无显著性意义(P > 0.05)，与对照组比较，实验组相应时间点骨陷窝空虚率明显升高(P < 0.01)，且随给药时间的延长，骨陷窝空虚率明显增加(P < 0.01)，见表1。

2.4 激素性股骨头坏死大鼠股骨头骨细胞中Caspase-3的表达 免疫组织化学染色显示，对照组及实验组骨细胞中均有Caspase-3的表达，主要表达在胞浆，呈黄色或棕黄色，见图2。

对照组各时间点Caspase-3表达差异无显著性意义 (P > 0.05)；实验组各时间点Caspase-3表达逐渐增高(P < 0.01)；与对照组比较，实验组股骨头骨细胞中Caspase-3的表达明显增高(P < 0.01)，见表2。

2.5 激素性股骨头坏死大鼠股骨头骨细胞中Bcl-2的表达 免疫组织化学结果显示，Bcl-2主要表达于骨细胞核周和胞浆内，呈棕黄色，实验组与对照组均有表达，见图3。

与对照组比较，实验组股骨头骨细胞中Bcl-2的表达明显降低(P < 0.01)，见表3。而实验组和对照组内各时间点比较Bcl-2的表达差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 激素性股骨头坏死模型大鼠股骨头组织Bcl-2和Caspase-3的相关性 相关分析结果显示，Bcl-2和Caspase-3在各组内的表达均不具有相关性(实验组r=0.111，对照组r=-0.054；P > 0.05）

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2010年8月在内蒙古医科大学第三附属医院实验中心完成。
材料：
实验动物：健康清洁级Wistar大鼠60只，体质量 200 g左右，雌雄不限，购自内蒙古大学动物实验中心，许可证号：SCXK(蒙)2011-0035。
激素性股骨头坏死大鼠股骨头凋亡相关蛋白检测用主要仪器和试剂：
Main reagents and instruments for detecting apoptosis-related proteins in the femoral head of rats with steroid-induced necrosis of the femoral head:

实验方法：
实验动物分组及模型制备：将60只大鼠随机分为2组，每组30只。大鼠适应性喂养1周后进行实验。称大鼠体质量后，实验组臀肌注射泼尼松龙12.5 mg/kg，每周2次，对照组注射等量生理盐水。
标本制备：分别于给药后4，8，12周，取对照组和实验组大鼠各10只处死后，取髋外侧切口，获取股骨头，沿冠状面劈开，观察股骨头大体形态，用中性甲醛液固定，制备石蜡切片，片厚5 μm。
苏木精-伊红染色观察股骨头的病理学改变：二甲苯脱蜡3次，2 min/次，梯度乙醇脱水，蒸馏水冲洗，苏木精染色2 min，水冲洗至无蓝色，伊红染色40 s，蒸馏水冲洗，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察骨陷窝，随机选取3张切片，每张切片任意选取10个视野，每个视野计数50个骨陷窝，计算骨陷窝空虚率。
免疫组织化学染色观察股骨头Caspase-3与Bcl-2的表达：常规石蜡切片脱蜡，体积分数3%的H₂O₂-甲醇室温下作用15 min后，蒸馏水冲洗，于10 g/L胃蛋白酶37 ℃孵育10 min，滴加50 μL小牛血清，室温封闭25 min后晾干，分别加入兔抗Caspase-3与Bcl-2多克隆抗体4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，滴加羊抗兔IgG 37 ℃孵育40 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素37 ℃孵育 30 min，PBS冲洗，DAB显色，自来水充分冲洗，复染、封固。光学显微镜下观察。在每张切片上随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞，取其平均值。
主要观察指标：激素性股骨头坏死模型大鼠股骨头的病理改变及Caspase-3与Bcl-2的表达。
统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，结果用x_±s表示，两组间比较采用t 检验，各时间点的比较采用方差分析，采用直线相关分析Bcl-2和 Caspase-3的相关性，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

激素可引起股骨头缺血性坏死已被临床和实验研究所证实，人和动物的反应是一致的^{[2, 8]}。因此，建立实验性动物模型是目前研究激素性股骨头坏死的重要手段之一。目前适用于研究激素性股骨头坏死疾病的动物模型有单纯激素模型、血清加激素模型^[9-11]、内毒素加激素模型^[12]。单纯激素模型通常给予每周一两次大剂量激素。为提高激素性股骨头坏死模型的成功率，实验采用泼尼松龙肌肉注射，剂量12.5 mg/kg，避免了传统剂量造成股骨头坏死少或死亡率高的缺点^[13]。实验中，随造模时间的增加实验组空骨陷窝数量增多，且明显高于同期对照组空骨陷窝数量，提示在激素性股骨头坏死中随激素应用时间的延长，空骨陷窝数量增多，骨细胞坏死增加。

凋亡不同于细胞坏死，有调节表皮、血液、骨等组织细胞数量，维持内环境稳定的作用^[14-15]。Bcl-2与Caspase-3是两种重要的凋亡因子，检测两种细胞因子的表达情况既能证明激素性股骨头坏死与凋亡的密切联系，还能从中分析凋亡在激素性股骨头坏死中的调控机制。

