亚低温联合脂肪间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1691

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (13): 2081-2087.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1691

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亚低温联合脂肪间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤的保护作用

刘剑¹，李立¹，王晓川²，张升宁¹，李来邦¹，莽源祎¹，高扬¹，陈永林¹，任刚¹，李望¹

¹昆明市第一人民医院附属甘美医院肝胆胰血管外科，云南省器官移植临床医学中心，云南省昆明市 650224；²云南省第一人民医院皮肤科，云南省昆明市 650032

出版日期:2019-05-08 发布日期:2019-05-08
通讯作者: 李立，博士，主任医师，昆明市第一人民医院附属甘美医院肝胆胰血管外科，云南省器官移植临床医学中心，云南省昆明市 650224
作者简介:刘剑，男，1973年生，云南省昆明市人，汉族，2011年昆明医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事于肝胆胰血管外科移植。

Mild hypothermia combined with adipose-derived mesenchymal stem cells protects hepatic function in hepatic ischemia-reperfusion injury

Liu Jian¹, Li Li¹, Wang Xiaochuan², Zhang Shengning¹, Li Laibang¹, Mang Yuanyi¹, Gao Yang¹, Chen Yonglin¹, Ren Gang¹, Li Wang¹

¹Department of Hepatic-biliary-pancreatic Surgery, Calmette International Hospital, the First People’s Hospital of Kunming, Clinical Medical Center of Organ Transplantation of Yunnan Province, Kunming 650224, Yunnan Province, China; ²Department of Dermatology, the First People’s Hospital of Yunnan, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Online:2019-05-08 Published:2019-05-08
Contact: Li Li, MD, Chief physician, Department of Hepatic-biliary-pancreatic Surgery, Calmette International Hospital, the First People’s Hospital of Kunming, Clinical Medical Center of Organ Transplantation of Yunnan Province, Kunming 650224, Yunnan Province, China
About author:Liu Jian, MD, Associate chief physician, Department of Hepatic-biliary-pancreatic Surgery, Calmette International Hospital, the First People’s Hospital of Kunming, Clinical Medical Center of Organ Transplantation of Yunnan Province, Kunming 650224, Yunnan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
缺血再罐注损伤：是肝脏手术过程中比较常见的引起组织器官损伤的因素之一。在肝移植外科，肝脏缺血再灌注损伤能够引起肝脏移植术后早期或晚期移植肝功能丧失或衰竭，有时甚至成为引发患者死亡的主要原因，能够直接影响患者预后和生存率。
亚低温：是指一种以物理方法将患者的体温降低到预期水平而达到治疗疾病目的的方法。亚低温在神经外科中已得到广泛应用，其可减低内皮细胞损伤、炎症反应及减少活性氧成分的形成，从而对损伤组织具有保护作用。

摘要
背景：肝缺血再灌注损伤的机制复杂多样，是制约肝脏外科手术的瓶颈，如何减轻肝缺血再灌注损伤一直是医学研究的热点与难点之一。
目的：探讨亚低温联合脂肪间充质干细胞预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用机制。
方法：将60只雄性SD大鼠(购于昆明医科大学实验动物中心)随机分为6组：假手术组、肝缺血再灌注损伤组、亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组、ERK通路阻断剂组，每组10只，均于缺血前30 min给予亚低温、脂肪间充质干细胞、ERK通路阻断剂干预。肝缺血再灌注12 h后收集大鼠血清及肝组织标本，进行相关指标检测。肝缺血再灌注12 h后收集大鼠血清、肝组织，术后7 d收集大鼠肝组织，进行相关指标检测。
结果与结论：①全自动生化分析仪检测肝功能指标：亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组血清中天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶活性均低于肝缺血再灌注损伤组(P < 0.05)，亚低温+脂肪间充质干细胞组血清中3种酶活性低于亚低温组和脂肪间充质干细胞组(P < 0.05)；②ELISA检测氧化应激指标：亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组肝组织中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于肝缺血再灌注损伤组(P < 0.05)，丙二醛水平均显著低于肝缺血再灌注损伤组(P < 0.05)；亚低温+脂肪间充质干细胞组肝组织中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平显著高于亚低温组和脂肪间充质干细胞组(P < 0.05)，而丙二醛水平低于亚低温组和脂肪间充质干细胞组(P < 0.05)；③Western blotting检测相关蛋白表达：与肝缺血再灌注损伤组相比，亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组肝组织中p-ERK1/2相对表达水平显著升高(P < 0.05)，各组中ERK1/2的表达差异无显著性意义；④TUNEL检测肝细胞凋亡数量：肝缺血再灌注损伤组和ERK通路阻断剂组肝组织中细胞凋亡率明显高于亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组。同时，Western blotting检测相关凋亡蛋白结果与其一致；⑤结果表明，亚低温联合脂肪间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制与激活ERK通路进而下调肝细胞凋亡有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2294-9658(刘剑)

