脂氧素受体激动剂对巨细胞病毒感染巨噬细胞的免疫负调节

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.019

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (5): 886-893.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.019

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脂氧素受体激动剂对巨细胞病毒感染巨噬细胞的免疫负调节

陈晓红^1，2，舒赛男¹，刘兴楼¹，王慧¹，张菊¹，杜小弋^1，2，李革¹，方峰¹

1 华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科系，湖北省武汉市 430030
2 武汉市儿童医院，湖北省武汉市 430016

收稿日期:2012-05-27 修回日期:2012-06-20 出版日期:2013-01-29 发布日期:2013-01-29
通讯作者: 方峰，博士，教授，华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科系，湖北省武汉市430030 ffang@tjh.tjmu.edu.cn
作者简介:陈晓红☆，女，1971年生，湖北省黄梅县人，汉族，华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科在读博士，副主任医师，主要从事儿科感染方面的研究。chenxiaohong2007d@hotmail.com
基金资助:
高等学校博士学科点专项科研基金(20090142110076)。

Negative immunomodulatory effect of lipoxin receptor stimulating agent on macrophages infected by human cytomegalovirus

Chen Xiao-hong^{1, 2}, Shu Sai-nan¹, Liu Xing-lou¹, Wang Hui¹, Zhang Ju¹, Du Xiao-yi^{1, 2}, Li Ge¹,
Fang Feng¹

1 Department of Pediatrics, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
2 Wuhan Children’s Hospital, Wuhan 430016, Hubei Province, China

Received:2012-05-27 Revised:2012-06-20 Online:2013-01-29 Published:2013-01-29
Contact: Fang Feng, Doctor, Professor, Department of Pediatrics, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China ffang@tjh.tjmu.edu.cn
About author:Chen Xia-hong☆, studying for doctorate, Associate chief physician, Department of Pediatrics, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China; Wuhan Children’s Hospital, Wuhan 430016, Hubei Province, China chenxiaohong2007d@hotmail.com
Supported by:
Special Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education, No.20090142110076

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂氧素可以抑制炎症细胞、内皮细胞、小鼠脾脏树突状细胞等合成细胞因子，还可以抑制炎性细胞因子对细胞的生物效应。
目的：分析脂氧素受体激动剂BML-111对人巨细胞病毒感染THP-1源巨噬细胞的免疫调节作用。
方法：用人巨细胞病毒 AD169毒株感染THP-1源巨噬细胞(MOI=0.5)，细胞培养后设立对照组、人巨细胞病毒感染组及人巨细胞病毒+BML-111组。在感染后0，1，2，4，12，24，48，72 h收集各组细胞培养上清液，以ELISA检测各组细胞因子的表达水平； RT-PCR检测各指标mRNA的表达强度；Western blot检测感染4 h的细胞核内p65亚基蛋白表达。
结果与结论：与对照组相比，其他两组各细胞因子蛋白及mRNA表达明显升高(P < 0.05)。与人巨细胞病毒感染组相比，人巨细胞病毒+BML-111组白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α显著降低，转化生长因子β显著升高(P < 0.05)，白细胞介素10差异无显著性意义(P > 0.05)；人巨细胞病毒+BML-111组各细胞因子mRNA均明显降低(P < 0.05)。与对照组相比，其他两组细胞核内NF-κB p65亚基蛋白浓度明显升高(P < 0.05)；人巨细胞病毒+BML-111组显著低于人巨细胞病毒感染组(P < 0.05)。说明BML-111可能通过抑制NF-κB的p65亚基核转位，减少白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的表达，促进转化生长因子β的表达，从而对人巨细胞病毒感染的THP-1源巨噬细胞发挥其免疫负调节作用。

