自体骨髓间充质干细胞移植梗死心肌猪的心功能变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.004

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (6): 969-973.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.004

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自体骨髓间充质干细胞移植梗死心肌猪的心功能变化

虞桂平¹，沈振亚¹，郭世强¹，余云生¹，陈国强²

1苏州大学附属第一医院胸心血管外科，江苏省苏州市 215000
2东南大学医学院附属江阴医院胸心血管外科，江苏省江阴市 214400

收稿日期:2012-05-13 修回日期:2012-06-18 出版日期:2013-02-05 发布日期:2013-02-05
作者简介:虞桂平☆，男，1980年生，江苏省靖江市人，东南大学医学院附属江阴医院胸外科工作，苏州大学附属第一医院胸心血管外科在读博士，主治医师，主要从事胸心血管外科基础研究。 Xiaoyuer97103@163.com

Cardiac function of pigs with myocardial infarction after autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation

Yu Gui-ping¹, Shen Zhen-ya¹, Guo Shi-qiang¹, Yu Yun-sheng¹, Chen Guo-qiang²

1 Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
2 Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Affiliated Jiangyin Hospital of Medical School of Southeast University, Jiangyin 214400, Jiangsu Province, China

Received:2012-05-13 Revised:2012-06-18 Online:2013-02-05 Published:2013-02-05
About author:Yu Gui-ping☆, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Xiaoyuer97103@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞移植可改善缺血性心肌血供并改善心功能。
目的：进一步验证自体骨髓间充质干细胞在心肌梗死后的应用及效果评价。
方法：15只健康太湖梅山猪通过冠脉栓塞建立心肌梗死模型。随机分为3组，每组5只，其中2组分别在心肌梗死后3 h，2周行自体骨髓干细胞移植，模型组不移植细胞。行心脏超声观察心脏功能各指标的改变；并在不同时间点检测血清血管内皮生长因子值；在实验终点取大体标本并通过免疫组织化学检测移植细胞在心肌内定植及分化情况，检测心肌血管密度。
结果与结论：心肌梗死3 h组与模型组比较，射血分数、左室舒张期内径、左室收缩期内径各项心功能指标及心肌血管密度、不同时间点血清血管内皮生长因子水平差异无显著性意义。心肌梗死后2周移植组与模型组相比，心功能指标均有改善，心肌血管密度大于模型组，血清血管内皮生长因子水平明显高于较移植前(P < 0.05)。提示不同时间点心肌微环境对于骨髓来源的间充质干细胞分化及定植的影响，心肌梗死后急性期内局部微环境不利于移植细胞的存活，在瘢痕修复早期行骨髓干细胞移植对骨髓干细胞的分化和定植以及对心功能的改善有较好的效果。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 心肌梗死, 缺血性心肌疾病, 干细胞移植, 心功能, 血管密度, 血管内皮生长因子, 分化, 定植, 猪, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Stem cells transplantation can improve the ischemic myocardial blood supply and improve the cardiac function.
OBJECTIVE: To further identify the application and effect of autologous bone marrow mesenchymal stem cells on the cardiac function after myocardial infarction.
METHODS: Fifteen Taihu Meishan pigs were selected to make the myocardial infarction models, and then divided into four groups (5 swine in each group). At 2 weeks after modeling, the pigs were treated with autologous bone marrow stem cells transplantation. The change in each index of cardiac function was observed with Doppler. The level of serum vascular endothelial growth factor was detected in different periods after transplantation. At the end of the experiment, the general specimens were removed, and the colonization and differentiation of the transplanted cells were detected with immunohistochemistry, and the myocardial vascular density was also detected.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no significant differences in ejection fraction, left ventricular internal dimension diastole and left ventricular internal dimension systole, as well as the myocardial vascular density and the level of serum vascular endothelial growth factor at different time points between myocardial infarction 3 hours group and model group. Compared with the model group, the cardiac function indicators were improved in the transplantation group at 2 weeks after transplantation, the myocardial vascular density in the transplantation group was higher than that in the model group, the cardiac function at 2 weeks after myocardial infarction was better than others and the serum vascular endothelial growth factor level was improved after transplantation (P < 0.05). The results suggest that myocardial microenvironment at different time points has different effects on bone marrow mesenchymal stem cell differentiation and colonization, and bone marrow-derived stem cell transplantation in the early scar repairing has positive effects on the improvement of cardiac function and the differentiation and colonization of bone marrow-derived stem cells.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, myocardial infarction, ischemic myocardial disease, stem cell transplantation, cardiac function, vascular density, vascular endothelial growth factor, differentiation, colonization, pig, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

虞桂平，沈振亚，郭世强，余云生，陈国强. 自体骨髓间充质干细胞移植梗死心肌猪的心功能变化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 969-973.