关键词: 肝缺血再灌注, 脂肪间充质干细胞, 亚低温, 肝细胞凋亡, ERK信号通路, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Hepatic ischemia-reperfusion injury is the bottleneck restricting liver surgeries as its complex and diverse mechanisms. How to reduce liver ischemia-reperfusion injury has always been one of the hotspots and difficulties in medical research.
OBJECTIVE: To explore the protective mechanism of mild hypothermia pretreatment combined with adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation for hepatic ischemia reperfusion injury in rats.
METHODS: Sixty male Sprague-Dawley rats (provided by the Experimental Animal Center of Kunming Medical University in China) were randomly divided into six groups with 10 rats in each group: sham operation group (Sham), hepatic ischemia-reperfusion injury group (HIRI), mild hypothermia group (MH), adipose-derived mesenchymal stem cells group (ADMSCs), mild hypothermia+ADMSCs group (MH+ADMSCs) and mild hypothermia+ADMSCs+ ERK inhibitor group (MH+ADMSCs+PD98059). The rats were given mild hypothermia, adipose-derived mesenchymal stem cells, or ERK inhibitor intervention at 30 minutes before ischemia. The serum and liver tissue samples were collected 12 hours after hepatic ischemia-reperfusion.
RESULTS AND CONCLUSION: The activities of aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and lactate dehydrogenase in the serum of groups MH, ADMSCs and MH+ADMSCs were significantly higher than those in the HIRI group (P < 0.05). The activities of aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and lactate dehydrogenase in group MH+ADMSCs were significantly lower than those in groups MH and ADMSCs (P < 0.05). Subsequently, compared with group HIRI, the activities of superoxide dismutase and glutathione peroxide were significantly higher in groups MH, ADMSCs and MH+ADMSCs (P < 0.05), whereas the levels of malondialdehyde were significantly lower in the three groups (P < 0.05). The activities of superoxide dismutase and glutathione peroxide in group MH+ADMSCs were significantly higher than those in groups MH and ADMSCs (P < 0.05), whereas the level of malondialdehyde in group MH+ADMSCs was lower than that in groups MH and ADMSCs (P < 0.05). The relative expression level of p-ERK1/2 in the liver tissue was significantly increased in groups MH, ADMSCs and MH+ADMSCs as compared with group HIRI (P < 0.05), but there were no significant differences in the relative expression level of ERK1/2 among the groups. Furthermore, the apoptotic cell proportion of liver tissues in groups HIRI and MH+ADMSCs+PD98059 were higher than that in groups MH, ADMSCs and MH+ADMSCs. These results were in consistent with the findings of western blot detection. To conclude, mild hypothermia combined with adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation has a protective effect against hepatic ischemia-reperfusion injury, and the mechanism may be through activating ERK pathway to downregulate the percentage of apoptotic hepatocytes in vivo.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Liver, Reperfusion Injury, Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Hypothermia, Induced, Tissue Engineering

中图分类号:

刘剑，李立，王晓川，张升宁，李来邦，莽源祎，高扬，陈永林，任刚，李望. 亚低温联合脂肪间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 2081-2087.

