破骨细胞形成过程中唑来膦酸的作用途径及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1720

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2716-2721.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1720

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

破骨细胞形成过程中唑来膦酸的作用途径及机制

黄晓林¹，廖健¹，洪伟²，李芳¹，程余婷¹，周倩¹，董强¹

¹贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004；²贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州省贵阳市 550004

修回日期:2019-02-11 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
通讯作者: 廖健，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:黄晓林，女，1992年生，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事口腔修复与种植学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81660179)，项目负责人：廖健；贵州省科学技术基金([2016]1124)，项目负责人：廖健；贵州省科学技术基金([2014]2026)，项目负责人：廖健

Zoledronic acid in osteoclastogenesis: roles and mechanisms

Huang Xiaolin¹, Liao Jian¹, Hong Wei², Li Fang¹, Cheng Yuting¹, Zhou Qian¹, Dong Qiang¹

¹School/Hospital of Stomatology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ²Key Laboratory of Molecular Biology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Revised:2019-02-11 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
Contact: Liao Jian, MD, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, School/Hospital of Stomatology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Huang Xiaolin, Master candidate, School/Hospital of Stomatology of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of China, No. 81660179 (to LJ); the Science and Technology Foundation of Guizhou Province, No. [2016]1124 (to LJ); the Science and Technology Foundation of Guizhou Province, No. [2014]2026 (to LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
破骨细胞诱导：破骨细胞是一种特殊的终末分化细胞，它可由单核前体细胞通过多种方式融合形成巨大的多核细胞。破骨细胞分离培养方法始于20世纪80年代，主要包括骨髓机械分离法、骨髓细胞诱导法、脾干细胞诱导法、血液单核细胞诱导法、小鼠RAW264.7细胞系诱导法及骨巨细胞瘤分离法。
破骨细胞肌动蛋白结构：破骨细胞肌动蛋白骨架的基本结构是伪足小体。破骨细胞分化过程要经历几个不同的阶段，它在各个阶段呈现不同的形态结构。伪足小体的形成过程及结构完整性将直接影响破骨细胞的分化及其骨吸收功能。

摘要
背景：唑来膦酸可用来治疗骨吸收疾病，但其确切机制不明确。
目的：探讨唑来膦酸对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响和机制。
方法：通过CCK8实验检测小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞的活力，分析最大半数抑制浓度(IC50)。体外用RANKL将RAW264.7细胞诱导为破骨细胞，鬼笔环肽和DAPI染色进行鉴定，并经抗酒石酸酸性磷酸酶染色来评估唑来膦酸在破骨细胞分化不同阶段对破骨细胞形成的影响，骨吸收实验检测破骨细胞骨吸收活性，最后Western blot检测IκBα、P38、JNK及ERK蛋白的表达。
结果与结论：①唑来膦酸作用48 h，对RAW264.7细胞的最大半数抑制浓度(IC₅₀)为33.9 μmol/L，相比对照组，低于该浓度的唑来膦酸抑制破骨细胞分化；②唑来膦酸处理后骨吸收陷窝数目和面积明显减少(P < 0.05)；③蛋白表达水平上，唑来膦酸抑制RANKL诱导的IκBα磷酸化，其他蛋白磷酸化未见明显改变；④结果表明，唑来膦酸在体外可能通过调节NF-κB信号通路来抑制破骨细胞形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2417-6786(黄晓林)

关键词: 破骨细胞, 唑来膦酸, 破骨细胞骨吸收, 破骨细胞分化, 核因子κB信号通路, 核因子κB受体活化因子配体, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Zoledronic acid has been applied to treat bone resorption, but the exact mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects and mechanisms of zoledronic acid on RANKL-induced osteoclastogenesis.
METHODS: The viability of mouse monocyte/macrophage cell line RAW264.7 was measured using cell counting kit-8 assay and then we analyzed the half maximal inhibitory concentration (IC₅₀). RAW264.7 cells were induced by RANKL to differentiate into osteoclasts. The induced cells were identified by rhodamine-conjugated phalloidin and 4,6-diamino-2-phenyl indole. The stage-specific effects of zoledronic acid during osteoclastogenesis were further assessed using tartrate resistant acid phosphatase staining. Bone resorption was examined using pit formation assay. Western blot was finally used to detect the expression of IκBα, P38, JNK, and ERK at protein levels.
RESULTS AND CONCLUSION: The IC₅₀ of zoledronic acid in Raw264.7 cells was 33.9 μmol/L at 48 hours, and zoledronic acid at a concentration of less than IC₅₀ suppressed the formation of osteoclasts. In addition, the number of bone resorption pits and bone resorption area were also decreased after treatment with zoledronic acid as compared with the control group. Zoledronic acid inhibited RANKL-induced IκBα phosphorylation at the protein level. To conclude, zoledronic acid can suppress osteoclastogenesis via the regulation of the nuclear factor-κB signaling pathway.