关键词: 器官移植, 移植与免疫, 巨细胞病毒, 巨噬细胞, 脂氧素, 脂氧素受体激动剂, 免疫调节, 肿瘤细胞坏死因子, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Lipoxin can inhibit the synthesis of inflammatory cells, endothelial cells and mouse spleen dendritic cells into the cytokines, and it can also inhibit the biological effects of inflammatory cytokines on cells.
OBJECTIVE: To investigate the negative immunomodulatory effect of lipoxin receptor stimulating agent BML-111 on THP-1 macrophages infected by human cytomegalovirus.
METHODS: THP-1 derived macrophages were infected with human cytomegalovirus AD169 (multiplicity of infection=0.5), and the cultured cells were randomly divided into control group, human cytomegalovirus group and human cytomegalovirus+BML-111 group. Then the cell culture supernatant was collected at 0, 1, 2, 4, 12, 24, 48 and 72 hours after infection, and the expression levels of cytokines in each group were detected with enzyme-linked immunosorbent assay; mRNA levels of the factors were tested with real-time PCR; Western blot was used to detect the expression of p65 subunit protein in the nucleus after infection for 4 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the cytokine protein and mRNA expression both in human cytomegalovirus group and human cytomegalovirus+BML-111 group were increased significantly (P < 0.05). Compared with human cytomegalovirus group, the levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor α in human cytomegalovirus+BML-111 group were decreased significantly, and thus the level of transforming growth factor-β was increased greatly (P < 0.05). There was no significant difference of the level of interleukin-10 between the two groups (P > 0.05) mRNA expression. mRNA expression of all the cytokines in human cytomegalovirus+BML-111 group was lower than that in human cytomegalovirus group (P < 0.05). Compared with the control group, the level of p65 subunit protein in the nucleus of human cytomegalovirus group and human cytomegalovirus+BML-111 group was increased significantly (P < 0.05). The level of p65 subunit protein in the nucleus of human cytomegalovirus+BML-111 group was lower than that of human cytomegalovirus group (P < 0.05). BML-111 may decrease the expression of interleukin-1β and tumor necrosis factor α, and promote the expression of transforming growth factor-β by inhibiting the nuclear translocation of nuclear factor-κB p65. Thus it plays negative immunoregulation effect on THP-1 macrophages infected by human cytomegalovirus.

Key words: organ transplantation, transplantation and immunology, cytomegalovirus, macrophages, lipoxin, lipoxin receptor stimulating agent, immunomodulatory, tumor necrosis factor, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

陈晓红，舒赛男，刘兴楼，王慧，张菊，杜小弋，李革，方峰. 脂氧素受体激动剂对巨细胞病毒感染巨噬细胞的免疫负调节[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(5): 886-893.

Chen Xiao-hong, Shu Sai-nan, Liu Xing-lou, Wang Hui, Zhang Ju, Du Xiao-yi, Li Ge. Negative immunomodulatory effect of lipoxin receptor stimulating agent on macrophages infected by human cytomegalovirus[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(5): 886-893.

图/表（结果） 9

2.1 BML-111对人巨细胞病毒诱导THP-1源巨噬细胞分泌炎症因子的影响与对照组相比，其他两组各细胞因子在病毒感染后水平明显升高(P=0.032，0.013，0.023，0.012)。

肿瘤坏死因子α：对照组与人巨细胞病毒感染组比较，F=3.880，t=98.386；对照组与人巨细胞病毒+BML-111组比较，F=9.038，t=17.979；人巨细胞病毒感染组与人巨细胞病毒+BML-111组比较，F=3.948，t=9.181。见表1。

白细胞介素1β：人巨细胞病毒感染两组白细胞介素1β表达在12 h显著升高，趋势基本持平，之后呈持续下降趋势(P =0.013)。24 h后，人巨细胞病毒+BML-111组显著降低(P =0.002)。见表2。

白细胞介素10：人巨细胞病毒感染两组白细胞介素10均在0时即显著升高，之后呈缓慢上升趋势，两组间比较，差异无显著性意义(P=0.613)。见表3。

转化生长因子β：人巨细胞病毒感染两组转化生长因子β显著升高，且人巨细胞病毒+BML-111组高于人巨细胞病毒感染组(P =0.007)。见表4。

2.1 BML-111对炎症因子mRNA表达的影响与对照组比较，人巨细胞病毒感染组各细胞因子mRNA在病毒感染后水平明显升高(P =0.001，0.023，0.012，0.024)。与人巨细胞病毒感染组比较，人巨细胞病毒+BML-111组各细胞因子mRNA均在0时即升高，2 h达高峰，之后缓慢下降；且其表达均较人巨细胞病毒感染组降低( P=0.002，0.016，0.030，0.017)。

