人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体转染椎间盘正常髓核细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (2): 259-263.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.013

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人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体转染椎间盘正常髓核细胞

吴劲风，叶冬平，戴丽冰，梁伟国

暨南大学第四附属医院，广州市红十字会医院，广东省广州市 510220

收稿日期:2012-07-11 修回日期:2012-08-12 出版日期:2013-01-08 发布日期:2013-01-08
通讯作者: 梁伟国，硕士，主任医师，暨南大学第四附属医院，广州市红十字会医院，广东省广州市 510220 yedongping927@126.com
作者简介:吴劲风，男，1962年生，广东省广州市人，汉族，副主任医师，主要从事组织工程椎间盘研究。yedongping927@126.com
基金资助:
广州市医药卫生重点项目(2009-zdi-04)；2010年广东省自然科学基金(10151022001000005)；2011年广东省自然科学基金(S2011010000910)。

Recombinant green fluorescent protein plasmids expressing human telomerase reverse transcriptase transfect normal nucleus pulposus cells in the intervertebral disc

Wu Jin-feng, Ye Dong-ping, Dai Li-bing, Liang Wei-guo

Fourth Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou Red-Cross Hospital, Guangzhou 510220, Guangdong Province, China

Received:2012-07-11 Revised:2012-08-12 Online:2013-01-08 Published:2013-01-08
Contact: Liang Wei-guo, Master, Chief physician, Fourth Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou Red-Cross Hospital, Guangzhou 510220, Guangdong Province, China yedongping927@126.com
About author:Wu Jin-feng, Associate chief physician, Fourth Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou Red-Cross Hospital, Guangzhou 510220, Guangdong Province, China yedongping927@126.com
Supported by:
Supported by: the Major Medicine and Health Program of Guangzhou City, No. 2009-zdi-04*; the Natural Science Foundation of Guangdong Province in 2010, No. 10151022001000005*; the Natural Science Foundation of Guangdong Province in 2011, No. S2011010000910

摘要/Abstract

摘要：

背景：椎间盘髓核细胞分离培养困难，老化较快，迫切需要一种标准细胞株用于实验研究。
目的：探讨人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体的构建及其转染正常髓核细胞构建永生化细胞的可行性研究。
方法：通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核表达质粒的构建、转染人端粒酶反转录酶表达检测等步骤进行实验。
结果与结论：构建出人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体，成功转染正常髓核细胞并在细胞中稳定表达。结果表明运用人端粒酶反转录酶转染椎间盘髓核细胞构建永生化细胞是一种可行的方法。

关键词: 组织构建, 脊柱组织构建, 髓核细胞, 人端粒酶反转录酶基因, DH5α感受态大肠肝菌, 转染, 永生化, 目的基因, 髓核细胞转染退行性椎间盘病, 省级基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Nucleus pulposus cells are difficult to be isolated and cultured from the intervertebral disc, and the cells age rapidly. An urgent standard cell line is required for experimental research.
OBJECTIVE: To investigate the construction of recombinant green fluorescent protein plasmid expressing human telomerase reverse transcriptase and to assess the feasibility of constructing immortalized human nucleus pulposus cell line.
METHODS: Target gene cloning, target gene sequencing in eukaryotic expression plasmids, construction of eukaryotic expression plasmids expressing target genes, and transfection of human telomerase reverse transcriptase were performed in order.
RESULTS AND CONCLUSION: Nucleus pulposus cells transfected with recombinant green fluorescent protein plasmid expressing human telomerase reverse transcriptase have a stable expression. It is anticipated that human telomerase reverse transcriptase can be useful for creating the immortalized nucleus pulposus cells.

Key words: tissue construction, spinal cord tissue construction, nucleus pulposus cells, human telomerase reverse transcriptase gene, DH5&alpha, competent Escherichia coli, transfection, immortalized, target gene, nucleus pulposus cells transfection in degenerative disc diseases, provincial fund, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

吴劲风，叶冬平，戴丽冰，梁伟国. 人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体转染椎间盘正常髓核细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(2): 259-263.