Key words: osteoclasts, zoledronic acid, bone resorption of osteoclasts, osteoclast differentiation, nuclear factor-κB signaling pathway, receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

黄晓林，廖健，洪伟，李芳，程余婷，周倩，董强. 破骨细胞形成过程中唑来膦酸的作用途径及机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2716-2721.

Huang Xiaolin, Liao Jian, Hong Wei, Li Fang, Cheng Yuting, Zhou Qian, Dong Qiang. Zoledronic acid in osteoclastogenesis: roles and mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2716-2721.

图/表（结果） 3

2.1 唑来膦酸对RAW264.7细胞活力的影响 与未经药物处理的细胞相比，唑来膦酸浓度达到30 μmol/L时，细胞的生长被抑制(P < 0.05)。通过数据分析发现唑来膦酸作用48 h对该细胞的IC₅₀为33.9 μmol/L，见图1。

2.2 破骨细胞形成过程 RAW264.7细胞呈聚集生长趋势，体积小，未见多核细胞。在RANKL刺激下，细胞体积增大，成圆形、椭圆形或不规则形状，内含许多空泡样结构，并伸出许多细长的伪足样突起，图2A。罗丹明标记的鬼笔环肽为F-肌动蛋白探针，可选择性标记由F-肌动蛋白组成的肌动蛋白环而呈环形结构。诱导第3天已明显出现多个单核细胞开始融合，肌动蛋白的环形结构清晰可见，第5天达到高峰，环结构变圆变大，单个破骨细胞内可见七八十个细胞核，第7天细胞核开始碎裂，肌动蛋白的环结构也崩解，破骨细胞开始出现凋亡和裂解，见图2B。

2.3 唑来膦酸抑制RANKL诱导的破骨细胞形成 观察低于IC₅₀浓度的唑来膦酸对RANKL诱导破骨细胞形成的影响。抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，RANKL诱导组可见较多体积大的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞，无论从开始诱导培养至破骨细胞形成前阶段(阶段1)，还是从开始诱导培养至成熟破骨细胞完全形成阶段(阶段1+2)，唑来膦酸处理都可使破骨细胞分化功能几乎被终止。阶段1中破骨细胞数目和面积分别为(23.3±2.1)个/孔、(12.7±0.9)%，阶段1+2中破骨细胞数目和面积分别为(14.3±1.2)个/孔、(9.3± 1.3)%，明显少于对照组[(122.0±2.9)个/孔、(70.8±1.8)%]。破骨细胞开始形成后(阶段2)给予唑来膦酸仍然可见破骨细胞形成，但破骨细胞数目和面积分别为(71.3±2.5)个/孔、(42.0±2.2)%，较对照组分别下降了41.6%，40.7%，见图3。综上所述，唑来膦酸可以显著抑制破骨细胞的形成。

2.4 唑来膦酸对破骨细胞骨吸收的影响 上述结果显示唑来膦酸可以明显影响破骨细胞分化，随后通过骨吸收陷窝实验探索破骨细胞骨吸收功能是否也被抑制。结果显示在RANKL组中大量骨吸收陷窝出现在骨磨片表面，吸收陷窝面积较大，陷窝数目较多，形态上表现为不规则形、大小不一；1 μmol/L唑来膦酸处理后，骨吸收陷窝数目和面积都明显减少，见图4。以上结果表明唑来膦酸可显著抑制破骨细胞骨吸收功能。

2.5 唑来膦酸对NF-κB、ERK、JNK、p38信号通路的影响 上述实验证实唑来膦酸明显抑制破骨细胞形成和骨吸收功能后，进一步检测与破骨细胞分化密切相关的信号通路。结果显示RANKL刺激5 min后，IκBα、JNK、ERK和P38磷酸化水平明显增加；20 min后唑来膦酸开始抑制RANKL诱导的IκBα磷酸化水平，促进非磷酸化蛋白表达，而ERK、P38和JNK未被明显影响，见图5。这些结果表明唑来膦酸可能通过抑制RANKL诱导的NF-κB信号通路的活化，从而抑制RANK诱导的破骨细胞分化和骨吸收功能。

