干细胞源性外泌体促骨折愈合的机制及临床应用进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1565

摘要/Abstract

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文题释义：
干细胞源性外泌体：外泌体是由多种细胞在特定刺激下释放的一种直径在40-100 nm的胞外囊泡。外泌体能选择性包裹来源细胞的蛋白质分子、遗传性物质、细胞因子等功能性生物活性物质，并以胞吐的形式分泌到胞外环境，具有重要的胞间通讯功能。干细胞源性外泌体因其携带干细胞特殊的生物活性物质，被认为是重要的无细胞再生医学的一员，有望成为新的临床治疗方法。
骨折愈合：骨折愈合是由多系统共同完成的复杂的生理程序，主要分为血肿机化期、骨痂形成期和骨痂塑形期。在骨折端局部微环境中，骨不断地进行重建，其重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝，之后成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。骨折愈合主要是破骨与成骨过程的动态平衡。

摘要
背景：根据干细胞源性外泌体的生物学特点，不断有研究发现其在促成骨分化、血管生成和骨质矿化中具有特异性作用，是潜在的促骨折愈合材料。
目的：综述干细胞源性外泌体促骨折愈合的机制及其临床应用最新研究进展，以期为临床应用提供思路。
方法：检索PubMed数据库及CNKI中国期刊全文数据库收录的干细胞源性外泌体促进骨折愈合的相关文章。英文检索词为“stem cell derived exosome，fracture healing，bone regeneration，osteogenic differentiation”，中文检索词为“干细胞，外泌体，骨折愈合，骨再生，成骨分化”。按照纳入与排除标准最终纳入49篇文献进行归纳总结。
结果与结论：①干细胞源性外泌体能通过选择性携带遗传因子、蛋白质、转录因子等生物活性物质在骨折愈合微环境中发挥促进作用；②干细胞源性外泌体主要通过改善骨折微环境、促进血管形成、成骨分化、骨矿化等方式促进骨折愈合；③受制于高效经济的分离提取方式和适合的使用载体，干细胞源性外泌体促骨折愈合的临床应用尚需要进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0003-3457-3432(朱万博)

关键词: 干细胞, 外泌体, 骨折愈合, 骨折愈合微环境, 干细胞外泌体, 成骨分化

Abstract:

BACKGROUND: Recently, increasing researches have reported the specific function of stem cell-derived exosomes based on its biological features in osteogenic differentiation, angiogenesis and bone mineralization, indicating that stem cell-derived exosome is a potential material in promoting fracture healing.
OBJECTIVE: To review the mechanism and clinical progress of stem cell-derived exosomes in promoting fracture healing, which is expected to provide a new insight into its clinical therapy.
METHODS: The first author retrieved literatures on bone graft materials and bone defect repair in CNKI (Medical Edition) database and PubMed database by the keywords of “stem cell derived exosome, fracture healing, bone regeneration, osteogenic differentiation” in Chinese and English, respectively. Finally, 49 articles were eligible for result analysis
RESULTS AND CONCLUSION: Stem cell-derived exosomes can promote fracture healing by selectively carrying genetic factors, proteins, transcription factors and other biologically active substances. The promotion by stem cell-derived exosomes is mainly implemented by improving fracture microenvironment, promoting osteogenic differentiation, angiogenesis and bone mineralization. However, due to the efficient and economical separation and extraction methods and suitable vectors, the clinical application of stem cell-derived exosomes to promote fracture healing still needs further research.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Exosomes, Fracture Healing, Tissue Engineering

中图分类号:

朱万博，卢锦森，杨家赵，方诗元. 干细胞源性外泌体促骨折愈合的机制及临床应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 815-820.

Zhu Wanbo, Lu Jinsen, Yang Jiazhao, Fang Shiyuan. Mechanism and clinical application of stem cell-derived exosomes in promoting fracture healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 815-820.