Wu Jin-feng, Ye Dong-ping, Dai Li-bing, Liang Wei-guo. Recombinant green fluorescent protein plasmids expressing human telomerase reverse transcriptase transfect normal nucleus pulposus cells in the intervertebral disc[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 259-263.

图/表（结果） 4

2.1 RT-PCR 扩增目的基因人端粒酶反转录酶片段的结果 PCR 扩增完的DNA 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，证实扩增产物为1.9 kb和1.4 kb，与预期结果一致，见图1。

图1 T-PCR扩增目的基因人端粒酶反转录酶片段的结果
Figure 1 Reverse transcription-PCR analysis of the human telomerase reverse transcriptase

图2 重组克隆增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶经Bam H1酶切后结果
Figure 2 Bam H1 digestion results of the recombinant green fluorescent protein plasmid expressing human telomerase reverse transcriptase

2.2 重组克隆增强型绿色荧光蛋质粒-人端粒酶反转录酶鉴定结果重组克隆增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶反转录酶经过BamH1酶切后证实目的基因在3 kb，与预期结果一致，见图2。

2.3 转染增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶后髓核细胞人端粒酶反转录酶表达情况增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶转染细胞后经过RT-PCR证实目的产物在1.5 kb，引用RT-3和RT-4两对引物完成，内参在370 bp，与预期的一致，见图3。

图3 增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶转染细胞后，RT-PCR扩增人端粒酶反转录酶基因片段结果
Figure 3 Reverse transcription-PCR amplified fragment of human telomerase reverse transcriptase gene after transfection of normal nucleus pulposus cells with recombinant green fluorescent protein plasmid expressing human telomerase reverse transcriptase

24 h后荧光显微镜下分析报告基因绿色荧光蛋白转染效率，见图4。

图4 转染增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶后，髓核细胞人端粒酶反转录酶绿色荧光表达情况(×100)
Figure 4 Expression of green fluorescent protein following transfection with recombinant green fluorescent protein plasmid expressing human telomerase reverse transcriptase (×100)

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引言

材料方法

设计：细胞学体外组织构建实验。

时间及地点：实验于2009年8月至2011年6月在广州市创伤外科研究所完成。

材料：

实验方法：

目的基因克隆：用RNA 提取试剂盒从肝癌组织中按试剂盒说明提取总RNA，oligo(dT)为引物，以总RNA为模板，在禽源性反转录酶(M-MULV) 作用下反转录1 h，获得cDNA；然后以RT-1和RT-2、RT-3和RT-4引物，分别进行PCR反应，扩增目的基因。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定，按快速凝胶回收试剂盒说明书方法回收纯化PCR产物，获得目的基因PCR产物与载体T-Easy (T载体)按比例进行连接^[9]。

真核表达质粒中目的基因序列测定：从重组体T-人端粒酶反转录酶中提取质粒，挑选经初步鉴定的重组体，由上海生工公司采用双向测定法测序。用DNASIS 软件对所测的基因序列和氨基酸序列与GenBank 公布的序列进行同源性比较。

目的基因真核表达质粒的构建：①应用Xmn1和Xho1分别完全消化T-人端粒酶反转录酶和载体pAAV-MCS质粒DNA，1%琼脂糖凝胶电泳分离，并回收纯化目的DNA片段，然后进行连接，并转化DH5α感受态大肠肝菌，从含卡那霉素的LB平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定pAAV-人端粒酶反转录酶质粒。②应用NotⅠ完全消化pAAV-人端粒酶反转录酶质粒和绿色荧光蛋白质粒DNA，将目的基因人端粒酶反转录酶表达盒和增强型绿色荧光蛋白真核表达质粒从胶中切取，纯化回收，然后进行连接并转化DH5α感受态大肠肝菌，从含卡那霉素的LB 平板上，初选阳性克隆，并酶切鉴定，构建成绿色荧光蛋白-人端粒酶反转录酶真核表达质粒。