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引言

成骨细胞和破骨细胞之间不平衡可发生以低骨矿物密度和不正常骨质及骨结构为特征的骨质疏松症^[1-3]，现日益成为人们关注的医疗热点^[4]。破骨细胞是源于单核巨噬细胞的造血干细胞，在骨质疏松发展进程中起重大作用。RANKL是肿瘤坏死因子超家族成员之一，近年来越来越多证据显示来源于骨细胞、成骨细胞及间充质干细胞的RANKL在破骨细胞过度活化导致的骨破坏中发挥着重要的作用^[5-7]。RANKL通过作用于其受体，即破骨细胞前体细胞膜表面的核因子κB受体活化因子(RANK)，将刺激信号传递给NF-κB信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。这些信号通路的激活是破骨细胞分化相关基因如转录因子活化T细胞核因子(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(CTSK)等调控所必需的，它们可上调这一系列破骨细胞相关的基因表达，促使细胞分化并形成具有骨吸收功能的成熟破骨细胞，RANKL信号的过表达可导致破骨细胞形成增多和过度活化，最终导致骨吸收活动增强^[8]。因此，抑制RANKL信号通路可能是治疗包括骨质疏松在内的骨吸收疾病的有效策略。双膦酸盐是目前最常见的治疗骨质疏松的有效药物^[1]，唑来膦酸则是含氮双膦酸盐的第三代产品，在双膦酸盐类药物中抑制骨吸收能力最强^[9-10]，成为近期研究的热点^[11-12]。唑来膦酸的咪唑侧链上所含的2个氮原子，与骨质中的羟磷灰石有很高的亲和力，可以优先被转运到骨质破坏处，占据骨小梁的表面，干扰破骨细胞在骨面的附着，并改变破骨细胞超微结构，缩短细胞程序性凋亡的时间间隔，从而干扰破骨细胞功能并诱导其凋亡^[13-15]。然而，唑来膦酸对破骨细胞的具体调节机制尚存在争论^[16]。实验拟检测唑来膦酸对RANKL诱导破骨细胞分化过程和骨吸收功能的影响，并从分子水平对唑来膦酸的作用机制进行初探。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞形态学观察实验。

1.2 时间及地点 于2017年1月至2018年9月在贵州医科大学分子生物实验室完成。

1.3 材料 小鼠RAW264.7细胞株(美国ATCC公司)；胎牛血清(美国Sciencell公司)；α-MEM培养基、0.25%胰酶、青链霉素混合剂(美国Hyclone公司)；罗丹明标记鬼笔环肽、DAPI染色液、膜再生液、二甲基亚砜(北京Solarbio公司)；唑来膦酸(美国Sigma公司)；RANKL(美国R&D公司)；CCK8试剂盒(日本同仁)；所有一抗(美国CST)；HRP Goat anti-Rabbit IgG(武汉普美克)；骨磨片(上海路深生物有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 IC₅₀评估和细胞活性实验 RAW264.7细胞以每孔3×10³个接种至96孔板，培养24 h后换为含不同浓度唑来膦酸(0，0.1，1，10，30，50 μmol/L)的α-MEM完全培养基。药物处理48 h后，每孔加入CCK8试剂，37 ℃避光孵育2 h后，测定450 nm下吸光度值，用Graphpad prim 7.0制作细胞生长曲线并分析唑来膦酸在48 h的半数最大抑制浓度。

1.4.2 破骨细胞形成实验 RAW264.7细胞以每孔1.5×10³个接种于96孔板。实验分为空白对照组(加ddH₂O)和RANKL诱导组，根据分组孔内加入含或不含100 μg/L RANKL的完全培养基，细胞每2 d换液，第5天在光镜下观察两组的形态和数目差异。

1.4.3 细胞骨架纤维性肌动蛋白荧光染色和细胞核DAPI染色 RAW264.7细胞在含100 μg/L RANKL的完全培养基中分别培养1，3，5，7 d，用37 ℃预热的PBS洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS清洗两三次，每次10 min，室温下用0.5% Triton X-100溶液透化处理5 min，PBS清洗细胞两三次，每次10 min，100 nmol/L TRITC Phalloidin罗丹明标记鬼笔环肽工作液室温避光孵育细胞30 min，PBS清洗细胞3次，每次5 min，100 nmol/L DAPI溶液对细胞核进行复染30 s，PBS清洗后滴入封固剂封固，激光共聚焦显微镜下进行荧光观察，在蓝色和红色通道取图分析。