Caspase-3是白细胞介素1β转化酶家族成员之一，又称为半胱氨酸蛋白酶32，其在细胞凋亡过程中起着核心作用，被称为“死亡蛋白酶”^[16]。Caspase-3与其他的Caspase存在级联反应方式，主要作用在细胞凋亡的执行阶段。其主要受粒酶B，Caspase-1，Caspase-10，Caspase-2，半胱氨酸蛋白酶32激活蛋白酶以及自身等活化，活化后的Caspase-3酶切DNA依赖的蛋白激酶和聚腺昔二磷酸核糖多聚酶，从而影响DNA复制、转录和损伤修复^[17]。实验结果显示，在激素性股骨头坏死的动物模型中，实验组中Caspase-3表达显著高于同期对照组的表达，在实验组，造模12周Caspase-3表达显著高于造模4，8周，对照组内则无明显变化。Caspase-3作为凋亡发生过程中级联放大后最终执行者，直接导致细胞凋亡，所以实验组Caspase-3的升高为骨细胞凋亡的发生提供了最直接的证据。可以推测，Caspase-3表达上调同激素性股骨头坏死密切相关，提示在激素性股骨头坏死中的细胞凋亡有Caspase-3途径的参与，符合Nicholson^[18]的相关结果。同时在不同的时间点检测到的Caspase-3表达量的多少，也符合同时间点的激素性股骨头坏死的病理改变，其表达水平与疾病严重程度呈正相关。激素对Caspase-3具有重要调节作用，激素性股骨头坏死可能通过提高Caspase-3的表达导致骨细胞凋亡。

实验还选择Bcl-2作为凋亡的观察指标，Bcl-2是研究最早的凋亡相关基因，而且是目前已知的最重要的抗凋亡因子^[19-20]。目前，发现至少有15种Bcl-2家族成员，但它们的作用不尽相同，甚至相互拮抗，如Bax拮抗Bcl-2的保护效应。Bcl-2能够保护线粒体膜，并与Bax、蛋白激酶Raf-1、钙调蛋白磷酸酶、p53结合蛋白等结合，可阻止p53介导的细胞凋亡以及调节Caspase-3途径，发挥其抗凋亡的作用^[21-23]。

实验结果显示，Bcl-2在实验组的表达比对照组明显降低，但在不同时间点无明显差异，为什么没有出现明显的时间效应关系？考虑可能为以下因素所致：①Bcl-2在股骨头坏死凋亡活跃部位可能通过上调Bcl-2的表达来对抗骨细胞的凋亡，因此可能在数值上中和或部分中和了Bcl-2表达的降低。②Bcl-2也可以作为Caspase-3的水解底物而直接作用于Caspase-3的下游^[24]，被Caspase-3特异性酶解，酶解的Bcl-2片段从功能上发生了根本转换，从抑制凋亡变为触发凋亡，抑制凋亡因子的减少反馈性促进了Bcl-2表达的上调^[25]。虽然在实验组，没有发现Bcl-2的表达随时间降低，但与对照组相比，Bcl-2的表达下调却是很明显的，这说明在激素性股骨头坏死骨细胞中，其抗凋亡的作用受到明显的抑制。由于Bcl-2表达减少，未能抑制骨细胞凋亡，致骨细胞凋亡增加，促进了股骨头坏死的进程。

实验还分析了Bcl-2和Caspase-3表达变化的关系，发现在对照组中Caspase-3和Bcl-2都有一定量的表达。这符合正常骨细胞具有细胞凋亡的性质。说明二者在维持正常骨代谢中有重要作用。但在实验组中，施加了促凋亡因素，发现在4周就已经有Bcl-2和Caspase-3表达的改变，说明二者在早期即发挥作用，可以肯定Bcl-2和Caspase-3与激素性股骨头坏死具有密切关系。尽管Caspase-3可以促进骨细胞凋亡，但是进一步分析发现，Bcl-2和Caspase-3在各组中的表达不具有相关性，未显示出Caspase-3改变而引起Bcl-2改变导致激素性股骨头坏死的发生，其可能通过其他途径而发挥作用。

Caspase-3表达的上调与激素性股骨头坏死进程具有时间依赖性，激素性股骨头坏死可能通过提高Caspase-3的表达促进骨细胞凋亡，进而导致激素性股骨头坏死的发生、发展，其可能是一个重要调节因子。同时激素可能通过抑制Bcl-2表达达到抗凋亡作用，具体调节机制仍需进一步阐明。激素性股骨头坏死可能与激素导致的凋亡因子的改变具有重要关联，激素作用下的股骨头坏死可能通过凋亡机制介导。

作者贡献：张锐东进行实验设计，实验实施为张澜，实验评估为张锐东，资料收集为毛洪刚，张锐东成文，刘国栋审校，张锐东对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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