2  结果  Results

2.1  流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原  第3代骨髓间充质干细胞培养24 h后呈梭形生长，见图1。流式细胞仪检测结果显示：第3代细胞表达CD29、CD44、CD90，阳性率分别为95.17%，97.93%和99.91%，而CD34阳性率为1.42%，说明上述梭形细胞基本为骨髓间充质干细胞，且均一性良好，见图2。

2.2  慢病毒转染后骨髓间充质干细胞形态  转染慢病毒后第3天，倒置光学显微镜下骨髓间充质干细胞呈贴壁生长，分布良好，形态为长梭形、三角形等，细胞排列成辐射状，见图3。

2.3  流式细胞仪检测沉默P75^NTR联合NGF双基因共转染慢病毒载体的转染效率  设定MOI=80时，荧光显微镜下可见大量红绿混合荧光转染区，其中红色荧光为沉默p75^NTR，绿色荧光为NGF过表达，见图4，流式细胞仪检测双基因慢病毒载体的转染效率已超过70%，见图5。

2.4  Western blot检测P75^NTR与NGF蛋白表达水平  感染慢病毒后的第3天，Western blot方法检测P75^NTR和NGF的表达，结果发现沉默P75^NTR联合NGF过表达组相比空白对照组和阴性对照组P75^NTR显示出更弱条带，而NGF显示出强阳性条带，见图6。采用Image J灰度分析软件分析沉默P75^NTR联合NGF过表达组P75^NTR蛋白表达明显下调，沉默率为90.1%，NGF蛋白表达明显增加，见图7。

2.5  MTT法检测各组骨髓间充质干细胞的增殖情况  从图8可以看出，各组吸光度值均随着培养时间的延长而增加。与空白对照组与阴性对照组相比，沉默P75^NTR联合NGF过表达组、沉默P75^NTR组、NGF过表达组细胞增殖明显加快，差异有显著性意义(P < 0.05)。与沉默P75^NTR联合NGF过表达组相比，沉默P75^NTR组、NGF过表达组增殖较慢，差异也有显著性意义(P < 0.05)。

2.6  CCK-8法检测各组骨髓间充质干细胞的增殖情况  从图9可以看出，各组吸光度值在前2 d差异无显著性意义(P > 0.05)；第3-6天，沉默P75^NTR联合NGF过表达组、沉默P75^NTR组、NGF过表达组吸光度值明显高于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)；与沉默P75^NTR联合NGF过表达组相比，沉默P75^NTR组、NGF过表达组增殖能力相对较弱，差异有显著性意义(P < 0.05)。

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养因子中最早被发现的生长因子^[1]。它有2种受体，分别是络氨酸蛋白激酶受体(Trks)和P75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor，P75^NTR)。NGF与Trks结合促进神经细胞的生长，与P75^NTR结合启动凋亡通路，引起细胞的凋亡。P75^NTR是第1个被发现的神经营养因子受体^[2]，最初被认为是NGF的低亲和力受体。

骨折不愈合是骨科治疗的难点。骨折部位的血液供应减少和纤维蛋白的持续沉积可导致骨折不愈合。细胞因子及其受体在骨髓间充质干细胞分化过程中起到了至关重要的作用^[3-4]。研究表明P75^NTR表达升高抑制血管再生和纤维蛋白降解，而过量的NGF关闭这一通道，挽救受损的细   胞^[5]。结合国内外多项研究，P75^NTR参与多种细胞的增殖、凋亡及分化等生物功能，而在骨折不愈合研究中却鲜见报道^[6-11]。课题组前期研究表明NGF促进骨折愈合^[12-13]，在骨折不愈合组织中P75^NTR的表达明显增高^[14]。因此假设沉默P75^NTR并联合NGF过表达促进骨髓间充质干细胞增殖及其分化能治疗骨折不愈合。该实验拟将携带沉默P75^NTR和NGF过表达的慢病毒载体转染SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，检测转染后骨髓间充质干细胞的增殖情况，为进一步用基因修饰组织工程骨奠定实验基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods

1.1  设计  细胞观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年6至12月在桂林医学院临桂科学实验中心完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  三四周龄SPF级SD大鼠3只，体质量30-40 g，雌雄不限，由桂林医学院动物中心提供。

