MiR-21可调控牙周炎破骨细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1871

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (8): 1225-1230.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1871

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MiR-21可调控牙周炎破骨细胞的增殖

许诺¹，曹蓁¹，李晓杰²，史春²

¹大连医科大学中山学院，辽宁省大连市 116000；²大连医科大学口腔医学院，辽宁省大连市 116000

收稿日期:2019-05-17 修回日期:2019-05-25 接受日期:2019-06-29 出版日期:2020-03-18 发布日期:2020-01-22
通讯作者: 史春，硕士，讲师，主治医师，大连医科大学口腔医学院，辽宁省大连市 116000
作者简介:许诺，女，1984年生，辽宁省大连市人，硕士，讲师，主治医师，主要从事口腔医学相关教学与研究工作。共同第一作者：曹蓁，女，1985年生，辽宁省大连市人，实验师，主要从事基础医学教学工作。
基金资助:
辽宁省自然科学基金(20180550563)

MicroRNA-21 regulates proliferation and differentiation of osteoclasts in periodontitis

Xu Nuo¹, Cao Zhen¹, Li Xiaojie², Shi Chun²

¹Zhongshan College of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China; ²School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China

Received:2019-05-17 Revised:2019-05-25 Accepted:2019-06-29 Online:2020-03-18 Published:2020-01-22
Contact: Shi Chun, Master, Lecturer, Attending physician, School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China
About author:Xu Nuo, Master, Lecturer, Attending physician, Zhongshan College of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China Cao Zhen, Experimentalist, Zhongshan College of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China Xu Nuo and Cao Zhen contributed equally to this work.
Supported by:
the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 20180550563

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

微小RNA：是由内源性基因编码的核苷酸非编码RNA分子，其表达具有组织特异性、保守性和时序性的特点。

牙周炎：是一种多因素感染性和免疫性炎症性疾病。它是定植微生物与宿主免疫系统之间复杂相互作用所导致的慢性感染性疾病，其特征是不可逆的组织病理学变化，如牙周韧带破坏、骨质破坏和牙周袋加深，这些都可以导致牙齿脱落。

背景：miR-21是破骨细胞生成的调节剂和破骨细胞分化的启动子，但是其在牙周炎中的作用尚不清楚。

目的：探讨miR-21在牙周炎骨破坏中的作用。

方法：Real-time PCR法检测并分析牙周炎样本和正常牙周膜组织中miR-21的表达差异；利用脂质体转染法，以miR-21 mimics(上调miR-21)或miR-21 inhibitor(下调miR-21)转染破骨细胞，Real-time PCR法检测miR-21及骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达变化；CCK-8检测miR-21对破骨细胞的增殖作用。

结果与结论：①miR-21在牙周炎样本中表达增高；②miR-21 mimics转染到破骨细胞后，miR-21、TRAP与CTSK mRNA的表达升高；miR-21 inhibitor转染到破骨细胞后，miR-21、TRAP与CTSK mRNA的表达下降；③miR-21 mimics转染到破骨细胞后，促进破骨细胞增殖；miR-21 inhibitor转染到破骨细胞后，抑制破骨细胞增殖；④结果表明，miR-21可以促进破骨细胞的增殖，结合miR-21可以促进骨破坏标志因子的表达，说明miR-21可以作为治疗牙周炎骨破坏的重要靶点。

ORCID: 0000-0002-4258-2470(许诺)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词:

牙周炎, RAW264.7细胞, 破骨细胞, miR-21, 骨破坏标志因子, 辽宁省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: MicroRNA-21 (miR-21) is a regulator of osteoclastogenesis and a promoter of osteoclast differentiation, but its role in periodontitis remains unclear.

OBJECTIVE: To investigate whether miR-21 is involved in bone destruction in periodontitis.

METHODS: Real-time PCR was used to detect and analyze the differential expression of miR-21 in periodontitis samples. Using liposome transfection method, miR-21 mimics (up-regulating miR-21) or miR-21 inhibitor (down-regulating miR-21) was used to transfect osteoclasts. Expressions of miR-21 and bone destruction markers TRAP and CTSK were detected by real-time PCR. Cell counting kit-8 was used to detect the miR-21 effect on osteoclast proliferation.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) MiR-21 expression increased in periodontitis samples. (2) When miR-21 mimics was transfected into osteoclasts, miR-21, TRAP and CTSK mRNA expression increased; when miR-21 inhibitor was transfected into osteoclasts, miR-21, TRAP and CTSK mRNA expression decreased. (3) Transfection with miR-21 mimics promoted the proliferation of osteoclasts, while transfection with miR-21 inhibitor inhibited the proliferation of osteoclasts. To conclude, miR-21 can be used as an important target for the treatment of periodontitis.