Liu Jian, Li Li, Wang Xiaochuan, Zhang Shengning, Li Laibang, Mang Yuanyi, Gao Yang, Chen Yonglin, Ren Gang, Li Wang. Mild hypothermia combined with adipose-derived mesenchymal stem cells protects hepatic function in hepatic ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 2081-2087.

图/表（结果） 3

2.1 亚低温联合脂肪间充质干细胞改善肝缺血再灌注损伤大鼠肝功能 通过全自动生化分析仪检测各组肝缺血再灌注12 h后大鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶活性。从表1中可以看出，肝缺血再灌注损伤组、亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组血清中3种酶的活性显著高于假手术组(P < 0.05和P < 0.01)，亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组血清中3种酶的活性均显著低于肝缺血再灌注损伤组(P < 0.05和P < 0.01)。亚低温+脂肪间充质干细胞组大鼠血清中3种酶的活性明显低于亚低温组和脂肪间充质干细胞组(P < 0.05)。由此可知，亚低温联合脂肪间充质干细胞可显著下调肝缺血再灌注损伤大鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶活性，进而改善肝缺血再灌注损伤大鼠的肝功能。

2.2 亚低温联合脂肪间充质干细胞减轻肝缺血再灌注损伤诱导的氧化应激 采用试剂盒检测各组大鼠肝组织中超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶水平。从表2中可发现，肝缺血再灌注损伤组、亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组肝组织中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平显著低于假手术组(P < 0.05和P < 0.01)，而丙二醛含量显著高于假手术组(P < 0.05和P < 0.01)。同时，亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组肝组织中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平显著高于肝缺血再灌注损伤组 (P < 0.05和P < 0.01)，而丙二醛含量低于肝缺血再灌注损伤组(P < 0.01)。亚低温+脂肪间充质干细胞组肝组织中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平显著高于亚低温组和脂肪间充质干细胞组(P < 0.05)，而丙二醛含量低于亚低温组和脂肪间充质干细胞组(P < 0.05和P < 0.01)。由此可知，亚低温联合脂肪间充质干细胞可缓解肝缺血再灌注损伤诱导的氧化应激。

2.3 亚低温联合脂肪间充质干细胞对ERK信号通路的影响采用Western blotting检测各组肝组织中ERK1/2的磷酸化水平，见图1。肝缺血再灌注损伤组中p-ERK1/2的相对表达量明显低于假手术组(P < 0.01)；亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组肝组织中p-ERK1/2的相对表达量显著高于肝缺血再灌注损伤组 (P < 0.01)，且亚低温+脂肪间充质干细胞组肝组织中p-ERK1/2的相对表达量显著高于亚低温组和脂肪间充质干细胞组(P < 0.05)，但ERK蛋白的表达水平在各组间差异无显著性意义。由此可知，亚低温联合脂肪间充质干细胞处理后激活了ERK信号通路。

2.4 亚低温联合脂肪间充质干细胞通过激活ERK信号通路下调肝细胞凋亡 TUNEL染色结果显示，肝缺血再灌注损伤组细胞凋亡率[(22.35±2.1)%]显著高于假手术组[(1.52±0.86)%]，差异有显著性意义(P < 0.01)；亚低温组[(6.57±1.24)%]、脂肪间充质干细胞组[(10.23±1.58)%]、亚低温+脂肪间充质干细胞组[(2.01±0.90)%]细胞凋亡率明显下降，与肝缺血再灌注损伤组比较差异有显著性意义 (P < 0.05，P < 0.01)。同时，亚低温+脂肪间充质干细胞组肝细胞凋亡率显著低于亚低温组和脂肪间充质干细胞组(P < 0.05)，而ERK通路阻断剂组[(16.58±2.58)%]肝细胞凋亡率与肝缺血再灌注损伤组差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2A。