肿瘤坏死因子αmRNA水平：人巨细胞病毒感染组和人巨细胞病毒+BML-111组肿瘤坏死因子αmRNA在 1 h显著升高并于2 h达高峰，之后迅速下降。见表5。

白细胞介素1β mRNA水平：人巨细胞病毒感染组和人巨细胞病毒+BML-111组白细胞介素1β mRNA 在0时即开始升高，均于2 h达高峰，且同时于4 h 后迅速下降，于72 h降至最低。见表6。

白细胞介素10 mRNA水平：人巨细胞病毒感染组白细胞介素10 mRNA在1 h迅速升高至峰值，而后缓慢下降；人巨细胞病毒+BML-111组白细胞介素10 mRNA在0时开始升高，之后保持相对高水平，12 h缓慢开始下降。见表7。

转化生长因子β mRNA水平：人巨细胞病毒感染组和人巨细胞病毒+BML-111组转化生长因子βmRNA均在0时即升高，2 h达高峰，之后缓慢下降。见表8。

2.3 BML-111对转录因子NF-κB的p65亚基核转位的影响 Western blot结果显示人巨细胞病毒感染巨噬细胞4 h后，NF-κB的p65在核内表达明显升高(P < 0.05)，而予BML-111处理感染细胞4 h后，NF-κB的p65在核内表达明显降低(P < 0.05)，见图1。

图1 BML-111对人巨细胞病毒感染巨噬细胞转录因子NF-κB p65亚基在核内表达的影响

Figure 1 Effect of BML-111 on the expression of nuclear factor-κB p65 in the nucleus of macrophages infected with human cytomegalovirus

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引言

材料方法

设计：细胞免疫学实验。

时间及地点：于2009年9月至2010年5月在华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科病毒实验室完成。

材料：

样本：人单核细胞白血病THP-1细胞购自中国典型培养物保存中心(武汉)。人巨细胞病毒 AD169 病毒株由中国预防医学科学院病毒研究所提供，在本实验室传代适应。

脂氧素受体激动剂BML-111对巨细胞病毒感染巨噬细胞的免疫负调节实验的试剂及仪器：

Main reagents and instruments used in the experiment of negative immunomodulatory effect of lipoxin receptor stimulating agent on macrophages infected by human cytomegalovirus:

实验方法：

病毒感染性滴度测定：病毒感染性滴度测定采用标准蚀斑法。感染复数(MOI)设定：MOI=病毒蚀斑形成单位(PFU)/细胞计数，本实验采用MOI=0.5。

细胞培养：THP-1细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养，按1×10⁹ L^-¹转入细胞培养板, 加入终浓度为的100 nmol/L的PMA诱导使其分化为巨噬细胞。培养 24 h后，细胞用无血清的1640培养液洗3次。

实验分组：将培养细胞随机分成3组(每组各10孔)：①对照组：用与病毒液等体积的1640培养液处理THP-1源巨噬细胞1 h，更换维持液。②人巨细胞病毒感染组：用MOI=0.5的人巨细胞病毒感染THP-1源巨噬细胞1 h，更换维持液(含体积分数4%胎牛血清的RPMI 1640 培养液)。③人巨细胞病毒+BML-111组：MOI=0.5的人巨细胞病毒感染THP-1源巨噬细胞1 h，更换含100 nmol/L BML-111维持液。

病毒感染：接种适量人巨细胞病毒AD169病毒悬液，使MOI=0.5。以病毒吸附(37 ℃，1 h)后更换维持液的完成时间为计时起点(0 h)，设实验检测时间点为0，1，2，4，12，24，48，72 h，收集各时间点细胞样本及上清液，-70 ℃保存备用。

ELISA法检测炎症因子蛋白表达：以ELISA 测定上清中肿瘤坏死因子α，白细胞介素1β，白细胞介素10和转化生长因子β浓度，严格按照试剂盒说明书操作。 450 nm测吸光度，根据标准曲线求出样品浓度。