Key words: Periodontitis, RAW264.7 cells, osteoclasts, miR-21, bone destruction marker, Natural Science Foundation of Liaoning Province

中图分类号:

许诺, 曹蓁, 李晓杰, 史春. MiR-21可调控牙周炎破骨细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1225-1230.

Xu Nuo, Cao Zhen, Li Xiaojie, Shi Chun. MicroRNA-21 regulates proliferation and differentiation of osteoclasts in periodontitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(8): 1225-1230.

图/表（结果） 6

2.1 miR-21及骨破坏标志因子TRAP与CTSK在牙周炎临床样本中的表达变化慢性牙周炎组miR-21、TRAP与CTSK mRNA表达高于正常对照组，差异有显著性意义 (P < 0.05)，见图1。结果说明miR-21、TRAP与CTSK在牙周炎样本中表达增高，通过相关性分析发现，miR-21与骨破坏标志因子TRAP及CTSK存在相关性(P < 0.05)，见图2。

2.2 TRAP验证破骨细胞诱导成功未加入诱导剂的RAW264.7细胞形状为圆形或类圆形，主要是单核细胞；在加入破骨诱导液5 d后，RAW264.7细胞形状出现不规则改变，为多核细胞，且细胞核≥3，见图3。

2.3 miR-21 mimics及miR-21 inhibitor转染破骨细胞的转染效率与对照组相比，转染miR-21 mimics后，miR-21的表达相对量明显增高，其表达量达到对照组的89.4倍，差异有显著性意义(P < 0.05)；转染miR-21 inhibitor后，miR-21的表达相对量低于对照组0.42倍，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.4 miR-21 mimics及miR-21 inhibitor转染破骨细胞对于骨破坏标志因子TRAP与CTSK表达的影响与对照组相比，转染miR-21 mimics后，骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达相对量明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)；而转染miR-21 inhibitor后，骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达相对量低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.5 miR-21对于破骨细胞增殖能力的影响与对照组相比，转染miR-21 mimics后24 h可以促进破骨细胞的增殖，差异有显著性意义(P < 0.05)；而转染miR-21 inhibitor后，可以抑制破骨细胞的增殖，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

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引言

牙周病是一种慢性细菌感染性疾病，它可引起牙槽骨结构发生破坏、牙周袋形成、牙槽骨吸收，最终导致牙松动而拔除。研究表明，破骨细胞的过度增殖会引起牙周炎骨组织的破坏，破骨细胞属于多核巨噬细胞，抗酒石酸酸性磷酸酶阳性表达。许多细胞因子参与破骨细胞生成^[1]，包括RANKL、肿瘤坏死因子α及基质金属蛋白酶9等^[2]。这些细胞因子表达于牙周韧带成纤维细胞、牙龈成纤维细胞、成骨细胞、T细胞和单核细胞等，在患病的牙龈组织中表达增高，并参与了牙周炎的发病机制^[3-4]。

微小RNA(miRNA)属于内源性非编码RNA，长度约为22个核苷酸^[5]，目前已超过1 150和1 920个miRNA在小鼠和人类中被发现^[6]。大多数miRNA的功能并未完全明确，目前已知miRNA参与细胞分化、增殖、凋亡过程^[7]。经典的miRNA产生途径是初级miRNA经2个RNaseIII酶(Drosha和Dicer)连续剪切而成为成熟miRNA^[8]。成熟miRNA还需要与Argonaute蛋白等组装形成RNA诱导沉默复合体，再作用于特异miRNA的3'UTR，从而抑制翻译过程或者直接降解mRNA。miRNA具有十分重要的调控功能，它们主要参与基因转录后水平的调控^[9]。

最近研究表明miRNA在牙周炎中起着关键作用^[10]。许多miRNAs在牙周炎牙龈中表达增高，包括let-7a，let-7f，miR-19a，miR-20a，miR-30e，miR-130a，miR-142-3p和miR-301a^[11]。还有报道指出肥胖与牙周炎的联合病变，可以显著上调与炎症及代谢相关的miRNA^[12]。牙周病的多微生物感染病原体已被证实可以增强miR-146a在ApoE缺陷实验性牙周炎小鼠模型中的表达^[13]。研究表明，过表达miR-155通过抑制相关转录因子PU.1进而阻断破骨细胞分化，而这一转录过程是破骨细胞分化的关键因素^[14]。miR-223可以调节核因子I-A和巨噬细胞集落刺激因子受体水平^[15]。尽管许多证据表明miRNA在牙周炎的发展中起到了重要的作用，但是其在牙周炎骨破坏中的作用研究较少。还有学者采用miRNA芯片检测发现破骨细胞经肿瘤坏死因子α处理后，有44个miRNA表达增高^[16]。

miRNA在骨组织代谢过程中亦发挥了重要作用^[17]。通过建立卵巢切除骨质疏松症模型发现，miR-21可以促进成骨细胞分化，抑制miR-21可减轻雌激素缺乏引起的骨质疏松症^[18-19]。还有研究发现miR-21是破骨细胞生成的调节剂和破骨细胞分化的启动子^[20-22]。然而，miR-21在牙周炎中的作用如何，鲜有报道指出。该实验以miR-21 mimics(上调miR-21)或miR-21 inhibitor(下调miR-21)转染破骨细胞，Real-time PCR法检测miR-21及骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达变化，CCK-8检测miR-21对破骨细胞的增殖作用，探讨miR-21在牙周炎骨破坏中的作用，为牙周炎的治疗提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计临床样本试验；细胞学实验。