Western blotting检测凋亡相关蛋白表达，见图2B。与假手术组相比，肝缺血再灌注损伤组抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降(P < 0.01)，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达水平升高(P < 0.01)。与肝缺血再灌注损伤组相比，亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组Bcl-2表达水平上升(P < 0.01)，Bax和caspase-3表达水平下降(P < 0.05，P < 0.01)，而ERK通路阻断剂组Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平与肝缺血再灌注损伤组差异无显著性意义(P > 0.05)。由此可知，亚低温联合脂肪间充质干细胞通过激活ERK信号通路下调肝细胞凋亡，进而缓解肝缺血再灌注损伤。

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引言

肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)是指缺血的肝脏重新获得血液供应后，肝脏功能没有得到恢复反而出现功能代谢障碍加重和肝脏组织结构破坏的现象^[1-3]。在肝切除术中常需要阻断肝脏血流以控制出血，常温下肝脏暂时低灌流达15 min即可出现缺血再灌注损伤^[4-6]，严重时可致肝功能衰竭，可直接影响到疾病的预后、手术的成功率和患者的存活率。肝缺血再灌注损伤的机制复杂多样，是制约肝脏外科手术的瓶颈，如何减轻肝缺血再灌注损伤一直是医学研究的热点与难点之一^[5^，^7]。

近期有研究证实，脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)对缺血再灌注损伤具有显著的保护作用^[8-11]。脂肪间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的细胞生物学特点、分化潜能及细胞表面抗原^[12-13]。Zhou等^[14]研究表明，脂肪间充质干细胞可缓解肾脏缺血再灌注损伤。此外，研究发现亚低温治疗有助于保持干细胞具有分化潜能的特性，使其不会退化。Saito等^[15]报道在亚低温(32 ℃)条件下可以保护神经干细胞的干细胞特性，减少神经干细胞的凋亡，这可能是亚低温对脑保护作用的一种机制。亚低温治疗还可以降低局部组织细胞水肿，抑制局部微环境的氧自由基浓度及减轻炎症反应，为干细胞定植及分化增殖创造条件。此外，在重要脏器的缺血再灌注损伤研究中，均发现损伤早期伴有ERK的激活，参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学效应^[16-20]。为此，该研究观察亚低温联合脂肪间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤大鼠肝功能酶活性、氧化应激及肝组织中ERK信号通路的调控作用，初步探讨亚低温联合脂肪间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤的保护机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物体内实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年5月至2018年3月在昆明医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 成年健康雄性SD大鼠90只，体质量200-250 g，购于昆明医科大学实验动物中心，饲养于昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室，饲养环境温度24 ℃。所有实验操作均参照《实验动物和操作管理规程》进行。

1.3.2 药物及试剂 ERK抗体和p-ERK抗体(美国Cell Signaling公司)；Bax抗体、Bcl-2抗体和Caspase-3抗体(碧云天生物技术研究所)；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)(上海碧云天生物技术有限公司)；ERK通路阻断剂PD98059(美国Med Chem Express公司)；小鼠谷胱甘肽过氧化物酶、小鼠总超氧化物歧化酶和丙二醛ELISA试剂盒(上海樊克生物科技有限公司)；ReadyPrep蛋白质萃取试剂盒(总蛋白)、SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒(美国Bio-Rad公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞分离 取雄性SD大鼠30只，无菌条件下获取腹股沟区白色的皮下脂肪，根据史光军等^[21]方法进行纯化培养及鉴定。将第3-6代脂肪间充质干细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，准备下一步实验。

1.4.2 动物分组和肝缺血再灌注损伤模型建立 将60只SD大鼠随机分为以下6组：假手术组、肝缺血再灌注损伤组、亚低温组、脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞组、亚低温+脂肪间充质干细胞+ERK通路阻断剂组(简称ERK通路阻断剂组)，每组10只。