转染人端粒酶反转录酶表达检测^[10]：按照说明书实验步骤进行，用BIOMIGA质粒提取试剂盒提取增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶真核表达，细胞转染按试剂Lipofect-amine 2000操作说明书进行。转染增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶真核表达至髓核细胞24 h后换液，加G418(250 mg/L)的培养液进行筛选，每2 d换液1次。转染时，设置转染空载体增强型绿色荧光蛋白质粒组。①以Oligo(dT)为反转录引物，以提取的总RNA为模板，在AMV催化下特异反转录出cDNA。以人端粒酶反转录酶的RT-3和RT-4引物扩增目的基因，设定反应条件，行PCR反应。产物在1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭5 g/L)中电泳，凝胶成像系统下观察照相。②western blot，10%SDS-PAGE胶上样，电压90 V，恒压电泳120 min，电泳转移到0.45 µm的PVDF膜上；加一抗人端粒酶反转录酶(1∶500)，二抗mouse- HRP(1∶3 000)，洗膜，用ECL试剂反应显影分析。

主要观察指标：RT-PCR扩增目的基因人端粒酶反转录酶片段的结果，重组克隆增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶鉴定，转染增强型绿色荧光蛋白质粒-人端粒酶反转录酶后髓核细胞人端粒酶反转录酶表达情况，观察转染质粒的表达情况。

讨论

国外Papanikolaou等[11]将外源性人端粒酶反转录酶导入人视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞，细胞体外培养寿命延长20倍以上。人端粒酶反转录酶已成功永生化人乳腺上皮细胞、肺成纤维细胞系IMR90、新生儿成纤维细胞株(BJ)、人脐带动脉平滑肌细胞、微血管内皮细胞、卵巢上皮细胞、胚胎滋养层细胞、人肝脏细胞、神经干细胞、表皮细胞、骨髓间充质干细胞[12-20]。国内方泽强等[21]将端粒酶反转录酶转染获得的永生化软骨细胞和经诱导向软骨分化的间充质干细胞分别与β-磷酸三钙复合后在裸鼠体内成功地构建了工程化的软骨组织，表明应用转染人端粒酶反转录酶的永生化软骨细胞和间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞构建工程化软骨具有可行性。

目前，美国Clontech与Geron公司转染人端粒酶反转录酶至人视网膜色素上皮细胞，合作推出第1种商品化的永生化正常细胞系人端粒酶反转录酶RPE1，其较正常细胞增殖快，平均每周达5-6 PDs。同时，该细胞系近于汇合时S期细胞比例是转染前的两倍。目前其传代多于150代，其中有3个克隆多于300代[22-24]。

Zongaro等[25]报道通过腺病毒转染SV40基因的方法成功构建了永生化的人髓核细胞株，细胞培养超过5个月，传20代以上，形态学和功能特性仍保持不变，且无致瘤性，可作为组织工程椎间盘的种子细胞。但病毒、癌基因、原癌基因等主要通过抑制M1期机制，细胞绕过M1期继续生长。细胞经过20-30群体倍增次数后，进入危机期(crisis，M2期)，细胞出现退化凋亡，并非永生化人端粒酶反转录酶介导的永生化细胞是正常细胞，并非转化细胞[26]。它们具有正常生长率、核型，呈现接触抑制和锚着依赖性，不具有致癌性和软琼脂克隆形成能力等。且TERT介导的永生化细胞已通过了M1期和M2期，同生殖干细胞一样，是真正意义上的永生化[27-28]。因此实验将pIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶反转录酶重组质粒转染髓核细胞，通过荧光显微镜动态检测转染髓核细胞的pIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶反转录酶表达，建立一种能够长期培养，表型稳定的永生化髓核细胞株，提供标准髓核细胞，对组织工程学研究将带来深远的影响。

人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体转染椎间盘正常髓核细胞

Recombinant green fluorescent protein plasmids expressing human telomerase reverse transcriptase transfect normal nucleus pulposus cells in the intervertebral disc

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