1.3.2  慢病毒载体、试剂与仪器  P75^NTR慢病毒载体的构建和鉴定由苏州吉玛基因公司完成(批号：190823DZ)；NGF过表达慢病毒载体的构建和鉴定由上海吉凯基因公司完成(批号：GXDL0169563)；胎牛血清、胰蛋白酶、L-DMEM完全培养基(美国Gibco公司)；酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)；Percoll分离液、一抗稀释液、二抗稀释液、增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒、CCK-8试剂盒(碧云天公司)；GAPDH、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(中山金桥)；兔抗P75^NTR、NGF单克隆抗体(Abcam公司)；Loding Buffer、彩虹Marker(赛默飞世尔科技)；超敏发光液(Bridgen公司)；噻唑蓝(Sigma公司)；二甲基亚砜(武汉博士德)；气套式CO₂培养箱、冷冻高速离心机(美国Thermo公司)；普通光学显微镜(德国蔡司公司)；倒置荧光光学显微镜(日本奥林巴斯)；滤光片型酶标仪、光栅型连续波长酶标仪(瑞士Tecan公司)；凝胶成像分析系统、垂直电泳-转膜系统(美国Bio-Rad)；流式细胞仪(B&D公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  大鼠原代骨髓间充质干细胞分离提取培养及鉴定  SD大鼠腹腔注射6 mL 10%水合氯醛致死后浸泡于体积分数为75%乙醇中15 min，在无菌条件下解剖出大鼠双侧股骨并且剔除附着的软组织，置于含DMEM/F12完全培养基的培养皿中，用5 mL注射器吹打出股骨骨髓，将含骨髓的培养基离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清，将沉淀用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基常规培养，巴氏吸管反复吹打收集到的骨髓混悬液，接种于细胞培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中进行培养，间隔3 d换液1次。待细胞融合至80%-90%后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，并按1∶2比例进行传代培养至第3代。

1.4.2  慢病毒共转染骨髓间充质干细胞  将第3代骨髓间充质干细胞分为空白对照组、阴性对照组、沉默p75^NTR组、NGF过表达组、沉默p75^NTR联合NGF过表达组，每组均设置5个复孔。空白对照组为常规培养，不加任何干预措施；阴性对照组为空载慢病毒转染骨髓间充质干细胞；沉默P75^NTR组为慢病毒介导沉默P75^NTR转染骨髓间充质干细胞；NGF过表达组为慢病毒介导过表达NGF转染骨髓间充质干细胞；沉默p75^NTR联合NGF过表达组为慢病毒介导沉默p75^NTR联合过表达NGF共转染骨髓间充质干细胞(沉默p75^NTR慢病毒载体maker为红色荧光；NGF过表达慢病毒载体maker为绿色荧光)。

细胞转染：转染前1 d待其融合至80%-90%时，EDTA胰酶消化，重悬细胞，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液稀释至细胞浓度为5×10³ L^-1，接种至6孔板(每孔细胞培养液2.0 mL)，转染当天取出种板培养的细胞，吸尽培养液，每孔加入1 mL常规培养液，2 μL Lv-p75^NTR/Lv-NGF(MOI=80)感染细胞，用无胎牛血清的DMEM/F12配置感染体系，加到对应的板孔中，8 h全量换液更换含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12，常规培养细胞。

1.5 主要观察指标

1.5.1  流式细胞仪检测细胞表面抗原  取第3代骨髓间充质干细胞，消化，清洗，计数4.5×10⁷，离心分装入４支离心管内，各100 μL，各管分别加入CD29、CD34、CD44、CD90抗体，避光孵育30 min，加入PBS清洗，离心，弃上清，用PBS重悬细胞，置入流式细胞仪检测。

1.5.2  倒置光学显微镜观察转染慢病毒后的细胞形态  感染慢病毒后第3天，观察第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞形态变化。

1.5.3  流式细胞仪检测沉默P75^NTR联合NGF双基因共转染慢病毒载体的转染效率  感染慢病毒后第3天，倒置荧光显微镜下观察红绿荧光蛋白表达情况，流式细胞仪检测双基因慢病毒载体的转染效率。