图/表（结果） 1

2.1 干细胞源性外泌体促骨折愈合的生物学基础 骨折愈合是一个复杂的生理过程。在骨折微环境中，骨母细胞和干细胞向成骨细胞增殖分化并移行至骨缺损和骨吸收区域，未成熟的成骨细胞产生含钙盐和磷酸盐的骨基质，并促使其矿化形成矿化骨是骨折愈合的主要机制^[10]。调控干细胞和骨祖细胞的成骨分化是促骨折愈合的基础之一。骨折微环境中的新生血管能为骨折愈合带来必须的营养和无机盐，丰富的血管加快局部废物代谢的同时带来大量迁移的多能干细胞，提高成骨分化和骨重建的效率^[11-12]。前期大量研究发现，干细胞源性外泌体可通过调控多能干细胞成骨分化，促进新生血管生成，提高无机盐沉积和基质矿化等途径，促进骨折愈合。这一过程是由干细胞源性外泌体选择性携带的生物活性物质所决定^[9]。

2.2 外泌体携带的遗传物质调控促骨折愈合过程 干细胞源性外泌体能携带遗传物质如微小RNA(miRNA)和mRNA，在骨细胞间和干细胞间传递遗传信息，是调控干细胞源性外泌体促骨折愈合的重要组成部分^[13]。miRNA被认为是成骨细胞相关骨生成和骨重建中重要的转录后调控因子，能开启一系列骨折修复相关反应^[14]。在脂质膜的包裹下miRNA能稳定存在于外泌体中免于免疫系统的分解，并最终随外泌体以膜融合或直接胞吞的方式进入靶细胞，发挥效应。

2.2.1 干细胞源性外泌体miRNA具有激活靶细胞成骨分化和血管新生能力，促进骨生成的作用 Xu等^[15]于2014年首次发现骨髓间充质干细胞源性外泌体(BMSC-Exo)miRNA在促骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的分布具有差异性，其中一系列前期实验发现提高干细胞成骨分化能力的miRNA如let-7a等显著上调。还有一些体内外对比实验也相继发现一些特定的干细胞源性外泌体miRNA具有促成骨分化能力。Furuta等^[16]利用外泌体沉默表达的CD9^-/-小鼠做动物模型，从间充质干细胞培养基分离得到的骨髓间充质干细胞源性外泌体较对照组能加速骨折愈合，体外分析外泌体内容物发现miR-21、miR-4332等成骨分化相关miRNA与其他细胞来源外泌体相比高表达。有趣的是，被认为具有募集干细胞、促进成骨分化和血管生成功能的单核细胞趋化蛋白(MCP-1、MCP-3)和基质细胞衍生因子(SDF-1)在骨髓间充质干细胞源性外泌体内含量较对照组低，研究者推测成骨分化和血管生成相关miRNA在干细胞源性外泌体内的差异性分布，提示这些具有特殊功能的miRNA才是促骨折愈合的主要机制。表1列举了一部分研究中主要的差异性分布的miRNA及其生物学效应^[15-19]。

2.2.2 不同分化阶段干细胞外泌体促成骨分化能力具有差异性 体外实验证实分化晚期人间充质干细胞源性外泌体(hMSCs-Exo)具有最强的促成骨分化能力，这可能是由于不同分化阶段干细胞选择性携带的miRNA含量不同所决定^[15^，^19]。miR-31，miR-221和miR-144等具有抑制成骨分化作用的miRNA在分化晚期干细胞源性外泌体中含量显著降低，而miR-21，miR-10b等促成骨分化相关miRNA的含量显著上调，使干细胞源性外泌体对靶细胞成骨分化具有促调控作用^[19]。

2.2.3 干细胞源性外泌体miRNA调控破骨细胞分化，促进骨吸收 骨折愈合是成骨-破骨分化的动态平衡过程，骨折微环境中骨吸收是启动一系列骨折愈合机制的开始^[13]。骨髓间充质干细胞源性外泌体中携带的miR-503等miRNA具有促进干细胞破骨分化和骨吸收的作用^[20]。这些miRNA通过调控RANK-RANKL信号通路调节成骨-破骨的动态平衡，促进骨折愈合^[13]。

2.2.4 一些不同干细胞源性外泌体mRNA也具备激发骨折愈合的能力 Tooi等^[21]发现人胚胎间充质干细胞来源外泌体(hPMSC-Exo)与骨形态发生蛋白2共培养时，细胞外基质标记物碱性磷酸酶和成骨细胞特异性转录因子OSX的mRNA表达显著上调，成纤维细胞成骨分化加速，骨矿物沉积增加。体外实验发现人脂肪来源干细胞源性外泌体(ASCs-Exo)能通过上调成骨相关基因RUNX2、ALP和COL1A1的mRNA表达，提高靶细胞成骨能力，促进骨生成^[22]。