1.2 时间及地点于2018年6至12月在大连医科大学口腔医学院完成。

1.3 材料 RAW264.7细胞(中科院上海细胞库)；DMEM培养基(Gibco公司)；Lipofectamine 2000(Life公司)；miR-21 mimics(广州锐博公司)；miR-21 inhibitor(广州锐博公司)；TransStart^® All-in-one First-Strand (全式金公司)；TransStart^® Tip Green qPCR SuperMix(全式金公司)；引物合成(TakaRa公司)；胎牛血清(Sciencell公司)；RANKL (Sigma公司)。

1.4 方法

1.4.1 临床样本收集 2018年6至12月期间在大连医科大学口腔医学院附属口腔医院就诊的慢性牙周炎患者15例及正畸拔牙患者15例，年龄21-67岁，收集炎性肉芽组织和正常牙周膜组织，所有患者均知情同意。慢性牙周炎样本纳入标准：影像学显示患牙出现明显的牙槽骨组织吸收，并伴有2个或2个以上牙齿牙周袋≥6 mm，患牙需要进行牙周手术且近1个月之内未服用抗生素或非类固醇类抗炎药^[23]。收集临床样本，采用Real-time PCR法检测miR-21及骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达变化。

1.4.2 细胞培养 RAW264.7细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，放于37 ℃培养箱中培养，细胞每一两天换液1次，待细胞长至80%左右时，采用0.25%胰酶进行消化并传代，细胞传至第3代后进行相关实验。

1.4.3 破骨细胞诱导及TRAP染色鉴定第3代稳定生长的RAW264.7细胞铺到6孔板，待细胞贴壁后，每孔加入 1 mL破骨细胞诱导液RANKL(100 μg/L)，每2 d换液1次，诱导5 d后，加入40 g/L多聚甲醛固定25 min，PBS洗3遍，加入抗酒石酸酸性磷酸酶染色液避光孵育1 h，光学显微镜下观察。

1.4.4 细胞转染利用脂质体转染法，以miR-21 mimics (上调miR-21)及scramble mimics(对照组)或miR-21 inhibitor (下调miR-21)及scramble inhibitor(对照组)转染破骨细胞。取对数生长期的破骨细胞，采用0.25%胰蛋白酶消化后 900 r/min离心5 min，弃上清，加入DMEM培养基进行重悬，以细胞浓度为1×10⁷ L^-1接种于6孔板，6 h细胞贴壁后，换无双抗、无血清的DMEM培养基培养，培养1 d开始进行转染。取40 nmol/L miR-21 mimics/inhibitor加入50 μL无双抗、无血清的DMEM培养基，轻轻混匀，室温静置5 min(A液)；5 μL Lipofectamine 2000及50 μL无双抗、无血清的DMEM培养基轻轻混匀，室温静置5 min(B液)；将A液加入到B液，室温静止25 min，加入到上述6孔板中，每孔1 mL，培养6 h，更换为正常DMEM培养基，培养24 h。

1.4.5 Real-time PCR检测miR-21及骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达变化

(1)细胞RNA的提取：取上述各组细胞，每EP管内加入500 μL Trizol，室温静止裂解5 min，加入100 μL氯仿，静止10 min至其分层，离心(4 ℃，11 200 r/min，15 min)取上清，加入异丙醇(-20 ℃，静止2 h)，离心(4 ℃，11 200 r/min，15 min)，弃掉上清，加入体积分数为75%乙醇，离心(4 ℃，11 200 r/min，15 min)，室温干燥后加入DEPC水，溶解RNA。

(2)反转录为cDNA：5×TransScript^® ALL-inOne SuperMix for qPCR 4 μL，gDNA Remover 1 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free H₂O 14 μL的反应体系，混匀后42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

(3)Real-time PCR：2×TransStart^®Tip GreenqPCR SuperMix 10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)，Passive Reference Dye (50×)，cDNA和RNase Free H₂O配置成为20 μL的反应体系，反应条件为，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。分别以U6和GAPDH作为内参检测miR-21和骨破坏标志因子TRAP与CTSK mRNA的相对表达量，使用2^-∆∆Ct方法进行半定量分析。检测基因引物序列见表1。