实验前12 h禁食，自由饮水。在麻醉前给予硫酸阿托品0.1 mg/kg，肌注。将大鼠仰卧位固定于手术台上，一侧下肢行股静脉穿刺插管，建立静脉通道，接电子微量泵供肝素化、给药和输液用。参照Kohli等^[22]方法制作大鼠肝实质70%缺血模型。自剑突下4.0-5.0 cm做腹部正中切口，分离显露肝门部，用止血钳沿着血管方向作钝性分离，于尾状叶上方游离肝左叶、左中叶、右中叶及方形叶的血管、胆管。用无损伤血管夹夹闭肝左外叶、肝中叶之门静脉、肝动脉，但不阻断右肝血流以防门脉及胃肠淤血，观察肝脏表面颜色变灰白、质地变软，表明肝脏缺血形成，用无菌温盐水纱布敷盖腹部切口。夹闭1 h后开放血管夹，进行肝脏再灌注，全层关腹，再灌注12 h后再开腹取标本。假手术组仅在大鼠腹部正中切开，然后关腹。

1.4.3 亚低温、脂肪间充质干细胞、ERK通路阻断剂处理 缺血前30 min，假手术组和肝缺血再灌注损伤组大鼠股静脉给予生理盐水5 mL/(kg•h)，维持直肠温度为(37.0± 0.2) ℃；亚低温组大鼠麻醉后采用冰袋使其体温降至32 ℃，并维持直肠温度为(32.0±0.2)℃，其他与肝缺血再灌注损伤组相同；脂肪间充质干细胞组大鼠经股静脉以2 mL/(kg•h)注入脂肪间充质干细胞2 mL，注射完毕用血管夹夹住门静脉避免返流，拔出穿剌针后用棉签轻压止血，其他与肝缺血再灌注损伤组相同；亚低温+脂肪间充质干细胞组经亚低温处理后经股静脉以2 mL/(kg•h)注入脂肪间充质干细胞2 mL，注射完毕用血管夹夹住门静脉避免返流，拔出穿剌针后用棉签轻压止血，维持直肠温度为(32.0±0.2) ℃，其他与肝缺血再灌注损伤组相同；ERK通路阻断剂组大鼠经亚低温联合脂肪间充质干细胞处理后，经股静脉以2 mL/(kg•h)注入0.5 mL ERK通路阻断剂PD98059，注射完毕后用血管夹夹住门静脉避免返流，拔出穿剌针后用棉签轻压止血，其他与肝缺血再灌注损伤组相同。

1.4.4 肝组织中超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶水平 再灌注12 h后，每组取4只大鼠，再次麻醉、开腹，切取左、中叶肝脏，用冰生理盐水洗去血迹，快速置入冻存管，于液氮罐冻存后移入-20 ℃低温冰箱保存。正常制取肝匀浆液后，按试剂盒操作说明检测超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶水平。

1.4.5 血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶活性 再灌注12 h后，取上述每组4只大鼠下腔静脉血0.5 mL置入干燥试管，4 000 r/min离心5 min，取上清液，以全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶活性。

1.4.6 TUNEL法检测肝组织细胞凋亡情况 术后第7天，每组取4只大鼠，再次麻醉后处死，取肝组织，采用一步法TUNEL试剂盒按说明书对各组大鼠肝组织中细胞凋亡情况进行检测。用PBS清洗组织切片2次，滴加50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS清洗3次，采用抗荧光淬灭封固液封固后于荧光显微镜下观察。每张切片随机计数10个100倍视野，平均每100个细胞中凋亡细胞数为细胞凋亡指数。

1.4.7 Western blotting检测ERK通路相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达 术后第7天，取上述每组4只大鼠肝组织，提取总蛋白后，以SDS-PAGE分离蛋白，转膜，蛋白密封于5%牛血清蛋白中维持1 h，再加入一抗(兔抗人p-ERK1/2抗体、抗ERK1/2抗体、抗Bax抗体、抗Bcl-2抗体、抗Caspase-3抗体和抗GAPDH抗体），4 ℃下孵育过夜，洗膜3次，加入羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h，洗膜3次，加入发光试剂显影。以GAPDH为内参，采用Image J软件分析靶带的灰度水平。