干细胞源性外泌体miRNA和mRNA是遗传信息的载体，其促进骨折愈合作用需要信号通路、蛋白质和细胞因子的共同参与。

2.3 信号通路与转录因子介导促骨折愈合过程 干细胞源性外泌体选择性携带的遗传物质和功能性蛋白作用于靶细胞后，通过借助一系列信号通路和转录因子介导促骨折愈合过程。

RUNX2是调控成骨分化的转录因子，其表达可指导多能干细胞向成骨细胞系分化并抑制成骨细胞成熟，维持未成熟成骨细胞持续的成骨能力，在干细胞修复骨损伤中扮演重要角色^[23]。Qi等^[24]通过体内实验发现人诱导性多能间充质干细胞源性外泌体(hiPS-MSC-Exo)在上调RUNX2等转录因子表达后，激发成骨分化，促进新生血管生成，提高动物骨折愈合率。干细胞源性外泌体miRNA在RUNX2的上调中至关重要^[25]。分化晚期间充质干细胞源性外泌体中含量大幅降低的miR-31影响RUNX2下游基因Osterix和SATB2表达下调，是潜在的RUNX2作用位点^[26]。体外实验证实降低或抑制miR-31表达可促进成骨分化，提高骨含量和骨密度^[27]。

PI3K-AKT信号通路因其激发成骨分化，促进骨生成的作用被认为在干细胞源性外泌体介导的促骨折愈合中扮演重要角色^[28-29]。Zhang等^[30]通过体外实验证实人诱导性多能干细胞源性外泌体通过上调PI3K-AKT的激活基因PDGFA和FGFR1等，下调PI3K-AKT抑制因子表达，激活PI3K-AKT级联反应，诱导干细胞向成骨细胞增殖分化，提高碱性磷酸酶表达和钙盐沉积，促进骨折愈合。miRNA是调节PI3K-AKT信号通路的重要分子。骨髓间充质干细胞来源外泌体中高表达的miR-21是干细胞源性外泌体中主要的调控因子之一，其可通过抑制SOX2促进成骨分化^[31]。同时，miR-21可以调控PI3K-AKT-GSK3β信号通路，促进β-catenin在细胞质中的稳定积累从而激活RUNX2的转录，激发成骨分化^[32]。股骨颈骨折或转子间骨折长期不愈合会加重股骨头供血不足，诱发股骨头坏死，并进一步加重血供不足，阻碍骨折愈合。良好的促血管生成能力是避免骨坏死和骨不连加重的条件。Liu等^[33]在研究干细胞源性外泌体治疗股骨头坏死时发现诱导性多能干细胞源性外泌体可激活PI3K/Akt信号通路增加血管生成，减少骨丢失。

Wnt通路是重要的骨修复相关信号通路，干细胞源性外泌体能激活Wnt通路诱导多种生物学功能，用肿瘤坏死因子α预处理的脂肪干细胞源性外泌体能上调干细胞内Wnt3的表达，促进骨再生^[34]。研究发现人脐带干细胞源性外泌体通过激活Wnt4介导的β-catenin核转运，诱导内皮细胞增殖分化并血管内皮化，促进新生血管生成。McBride等^[35]亦发现骨髓间充质干细胞来源外泌体可激活Wnt3a-β-catenin通路，诱导成纤维细胞成血管能力。Wnt通路介导的这一血管新生作用在促骨折愈合中具有积极作用，但具体的机制尚不清楚，需要进一步研究。

2.4 功能性蛋白和细胞因子共同参与促骨折愈合过程 一些功能性蛋白和细胞因子共同参与了干细胞源性外泌体促骨折过程。Martins等^[36]发现骨髓间充质干细胞来源外泌体诱导了早期骨形态发生蛋白2大量生成，骨形态发生蛋白2能通过级联激活转录因子OSX而非RUNX2促进干细胞成骨分化和骨生成。同时，骨桥蛋白、骨唾液蛋白和骨钙素蛋白在经过预处理的骨髓间充质干细胞来源外泌体作用后被激活大量表达，在调节无机盐沉积，促进骨基质矿化等骨再生过程中发挥作用。Narayanan等^[37]发现间充质干细胞来源外泌体诱导高表达骨形态发生蛋白9、转化生长因子β1、血管内皮生长因子和血小板源性生长因子。骨形态发生蛋白9被认为是强于骨形态发生蛋白2的成骨分化诱导因子，转化生长因子β1和血小板源性生长因子在成骨分化和血管生成中亦有作用^[38]。Qi等^[24^，^39]亦发现人诱导性多能干细胞源性外泌体诱导了骨桥蛋白、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白的早期高表达，加强了骨矿化。同时，高表达的磷酸化蛋白和骨基质酸性蛋白(DMP1)被发现于含间充质干细胞来源外泌体的细胞外基质中，提示干细胞源性外泌体能促进磷酸钙募集和骨矿化^[40]。