1.4.6 细胞增殖实验将对数生长期的破骨细胞分为miR-21 NC组及miR-21 mimics组、miR-21 inhibitor组，转染后24，48 h，加入0.25%胰蛋白酶消化后900 r/min离心 5 min，调整细胞密度，以3×10³/孔接种至96孔板中，待细胞贴壁后加入CCK-8试剂，培养4 h后，酶标仪450 nm波长检测各孔吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①收集临床样本，采用Real-time PCR法检测miR-21及骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达变化；②采用TRAP染色对破骨细胞进行鉴定；③利用脂质体转染法，以miR-21 mimics(上调miR-21)或miR-21 inhibitor(下调miR-21)转染破骨细胞，采用Real-time PCR法检测miR-21及骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达变化；④CCK-8法检测各组破骨细胞的增殖能力。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0 for Windows软件进行方差分析、t 检验及相关性分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

牙周炎是一种复杂的免疫炎症疾病，主要由病原微生物感染牙龈组织引起的，虽然宿主会产生免疫反应保护组织不被破坏，但是由于组织在对抗微生物作用过程中产生的细胞因子，反而会加速牙周结缔组织和牙槽骨的吸收，出现病理变化，即牙周韧带的破坏、牙周袋的加深及牙槽骨的吸收，这些变化都会导致牙齿的丧失^[24-26]。尽管基因组学、转录组学、蛋白质组学/肽学和代谢组学都在寻找牙周炎诊断、预后和治疗评估的生物标志物，但是并没有找到最佳的用于诊断及治疗牙周炎的基因及蛋白^[27-29]。研究表明，使用脂多糖作用于牙周膜成纤维细胞后，通过miRNA芯片分析发现22个miRNA上调和28个miRNA下调，而这些miRNA与Toll样受体信号途径、cAMP信号通路、转化生长因子β信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路密切相关^[30-31]。众所周知，牙周炎的病因有很多，包括细菌感染、肥胖和尼古丁。牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌，通过研究miRNA的表达可以更好地探讨牙周炎的分子机制，为寻找治疗牙周炎的发生发展找到新的靶点^[32]。

MicroRNA在转录后调节成骨细胞生成，并且正在成为关键的骨稳态和疾病的调节剂^[33]。有学者报道了miR-21通过调节下游靶标蛋白Sprouty 1和Sprouty 2促进骨髓间充质干细胞的成骨作用，miR-21被认为是体外骨髓间充质干细胞的成骨启动子，miR-21或下游效应物可以促进骨形成^[34-35]。还有报道指出miR-21通过调节程序性细胞死亡4(PDCD4)促进破骨细胞凋亡^[36]。另外，miR-21可以调节RANKL和OPG，二者是调节破骨细胞分化和骨吸收功能的关键因子^[37]。miR-21基因敲除小鼠中发现，miR-21敲除后可以抑制破骨细胞的增殖^[38]。干扰miR-21后可以抑制骨髓间充质干细胞的集落形成和增殖^[39]。在多发性骨髓瘤来源的骨髓间充质干细胞中，miR-21可以被激活，减少OPG的表达并间接促进RANKL的表达^[40]。在破骨细胞中发现miR-21靶向Spry1以调节ERK信号传导，进而抑制RANKL表达和促进骨保护素表达，表明miR-21促进破骨细胞生成^[41-42]。

目前的研究主要集中于miR-21促进破骨前体细胞的增殖以及在骨质疏松症中的作用。该实验通过检测发现miR-21在慢性牙周炎组织中的表达明显高于正常牙周膜组织，骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达在慢性牙周炎组织中也都明显增高，且miR-21的表达与骨破坏标志因子之间有明显相关性。为了探讨miR-21在骨破坏中的作用及对破骨细胞增殖能力的影响，实验选取破骨前体细胞RAW264.7细胞，加入了破骨细胞诱导液诱导5 d，通过TRAP染色鉴定破骨细胞诱导成功。在破骨细胞中转染miR-21 mimics(上调miR-21)及miR-21 inhibitor(下调miR-21)，发现上调miR-21后骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达增高，下调miR-21后骨破坏标志因子TRAP与CTSK的表达降低，说明miR-21可以影响破骨细胞的功能。研究表明，牙周炎的骨破坏原因主要是破骨细胞的增殖能力高于成骨细胞，实验结果显示miR-21可以促进破骨细胞的增殖，结合miR-21可以促进骨破坏标志因子的表达，说明miR-21可以作为治疗牙周炎骨破坏的重要靶点。

该研究初步探讨了miR-21在牙周炎中的作用，但是其促进破骨细胞增殖的机制如何仍需要进行研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

MiR-21可调控牙周炎破骨细胞的增殖

MicroRNA-21 regulates proliferation and differentiation of osteoclasts in periodontitis

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