1.5 主要观察指标 ①全自动生化分析仪检测大鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶活性；②ELISA试剂盒检测各组大鼠肝组织中超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶水平；③Western blotting检测ERK通路及凋亡相关蛋白的表达水平；④TUNEL检测肝组织细胞凋亡情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，两组间比较采用Student t 检验，GraphPad Prism 7对实验数据进行相关图片绘制，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肝缺血再灌注损伤是一个多因素的病理变化过程。在再灌注复氧过程中活性氧的产生，库普弗细胞、中性粒细胞活化引起一系列的损伤性细胞反应，进一步导致微循环障碍，加重了肝脏局部的缺血^[22-25]，其机制较复杂，且目前尚未完全认识清楚。为此，深入探讨肝缺血再灌注损伤的发病机制及防治措施已经成为肝缺血再灌注损伤防治的研究热点。

近年来，大量临床研究发现，亚低温能够多环节、多途径减轻缺血再灌注损伤，具有显著的保护作用^[26-29]。Zhu等^[30]研究表明，亚低温可通过下调促凋亡蛋白Bax和上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，进而起到对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。Santos等^[31]研究表明，不同强度的低温可通过调控氧化应激水平进而缓解肾脏缺血再灌注损伤作用；Zhou等^[32]研究发现，亚低温通过改善溶酶体功能和细胞自噬流水平，进而保护海马神经元免受氧-葡萄糖剥夺再灌注损伤。此研究证实亚低温处理肝缺血再灌注损伤后可显著下调肝功能酶活力，同时伴随着抗凋亡蛋白Bcl-2显著升高及促凋亡蛋白Bax显著下调，进而发挥抗凋亡和抗氧化应激作用。

虽然亚低温治疗对缺血再灌注损伤有明确的效果，但其效能与作用时间及作用强度有依赖关系，如Kanagawa等^[33]指出随着作用时间及作用强度变化，出现不同程度的神经细胞生长停滞，而且接受治疗者除缺血再灌注损伤之外还有其他严重的病理变化。这与动物实验模型中均选择成熟健康个体不同，能否耐受亚低温治疗也是一个必须考虑的问题，在效能与危害之间选择一个最佳的作用时间及作用强度，使危害最小，而效能最大化。因此，联合其他抗缺血再灌注损伤的方法就是必然之路。间充质干细胞发现于20世纪中叶，大量研究证明其有多种分化潜能，促进损伤组织细胞的再生，成为组织工程学的重要种子细胞^[34]。近年研究发现间充质干细胞对缺血再灌注损伤有保护作用^[35-36]。例如，Yu等^[37]发现转染肝细胞生长因子基因的间充质干细胞可以促进小体积肝移植肝脏组织的再生及功能的恢复；Devey等^[38]将敲除C-jun末端激酶2基因的间充质干细胞注入到大鼠肝缺血再灌注模型中，通过过表达血红素加氧酶对肝缺血再灌注损伤有明显的保护作用；Kanazawa等^[39]证明骨髓间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤有明显的保护作用。此外，Pan等^[40]研究发现骨髓间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤的保护作用机制与下调MEK/ERK信号通路有关。该研究证实通过亚低温联合脂肪间充质干细胞处理肝缺血再灌注损伤大鼠模型可显著促进ERK1/2磷酸化水平，但对ERK的表达没有影响，ERK通路阻断剂PD98059联合作用则明显下调了亚低温联合脂肪间充质干细胞的作用效果，进一步证实亚低温联合脂肪间充质干细胞通过激活ERK信号通路缓解肝缺血再灌注损伤。

综上所述，亚低温联合脂肪间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤引起的肝功能损伤、细胞凋亡和氧化应激具有抑制效应，ERK特异性抑制剂PD980259可阻断该保护效应。亚低温联合脂肪间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤保护作用可能与ERK信号通路激活有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

亚低温联合脂肪间充质干细胞对肝缺血再灌注损伤的保护作用

Mild hypothermia combined with adipose-derived mesenchymal stem cells protects hepatic function in hepatic ischemia-reperfusion injury

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