1.5.4  Western blot检测P75^NTR、NGF蛋白的表达  感染慢病毒后的第3天，Western blot检测P75^NTR、NGF的蛋白表达。①提取各组蛋白样品：BCA法测定蛋白浓度，配置10%丙烯酰胺凝胶；②上样：各组蛋白每孔等质量(10 μg)上样；③电泳与转膜：电泳液中电泳(电泳参数：80 V，    40 min；120 V，60 min)，转膜至PVDF膜(P75^NTR转膜参数：恒流200 A，90 min；NGF和内参GAPDH转膜参数：恒流200 A，60 min)；④封闭：将转好的PVDF膜置于5%牛奶中慢摇封闭(50 r/min，2 h)；⑤孵育抗体：将封闭好的PVDF膜置于各自的一抗工作液中(用一抗稀释液稀释，稀释比例均为1∶1 000)，在摇床摇匀，4 ℃层析柜孵育过夜；第2天取出过夜的PVDF膜，在3次洗膜后分别置于各自二抗中(P75^NTR∶5%牛奶=1∶8 000；NGF、GAPDH∶5%牛奶=1∶5 000)室温孵育1 h；⑥发光：洗膜3次后加入发光工作液(工作液A∶工作液B=1∶1)，在凝胶成像仪中显像；⑦分析条带：保存图像，用Image J灰度分析软件分析各组P75^NTR及NGF蛋白表达量(条带灰度值)与内参(GAPDH)蛋白表达量，以此来计算P75^NTR和NGF蛋白相对表达水平(目的蛋白表达相对值=目的条带灰度值/GAPDH灰度值)。

1.5.5  MTT法检测各组骨髓间充质干细胞的增殖情况  感染慢病毒后的第1-8天，将各组骨髓间充质干细胞接种于96孔板中，每组3个复孔，接种密度为0.5×10⁴/孔，接种后用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基进行培养，置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养至细胞贴壁，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，继续培养4 h后吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜溶液振荡10 min，使用酶联免疫仪检测490 nm波长处的吸光度值。实验重复3次。

1.5.6  CCK-8法检测各组骨髓间充质干细胞的增殖情况  感染慢病毒后的第1-6天，将各组骨髓间充质干细胞接种于96孔板中，每组4个复孔，接种密度为0.5×10⁴/孔，边缘孔加入PBS，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养至细胞贴壁即可(一般24-36 h)，每孔分别加入10 μL CCK-8溶液，左右上下混匀培养板，培养箱中孵育2 h，使用酶联免疫检测仪测定450 nm处的吸光度值。实验重复3次。

1.6  统计学分析  采用SPSS 20.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析和t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

近年来，利用种子细胞、生物支架、生长因子来促进骨组织再生、修复缺损处骨形态和功能，其中外源性生长因子制备困难、持续时间不够，一系列副反应限制了它的应用^[15]。通过将编码生长因子的相关基因转染至靶细胞的细胞基因修饰技术得到了广泛研究^[16]。骨髓间充质干细胞在骨组织再生修复中扮演了重要角色，是用于骨缺损修复的良好种子细胞，但是其在骨髓中含量很低，占骨髓单核细胞的0.0001%-0.01%^[17]。

在骨组织工程中利用细胞因子修复骨缺损调控骨髓间充质干细胞的增殖成为一个重要问题。p75^NTR属于一种Ⅰ型糖蛋白，在多种正常与非正常组织、细胞中均有表达^[18-19]。p75^NTR通过不同的传导途径对组织细胞发挥着多重复杂的生物效应，对细胞的增殖、分化等功能既具有“正向”的信号作用相，又具有“负性”信号作用相^[20]。然而，对于P75^NTR在骨缺损领域的作用却鲜有报道。另外，NGF在神经新生领域发挥重要作用^[21-23]，使得其在修复骨折不愈合方面很有前景。课题组前期发现P75^NTR在骨缺损处明显高表达^[14]，最近的研究显示P75^NTR也是骨折不愈合形成的关键因素之一^[24]。该研究以此为基础，体外分离提取、鉴定、培养及传代大鼠骨髓间充质干细胞，通过慢病毒转染骨髓间充质干细胞，分别构建沉默P75^NTR细胞模型、NGF过表达细胞模型以及沉默P75^NTR联合NGF过表达细胞模型，连续各个时间点对各组细胞分别用MTT法和CCK-8法检测其增殖能力，旨在观察沉默P75^NTR联合NGF过表达对骨髓间充质干细胞增殖的影响。