1.4.4 抗酒石酸酸性磷酸酶染色 RAW264.7细胞在含100 μg/L RANKL的完全培养基中培养，分别在以下几个阶段给予15 μmol/L唑来膦酸刺激细胞，阶段1：第0-2天；阶段2：第3-4天；阶段1+2：第0-4天。细胞用PBS洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍，抗酒石酸酸性磷酸酶染色液37 ℃避光孵育1-4 h(每隔半小时倒置相差显微镜下观察1次，直到阳性细胞染成紫红色，具体操作按照说明书要求)，光学显微镜100倍镜下随机选取5个视野，计数抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞数目(胞核≥3个)，每组3个复孔。

1.4.5 骨吸收陷窝实验 RAW264.7细胞以每孔1.5×10³个的密度接种至含骨片的96孔板。实验共分为3组，即空白对照组(加ddH₂O)、RANKL诱导组(加100 μg/L RANKL)和唑来膦酸组(加1 μmol/L唑来膦酸预处理1 h后加入100 μg/L RANKL)，根据分组孔内加入含或不含100 μg/L RANKL和1 μmol/L唑来膦酸的完全培养基，直至成熟破骨细胞形成，通过机械震荡和超声作用去除黏附在骨片上的细胞，骨片镀金，扫描电镜(HIT ACHI E-1010)下观察。在200倍镜下随机选取6个视野，用图像分析软件ImageJ分析各个视野的平均吸收陷窝数目及骨吸收区域总面积的百分比。

1.4.6 Western blot实验 RAW264.7细胞以每孔2×10⁶个的密度接种在6孔板，饥饿处理4 h后用15 μmol/L唑来膦酸预处理1 h，然后分别用100 μg/L RANKL刺激0，5，10，20，30，60 min，预冷的PBS洗2遍，每孔加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液300 μL，冰上裂解1 h，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，收集上清，提取细胞总蛋白。BCA试剂测定蛋白浓度，剩余的加入5×上样缓冲液，100 ℃沸水中煮蛋白10 min使其变性，凝胶电泳并转膜，5%牛奶室温封闭2 h，兔抗鼠一抗(P38、p-P38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα)4 ℃孵育过夜，以GAPDH作内参，羊抗兔二抗室温孵育1 h，洗膜并显影后用凝胶图像处理系统分析图像，ImageJ分析软件检测每个条带的灰度值。

1.5 主要观察指标 ①前体RAW264.7细胞和破骨细胞形态以及唑来膦酸作用后破骨细胞的形态变化；②RAW264.7细胞活力；③唑来膦酸对骨吸收的影响；④唑来膦酸作用对P38、p-P38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα表达的影响。

1.6 统计学分析 数据用x(_)±s表示，应用GraphPad Prism 6.0统计学软件对数据进行统计分析，组间总体比较采用方差分析(One Way ANOVA和Two Way ANOVA)，组间两两比较采用Dunnett-t 和Bronferroni-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

正常成人在生理状态下，通过破骨细胞的骨质再吸收和成骨细胞骨再生相互协调，保持骨质的不断更新^[17]。成骨破骨之间的不平衡除了导致骨质疏松，还可引起类风湿性关节炎和骨癌等骨质疾病^[18-20]。这些疾病对人类健康威胁极大，并且妨碍一些修复治疗活动的进行。