Real-time RT-PCR法检测炎症因子基因表达：采用SYBR green real - time RT-PCR法检测肿瘤坏死因子α，白细胞介素1β，白细胞介素10和转化生长因子βmRNA 的表达。Trizol提取细胞总RNA，检测RNA纯度1.72-1.85；取2 μg RNA 合成cDNA第1链，每份样本同时定量检测目的基因和内参GAPDH基因，各设3复管。各引物序列和扩增片段长度如下：白细胞介素1β(107 bp) ：上游引物5’-TCC CTG CCC ACA GAC CTT-3’，下游引物5’-GCA CAT AAG CCT CGT TAT CCC-3’; 肿瘤坏死因子α(71 bp): 上游引物 5’-CCG AGT CTG GGC AGG TCT A-3’，下游引物 5’-GCG TTT GGG AAG GTT GGA T-3’; 白细胞介素10(187 bp): 上游引物 5-CAA CCT GCC TAA CAT GCT TCG-3’ ，下游引物5’-TTG GGG CAT CAC CTC CTC-3’; tgf-β (207 bp): 上游引物5-GAA ACC CAC AAC GAA ATC TAT GA-3’ ，下游引物 5’-GCT GAG GTA TCG CCA GGA A-3’；GAPDH(96 bp) 上游引物5’-GCA CAG TCA AGG CCG AGA A-3’,下游引物5’-CCT CAC CCC ATT TGA TGT TAG TG -3’。反应体系: SYBR p remix Ex Taq 12.5 μL、forward p rimer (10 μmol/L) 0.5 μL、reverse p rimer (10 μmol/L) 0.5 μL、rox reference dye Ⅱ 0.5 μL和样本cDNA 1 μL，总体积25 μL。反应条件：95 ℃预变性10 s，1个循环；95 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，共45个循环。

Western blot法检测NF-κB的p65亚基在胞核内的表达：在感染4 h时，提取胞核蛋白，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，上样50 μg/孔进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，转膜时间60 min，用含1%脱脂奶粉的TTBS室温封闭1 h；加入 1∶100的兔抗人NF-κB p65多克隆一抗和1∶400的兔抗人肌动蛋白(β-actin)多克隆一抗与硝酸纤维膜4 ℃共孵育 20 h；加入工作浓度1∶1 000的标记有辣根过氧化物酶的山羊抗兔的二抗，在室温下孵育2 h；洗膜后与化学发光试剂ECL反应5 min，将X射线片放在硝酸纤维素膜上曝光5 min，冲洗胶片。用扫描仪扫描X光胶片，采用 QuantityOne4.62软件测定各条带的积分吸光度值。被检测蛋白相对分子质量：NF-κB p65亚基为 65 000，β-actin为42 000。以β-actin条带为内参照进行蛋白上样量的校正(校正值K=目的条带的积分吸光度/ β-actin条带的积分吸光度)，以校正值K对目的蛋白NF-κB p65亚基表达水平进行半定量分析。

主要观察指标：观察在BML-111干预下巨噬细胞在巨细胞病毒感染前后，促炎因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β，及抑炎因子白细胞介素10和转化生长因子β表达的变化，以及NF-κB p65亚基在细胞核内表达的变化。

统计学处理：采用SPSS软件13.0进行数据分析，以x(_)±s表示，先进行方差分析，同一时间点两组资料进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

巨噬细胞能介导炎症反应，通过分泌各种细胞因子，生长因子等参与组织修复和机体的免疫反应，并以吞噬和抗原递呈等方式联系天然免疫和获得性免疫应答^[8^-9^]。脂氧素可以促进巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬，从而发挥积极的抗炎促消退作用^[¹⁰^]。脂氧素对于炎性细胞因子的作用，一方面可以抑制炎症细胞、内皮细胞、小鼠脾脏树突状细胞等合成细胞因子；另一方面，脂氧素还可以抑制炎性细胞因子的对细胞的生物效应^[1^1-12^]。