实验结果初步阐明了沉默P75^NTR联合NGF过表达组细胞相比于对照组增殖明显加快，而单基因转染组(沉默P75^NTR、NGF过表达)细胞虽较对照组增殖较快，可相比于双基因转染(沉默P75^NTR联合NGF过表达)仍然显示出增殖活性不足。值得注意的是，沉默P75^NTR联合NGF过表达促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖仅仅是体外的细胞观察实验，而体内骨髓间充质干细胞的增殖是一个多重因素参与的过程。结合以往P75^NTR在多种细胞中发挥多重作用的研究，对于沉默P75^NTR联合NGF过表达促进骨髓间充质干细胞增殖的作用，作者做以下简要猜想。

目前有关p75^NTR引起的信号通路主要包括神经酰胺通路、JNK-p53-Bax凋亡通路及NF-κB通路。在神经酰胺通路中，沉默p75^NTR后使得位于浆膜内表面的神经鞘磷脂、神经鞘磷脂酶不能被激活，从而不能生成足够的神经酰胺，进而阻断JNK通路引起的骨髓间充质干细胞凋亡，细胞增殖与凋亡的微环境失衡使骨髓间充质干细胞显示出较强的增殖活性；此外，在下调NGF表达后发现P75^NTR在不需要配体的情况下也能激活JNK-P53-Bax这一凋亡通路，参与细胞的凋亡^[25]。由此看出，p75^NTR诱导细胞凋亡过程中NGF起着一定作用，即NGF水平高低直接与细胞是否发生凋亡有密切的联系，实验中NGF过表达转染骨髓间充质干细胞后发挥促增殖效应，可能的原因是NGF过表达可以拮抗P75^NTR与JNK-P53-Bax凋亡通路下游配体的生物化学反应。另一方面，沉默P75^NTR联合NGF过表达启动NF-κB生存通路，促进骨髓间充质干细胞增殖，在此通路中NGF可以通过p75^NTR与细胞内近端的TRAF6蛋白结合启动IKK (IkB kinases)和ERK降解，激活了NF-κB信号通路。研究表明，pro-NGF(NGF的前体)通过和P75^NTR结合可以诱导细胞凋亡^[26]。该实验中NGF过表达促进骨髓间充质干细胞增殖，可能是存在竞争性抑制的结果，即pro-NGF与NGF竞争性结合P75^NTR引起不同效应。当NGF过表达时，NGF与P75^NTR结合占优势，从而使骨髓间充质干细胞增殖，此外由于在NF-κB通路中P75^NTR和TrkA有共同的作用，TrkA与She相结合也能启动IKK和ERK通路激活NF-κB通路^[27]，下调P75^NTR后TrkA可能由于代偿性作用直接与NGF存在联系，促进骨髓间充干细胞的增殖。这一猜想还有待于进一步实验验证，随着这一机制的进一步研究与完善，将为骨组织工程修复骨缺损疗效提供重要依据，P75^NTR复杂的信号通路决定了p75^NTR在细胞中具有独特而重要的生物学效应，NGF在成骨过程中具有重要作用^[28-32]，但却在骨折不愈合处表达量极少，是否可以通过沉默P75^NTR并联合NGF过表达转染骨髓间充质干细胞移植入骨折不愈合断端，提高NGF水平，关闭P75^NTR凋亡通道，从而修复骨折不愈合，这为临床基因移植治疗骨折不愈合提供了新思路。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

P75神经营养因子受体(P75 Neurotrophin receptor，P75^NTR)：属于一种Ⅰ型糖蛋白，在非神经系统组织及多种肿瘤细胞中表达。p75^NTR与Trk受体通过不同的信号传递对细胞增殖与凋亡发挥着双重的生物效应。

神经生长因子：在神经生长因子信号通路中，p75^NTR可以与神经生长因子相结合，引起神经酰胺的释放而激活JNK通路来调节细胞的增殖和凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

目前有关p75^NTR引起的信号通路主要包括神经酰胺通路、JNK-p53-Bax凋亡通路及NF-κB通路，P75^NTR具有介导促进增殖分化调节信号以及介导凋亡信号通路的双相作用，其传导信号类型主要取决于其结合的配体，研究发现P75^NTR在骨折不愈合处存在高表达，而过量的NGF可关闭P75^NTR受体。该研究探讨沉默P75^NTR联合NGF过表达共转染对骨髓间充质干细胞增殖的影响，为进一步治疗骨折不愈合提供实验前期准备。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程