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引言

材料方法

讨论

上述大量研究表明，干细胞源性外泌体通过其选择性携带的生物活性物质在成骨分化、血管生成和骨质矿化中具有促进作用，是良好的再生医学材料。同时，干细胞源性外泌体具有的免疫调节性和抗炎性也引起了研究者们的注意，是促骨折愈合的潜在生物学机制^[41]。但是，其在骨折愈合上的临床应用依然受到一些问题的困扰。

干细胞源性外泌体良好的细胞外基质结合能力是其临床应用的有利条件，近期已经有学者将人脂肪干细胞源性外泌体与聚乳酸-羟基乙酸支架结合，促进了动物骨折愈合^[22^，^37]。然而，如何保障干细胞源性外泌体在生物支架长期稳定存在并于骨折端发挥作用是临床应用的一大难题。外泌体作为一种细胞外囊泡其本身不具有生物活性，在外泌体消耗后如何进行补充，如何在骨折端缓释外泌体的促骨折愈合作用是尚需要攻克的课题。同时，干细胞源性外泌体的促骨折机制是需要体内细胞多系统联合参与的协同过程，对不具有生物活性的骨折端如何与周围组织产生联系，是否需要通过截骨或骨移植来推进外泌体的促骨折愈合作用亦没有定论。

如何大量高效地培养来源细胞，分离提纯外泌体和运输贮存是临床应用的另一大难题。大量干细胞培养需要实时控制细胞培养条件与环境，以防止细胞表型的改变。干细胞源性外泌体主要由干细胞培养基提取液经超速离心和超滤获取，其数量有限^[42]。一些分离提纯的新技术如基于细胞尺寸的切向流过滤和利用免疫磁性捕捉外泌体生物标记的微流体技术也因价格昂贵和效果有限等原因尚未大量开展^[43]。

促进骨折愈合本质上是一种激活细胞和组织生长的过程，然而这是否会间接导致肿瘤产生是一个需要慎重对待的问题，已有研究表明干细胞源性外泌体能促进肿瘤的生长和恶变^[44-45]。Qi等^[46]发现骨髓间充质干细胞来源外泌体能通过激活Hedgehog信号通路诱发骨肉瘤生长。骨髓间充质干细胞来源外泌体甚至能在促进骨髓瘤细胞增殖分化、迁移幸存的基础上诱发其抗药性^[47]。矛盾的是，分化早期骨髓间充质干细胞来源外泌体携带的miR-340能抑制骨髓瘤的血管生成能力从而显著限制肿瘤的生长，分化晚期骨髓间充质干细胞来源外泌体亦通过miR-340转染能获得相同的抗肿瘤特性^[48]。如何限制干细胞源性外泌体潜在的促肿瘤能力是临床应用前必须解决的问题。

生物安全性是另一个临床应用尚存的问题。目前干细胞源性外泌体促骨折愈合主要在体外实验和动物模型上开展，缺乏系统性协同观察和监视作用。如何在应用干细胞源性外泌体促骨折愈合的同时进行有效的监管，在获得满意的疗效后如何及时停止外泌体的生物学作用是临床应用面临的实质性难题^[49]。

然而，目前临床应用尚存的问题主要受限于现有技术手段。干细胞的大量培养和外泌体的分离提纯技术随着外泌体研究的不断深入而逐渐有所突破。能否利用基因编辑技术抑制干细胞源性外泌体的促肿瘤性，值得进一步研究。干细胞源性外泌体在骨折愈合中的促进作用和良好的免疫适应性使其依然是今后促进骨折愈合的主要潜在治疗手段。

综上所述，干细胞源性外泌体因在成骨分化、血管生成和骨质矿化等骨折愈合的生物学机制中具有促进作用，是潜在的促骨折愈合生物学材料，见图2。然而其临床应用依然面临一系列争议和挑战而迟迟未开展。干细胞源性外泌体在促骨折愈合中的临床应用仍需要研究者们的关注和解决。

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