炎性细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽，主要有促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素10、转化生长因子β等^[13]。肿瘤坏死因子α是机体应激反应产生最早的炎症递质，可诱导白细胞介素、干扰素、巨噬细胞集落刺激因子等多肽递质^[¹⁴^]，在细胞的生长死亡、肿瘤的形成、免疫反应和应激反应方面都具有重要的作用^[¹⁵^]。白细胞介素1β可诱导产生白细胞介素2、肿瘤坏死因子α 等细胞因子及其它炎症递质，同时还能与肿瘤坏死因子α产生协同作用引起血管扩张和白细胞介导的组织坏死，从而导致器官衰竭^[1⁶^]。白细胞介素10是由激活的巨噬细胞和T淋巴细胞产生，可抑制细胞介导的抗病原免疫反应，白细胞介素10还可以通过降低单核巨噬细胞的共刺激分子而减少抗原的提呈，具有强有力的抗炎和免疫抑制作用^[1⁷^]。Radnai等^[1⁸^]研究发现减少血清中早期炎症因子如肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β，增加白细胞介素10，对机体起保护作用。转化生长因子β是一类重要的生长调节细胞因子，对大多数细胞的增殖具有抑制作用，在调节细胞表型、抑制肿瘤等方面发挥着重要作用^[1^9-20^]。

实验结果显示，人巨细胞病毒感染可诱导巨噬细胞同时分泌促炎因子及抑炎因子。同时还显示，给予脂氧素受体激动剂BML-111处理感染细胞后，在蛋白水平，肿瘤坏死因子α表达明显受到抑制，并且先行下降；白细胞介素1β表达亦明显受到抑制；对白细胞介素10表达无明显差异；而转化生长因子β在各时间点表达均明显升高。在mRNA水平，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素10、转化生长因子β表达均受抑制，这与肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β蛋白表达改变一致，但与白细胞介素10、转化生长因子β蛋白表达存在矛盾，由于基因表达的转录和翻译发生的时间和位点存在时空间隔；转录后还有转录后加工，转录产物的降解，翻译，翻译后加工及修饰好几个层面。所以从转录水平和翻译水平可能并不完全一致；再次因为检测的时间点不同，可能在蛋白达到峰值的时候mRNA已经降解了或者在mRNA达到峰值的时候蛋白量还在增加中，导致了表达的不一致。提示BML-111可抑制促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β基因及蛋白表达，促进抑炎因子转化生长因子β蛋白表达，对抑炎因子白细胞介素10蛋白表达无影响^[21-22]。因此作者推测，BML-111对人巨细胞病毒感染诱导的巨噬细胞活化产生负调节作用。

另外，对人巨细胞病毒诱导的NF-κB的主要亚基之一p65核转位的检测显示，人巨细胞病毒感染巨噬细胞4 h后，p65在核内表达明显升高，而予BML-111处理感染细胞4 h后, NF-κB的p65在核内表达明显降低。数据表明，人巨细胞病毒感染能诱导转录因子NF-κB的p65亚基核转位，而BML-111能抑制人巨细胞病毒感染诱导的转录因子NF-κB p65亚基核转位。BML-111可以抑制促炎因子TNFα和白细胞介素1β表达；同时BML-111又可抑制NF-κB p65亚基核转位，从而抑制NF-κB激活。NF-κB可以促进细胞因子、黏附分子、趋化因子等基因转录，在免疫调控、炎症、应激反应及细胞凋亡中起重要作用^[²³^]，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等促炎因子是经NF-κB途径激活而表达^[²⁴^]，由此推测，BML-111抑制NF-κB的p65亚基核转位是BML-111抑制促炎因子表达而发挥免疫负调节作用的主要机制之一。

综上，巨细胞病毒感染所诱导的免疫致病机制十分复杂，BML-111可能通过抑制NF-κB的p65亚基核转位, 减少白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的表达，促进转化生长因子β的表达，从而对人巨细胞病毒感染的THP-1源巨噬细胞起免疫负调节作用^[25-26]。此结论为寻找治疗巨细胞病毒感染性疾病提供了新的思路，并为临床应用奠定了一定的理论基础。

脂氧素受体激动剂对巨细胞病毒感染巨噬细胞的免疫负调节

Negative immunomodulatory effect of lipoxin receptor stimulating agent on macrophages infected by human cytomegalovirus

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