Yu Gui-ping, Shen Zhen-ya, Guo Shi-qiang, Yu Yun-sheng, Chen Guo-qiang. Cardiac function of pigs with myocardial infarction after autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 969-973.

图/表（结果） 5

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2007年6月至2010年6月在苏州大学胸心血管外科实验室完成。
材料：实验动物选取3月龄雄性健康太湖梅山猪，体质量为(22.5±2.9) kg，所有动物均是由苏州大学动物中心提供。
心肌梗死后自体骨髓间充质干细胞移植后的心功能变化实验中所使用的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
动物模型的建立：参照文献[4-5]采用明胶海绵栓塞冠状动脉建立心肌梗死模型。实验动物的喂养、观察均按照非临床研究管理规范(GLP)规定执行，实验前12 h起禁食，每次术前30 min肌注阿托品0.5 mg。麻醉诱导后太湖梅山猪置于仰卧位，在数字减影血管造影下，经鞘管将右冠状动脉导引导管送至左冠状动脉开口，通过泛影葡胺造影定位使导管顶端与左冠状动脉起始段同轴，将导丝沿导引导管送至左前降支第2对角支远端。经导管把自制1.0 mm×1.5 mm明胶海绵栓子用对比剂推注到左前降支第2对角支远端。
分组：实验分3组，每组5只。3 h移植组建模3 h后经冠状动脉注射骨髓间充质干细胞；2周移植组建模2周后经冠状动脉注射骨髓间充质干细胞；模型组各时间点冠状动脉注射DMEM。
自体骨髓间充质干细胞鉴定：参考文献[6]的方法进行骨髓干细胞鉴定。
不同时间点行骨髓干细胞移植：实验猪麻醉后固定，在数字减影血管造影下经股动脉插管至左冠状动脉栓塞远端，注射5 mL(1×10⁷个)干细胞悬液。术毕拔除动脉导管，局部压迫30 min后加压包扎，次日解除包扎心功能指标测定：各组实验动物均在各个观察点及8周心超检测心脏功能，观察指标包括左室舒张期内径、左室收缩期内径、射血分数。
血清血管内皮生长因子测定：分别在各个不同时间点抽血测得血管内皮生长因子。
心肌结构的显微观察：心脏大体标本行Ⅷ免疫组织化学染色测定。
主要观察指标：①干细胞移植前后猪体质量变化。②干细胞移植前后猪心功能变化。
统计学分析：运用SAS 6.12软件包进行数据统计，数据以x(_)±s表示，使用方差分析，检验水准：P=0.05。

讨论

自体骨髓干细胞移植可促进新生血管的形成，并在局部微环境刺激下向心肌样细胞分化，产生耦联，参加心室重构^[3-4]，但具体仍待进一步的研究。骨髓间充质干细胞可能在梗死区分化为有收缩功能的心肌细胞，并且在局部微环境的作用下骨髓干细胞可能向心肌样细胞分化^[7]，有学者研究表明Cx43是心肌缝隙连接的标志性蛋白，可能心肌细胞间的肌电耦联相关^[8]。并且有研究表明在成肌细胞和心肌细胞体外共同培养可发现两者的细胞膜上，有缝隙连接形成^[9]。心肌细胞与骨骼肌肌管间在形成电-机械耦联的基础上有可能同步收缩，与宿主细胞形成闰盘连接，形成电-机械耦合，参与心脏的收缩功能，但同时也存在多因素的影响，移植细胞可旁分泌泌刺激多种因子的分泌，促进新生血管的形成，建立侧支循环，改善梗死区血供，改善心脏功能^[10-11]。

超声心电图的检查中发现3h移植组与模型组相比，左室收缩期内径和左室收缩期内径变化差异无显著性意义，而2周移植组中左室收缩期内径和左室收缩期内径较对照组明显好转，可发现自体骨髓干细胞移植可改善心肌缺血性坏死心功能衰竭，从而有效改善心脏功能。实验结果表明， 2周移植组具有移植细胞定植和分化。心肌梗死早期炎症反应剧烈，对细胞的分化，定植及炎症反应的微环境的存在，这个阶段不利于干细胞定植，难以发挥作用。随着炎症的进展，心肌内局部微环境改变，炎症反应减弱，负因素减弱，移植的干细胞定植的风险较前明显减少，细胞通过定植后分化及刺激内分泌的作用可有效改善心功能^[12-15]，但至心肌梗塞晚期时，局部瘢痕形成，细胞基质框架均紊乱，不利于移植细胞的存活。