如今，破骨细胞的体内分离和纯化仍然很困难^[21]，实验选择的RAW264.7细胞是目前公认的破骨细胞前体细胞，可以稳定分化为破骨细胞^[16^，^22]。经RANKL刺激，成功诱导出破骨样细胞，其抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性，多核，且能正确形成肌动蛋白环结构，具有破骨细胞一般特征。作者首先通过CCK8实验确定了唑来膦酸的IC₅₀，因此选择对前体细胞无毒性的浓度排除了唑来膦酸调控RAW264.7细胞增殖生长的影响。目前的研究主要集中在唑来膦酸抑制破骨细胞分化的作用特点与药物浓度的关系，而此次实验通过设置时间梯度，探讨了它在破骨细胞形成不同阶段的作用特点。结果发现唑来膦酸对不同阶段的破骨细胞形成都有抑制作用，使破骨细胞数目和面积都明显减少，但在破骨细胞分化早期表现最明显。值得注意的是，破骨细胞开始形成后，在唑来膦酸的刺激下其数目和面积减少，差异有显著性意义，这很可能是唑来膦酸对破骨细胞的凋亡有诱导作用；接下来进一步确定唑来膦酸对破骨细胞功能方面的影响，证实实验诱导的细胞是具有骨吸收能力的成熟破骨细胞，并发现破骨细胞的蚀骨能力明显因唑来膦酸的作用而下降。高军等^[23-24]此前也阐述过唑来膦酸这一方面的作用，表明它可通过诱导破骨细胞凋亡来抑制矿化骨和软骨的骨吸收，从而用于治疗高钙血症、癌症骨转移等。

蛋白的磷酸化和脱磷酸化是细胞信号转导途径中正负调控的主要形式，象征着信号转导的强度与持续时间。通过Western blot实验，根据蛋白的磷酸化水平来分析信号转导通路的活化与抑制，结果发现在RANKL刺激下，IκBα磷酸化蛋白表达明显增加，非磷酸化蛋白表达下降，而唑来膦酸抑制该蛋白磷酸化，促进非磷酸化蛋白表达。另外，通过数据分析发现第0分钟，也就是RANKL作用前，唑来膦酸组比单独RANKL诱导组的p-IκBα表达更高，差异有显著性意义(P < 0.05)，作者猜想这很可能是因为唑来膦酸预处理RAW264.7细胞1 h，对该细胞有所激活，导致该蛋白磷酸化表达增加，随后RANKL诱导组与对照组的差异越来越小，直到第30分钟后，相比于RANKL单独作用，唑来膦酸明显抑制其磷酸化，在随后的60 min，抑制作用更加显著。由此可见，唑来膦酸可抑制IκBα的磷酸化，即抑制NF-κB信号通路。此外，NF-κB信号在破骨细胞分化早期阶段起重要作用^[25]。作者之前的数据表明，唑来膦酸明显抑制破骨细胞分化早期阶段的细胞分化，这与该实验观察到的破骨细胞形成期间唑来膦酸抑制NF-κB信号通路基本一致。因此，该实验初步揭示了唑来膦酸可能通过抑制RANKL介导的NF-κB信号通路来抑制破骨细胞分化成熟和骨吸收能力。

已经有研究证实NF-κB信号通路是破骨细胞前体细胞分化成熟过程中的关键信号通路^[26-28]，以此为靶向的特异性抑制剂对于治疗以破骨细胞过度活化为主要特性的疾病具有潜在的应用前景。Lin等^[29]通过实验表明NF-κB在巨噬细胞的募集和成熟以及一些炎症因子的产生中起着至关重要的作用，他们便提出对于人造关节损伤患者的炎症问题，可以通过抑制NF-κB活性的方式减轻磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解程度。该研究对唑来膦酸靶向抑制骨吸收疾病有一定参考作用，但也存在一些不足之处。破骨细胞通过诱导而来，最终得到的是前体细胞和破骨细胞二者的混合细胞，目前无法将二者分开纯化。因此，不能单纯直接地对破骨细胞进行唑来膦酸处理，只能探索药物对其分化过程的影响，而且破骨细胞和成骨细胞的分化过程是相辅相成，缺一不可的。该研究仅从破骨细胞形成角度来探索唑来膦酸对它的影响，尚需进一步构建成骨细胞与破骨前体细胞共培养体系，从而更好地模拟体内破骨环境，探索唑来膦酸对共培养体系中细胞分化的抑制作用。此外，目前的实验缺乏动物体内数据以及更多的反向证据来支持证实此实验结论，比如需要进一步探索NF-κB抑制剂是否对唑来膦酸抑制破骨细胞分化和骨吸收有反向效应，还需要对NF-κB的亚型如P65的核转移情况以及它的下游分子进行进一步检测。因此，唑来膦酸发挥治疗骨质疏松作用的详细机制尚未完全阐明，未来进一步的研究将有利于充分认识唑来膦酸的相关作用机制，从而为唑来膦酸大量有效地应用于临床奠定更多的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

破骨细胞形成过程中唑来膦酸的作用途径及机制

Zoledronic acid in osteoclastogenesis: roles and mechanisms

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