移植细胞可刺激局部细胞的增值，并通过旁分泌作用刺进相关因子的分泌，促进新生血管的形成^[16-19]。通过旁分泌作用形成新生血管可改善心肌梗死区的灌注，调整左室重塑^[20]，并且检测发现血管内皮生长因子的表达较前明显增加，可以促进新生血管的形成，达到改善心肌缺血的目的^[21]。

总之，通过对心肌梗死后不同时间点细胞移植治疗，在不同时间行骨髓间充质干细胞移植后的效果的分析，通过实验发现心肌梗死急性期内炎症反应强烈，局部微环境对移植细胞的存活不利，而在炎症减弱的瘢痕修复早期进行细胞移植对于细胞的定植分化及心功能的恢复较为有利。

作者贡献：第一作者构思并设计，经3次修改，所有作者共同起草，第一作者对本文负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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实验结果显示心肌梗死后不同时间点自体移植骨髓间充质干细胞对心功能影响效果有差异。

外审提出问题及作者解答如下：

问题1 ：文中未说明MIR是如何测定心梗面积百分比的。

作者解答：MRI可以对心肌灌注进行评估，清晰显示急性心肌梗塞的梗塞范围：注射Gd-DTPA后90秒钟和5分钟正常心肌和梗塞心肌的T1、T2值出现明显差异．正常心肌在注射后90秒钟T1、T2值较注射后5分钟明显缩短，而梗塞心肌正好相反这表明梗塞心肌中Gd—DTPA的流入和流出较正常心肌明显延迟，Gd-DTPA在组织间隙蓄积，提示利用Gd-DTPA不同时间引起心肌MR信号差别，可以区分正常心肌和梗塞心肌。于显示OMI（陈旧性心肌梗塞）病灶最大的层面，分别测量变薄区长度和左室内缘周长，以其长度占左室周长百分比标示梗塞面积大小。

根据异常的室壁运动区和室壁厚度，在心脏短轴磁共振电影图像上确定首过灌注图像上梗死区最大切面，成像参数如下：视野（FOV）：330 mm，矩阵：128×128，重复时间/回波时间（TR/TE）：480～550 msec/4.8 msec，扫描时间：22～23 msec，采用平面回波成像序列（EPI），flip=30o，层厚7 mm，每层10～12帧，共5～10层。用Cardiac分析软件连续三个心动周期测量左室每搏量（SV）、左室舒张末期内径（LVEDd）、收缩期室壁厚度（ESWT）、舒张末期室壁厚度（EDWT），并计算室壁收缩增厚率%（室壁收缩增厚率（%）=ESWT-EDWT/ESWT×100%）。通过“弹丸”（Bolus）方式静脉推注MRI造影剂Gd-DTPA，结合高速成像技术，行首过快速梯度回波（GRE）灌注成像，评价心肌局部灌注。成像参数如下：FOV：300～350 mm，矩阵：113×128～128×128，TR/TE：6.0～6.3 msec/2.1 msec，flip=15o，层厚8 mm。在稳定状态下获得5帧基础图像后，用磁共振高压注射器从耳缘静脉团注Gd-DTPA，用量0.3 mmol/kg，3 mL/s，再以等量的生理盐水冲洗导管，然后用动态分析软件Contrast_Uptake对梗死区和正常心肌（后或下室壁）（ROI）的信号强度进行测量

问题2：关于心梗模型：经LAD注入明胶海绵，由于明胶海绵是一种可降解物质完全降解14-19天，是否有再通情况？

作者解答：在行冠脉造影时未予以梗塞部位再通，可能，明胶海绵形成梗死后血管栓塞后形成梗死血栓形成，未发生再通现象本实验。

问题3：细胞移植：2周时明胶海绵并未完全降解，导管是如何通过栓塞部位的，导管通过以后血管是否再通？

作者解答：细胞移植时导管未通过栓塞部位，未发生再通

问题4：对结果的意见：绝大多数实验结果来源于《不同时间点移植自体骨髓间充质干细胞对心肌梗死后心功能改善的MRI研究》《中国组织工程研究与临床康复》- 2009-12-03。

作者解答：本实验是同一系统实验。观察重点不一，研究方向不一。

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Cardiac function of pigs with myocardial infarction after autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation

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