二甲双胍通过Akt通路调控胃癌干细胞的增殖与凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1544

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
二甲双胍：作为临床广泛应用的安全高效的双胍类降糖药，通过减少糖异生、提高组织的胰岛素敏感性、抑制小肠对葡萄糖的吸收而发挥降糖作用。体内外实验研究发现，二甲双胍能直接和(或)间接抑制多种肿瘤细胞或肿瘤干细胞增殖并通过细胞周期阻滞诱导细胞凋亡。还有多项研究证实二甲双胍可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。以上研究结果均提示，二甲双胍可成为肿瘤治疗的新选择。
胃癌干细胞：最初自胃癌组织中分离出的具有异质性的细胞，不仅具有与肿瘤干细胞相同的自我更新和不对称分裂性质，还具有与胚胎干细胞相同的分化潜能，构成了肿瘤组织的细胞起源，可在体外培养条件下分化形成血管内皮样及腺体样结构。研究发现，胃癌干细胞除了具有较普通胃癌细胞更强的肿瘤发生与形成能力，还具有较强的迁移与侵袭能力，并通过分泌促进血管生长的相关因子直接或间接促进肿瘤血管的形成，从而在胃癌的抗药、复发、侵袭与转移中发挥主导作用。

摘要
背景：二甲双胍可抑制包括胃癌干细胞在内的多种肿瘤干细胞的增殖，靶向胃癌干细胞为临床有效治疗胃癌提供新思路，但其对胃癌干细胞增殖中PI3K/Akt信号通路的影响及可能机制尚未见报道。
目的：探讨二甲双胍对胃癌干细胞增殖、凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响。
方法：以人胃癌SGC7901细胞株为亲本细胞分离培养胃癌干细胞并进行鉴定。以不同浓度(1，5，10 mmol/L)二甲双胍分别处理胃癌干细胞24，48，72 h，MTT检测细胞增殖活力，流式细胞术检测细胞凋亡，RT-qPCR检测细胞中PI3K、Akt mRNA的表达；以8 mmol/L二甲双胍与100 mg/L Akt激活剂胰岛素样生长因子1共同处理胃癌干细胞，Western blot检测细胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的表达，MTT检测细胞增殖活力，流式细胞术检测细胞凋亡。
结果与结论：①人胃癌SGC7901细胞在添加生长因子的无血清条件培养基中可分离培养出胃癌干细胞；②胃癌干细胞的增殖活力随着二甲双胍作用浓度增高和时间延长而降低(P < 0.05)；③胃癌干细胞的凋亡率随着二甲双胍作用浓度增高和时间延长而增高(P < 0.05)；④胃癌干细胞中Akt mRNA的表达随着二甲双胍作用浓度增高和时间延长而降低(P < 0.05)，PI3K mRNA的表达降低不明显；⑤与二甲双胍相比，Akt激活剂作用后胃癌干细胞增殖活力升高、凋亡率降低、Akt与p-Akt蛋白表达升高(P < 0.05)；⑥结果说明，二甲双胍可通过抑制Akt信号通路抑制胃癌干细胞增殖并诱导其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9142-6335(查璐琴)

关键词: 肿瘤干细胞, 胃癌干细胞, 胃癌, 二甲双胍, 细胞增殖, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Metformin can inhibit the proliferation of a variety of tumor stem cells, including gastric cancer stem cells, and target gastric cancer stem cells to provide a new idea for the clinical treatment of gastric cancer. However, the role and possible mechanism of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway in the proliferation of gastric cancer stem cells have not yet been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of metformin on the proliferation and apoptosis of gastric cancer stem cells as well as the role of PI3K/Akt signaling pathway.
METHODS: Gastric cancer stem cells were isolated and cultured from human gastric cancer cell line SGC7901. (1) Metformin with different concentrations (1, 5, 10 mmol/L) was used to treat gastric cancer stem cells for 24, 48 and 72 hours. MTT was used to detect cell proliferation, flow cytometry was used to detect cell apoptosis and R-qPCR was used to detect the expressions of PI3K and Akt mRNA in the cells. (2) The gastric cancer stem cells were treated with 8 mmol/L metformin and 100 mg/L Akt activator (insulin growth factor-1). Western blot assay was used to detect the expression of PI3K, Akt and phosphorylated Akt (p-Akt) protein. The proliferation activity and apoptosis of the cells were detected by MTT and flow cytometry, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Gastric cancer stem cells can be isolated from human gastric cancer SGC7901 cells by adding exogenous growth factors in serum-free conditions. The proliferative activity of gastric cancer stem cells decreased with the increasing concentration of metformin and prolonged time (P < 0.05). The apoptosis rate of gastric cancer stem cells increased with the increase of metformin concentration and the prolongation of time (P < 0.05). The expression of Akt mRNA in gastric cancer stem cells decreased with the increasing concentration of metformin and prolonged time (P < 0.05), but the expression of PI3K mRNA showed no marked reduction. Compared with metformin, the Akt activator increased the activity of gastric cancer stem cells, decreased the cell apoptosis, and elevated the expression of Akt and p-Akt (P < 0.05). These findings indicate that metformin can inhibit proliferation and induce apoptosis of gastric cancer stem cells by inhibiting the Akt signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stomach Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Metformin, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

查璐琴，韩本高，张超杰. 二甲双胍通过Akt通路调控胃癌干细胞的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 657-662.

Zha Luqin, Han Bengao, Zhang Chaojie. Metformin regulates proliferation and apoptosis of gastric cancer stem cells through the Akt pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 657-662.

图/表（结果） 5

2.1 胃癌干细胞的培养与鉴定结果 人胃癌SGC7901细胞在无血清条件培养基中悬浮培养6 d后，细胞聚集形成低黏附的三维球状细胞团，见图1A；随着培养时间的延长，肿瘤球由结构松散转变为致密，其体积和细胞数量均明显增加，呈现胃癌干细胞富集，见图1B；免疫荧光法检测肿瘤细胞球中干细胞标记物CD44呈高表达，见图1C；流式细胞术检测结果显示胃癌干细胞CD44的阳性率为89.73%，见图1D。以上结果说明添加生长因子的无血清条件培养基可以使胃癌干细胞富集，可进行后续实验。

2.2 二甲双胍抑制胃癌干细胞增殖 为了探讨二甲双胍对胃癌干细胞增殖的影响，用1，5，10 mmol/L二甲双胍分别处理胃癌干细胞24，48，72 h，应用MTT法检测胃癌干细胞的增殖活性，见图2。随着二甲双胍浓度增高和作用时间延长，胃癌干细胞的增殖活力逐渐降低。结果提示，二甲双胍对胃癌干细胞增殖活力具有明显的抑制作用，且呈时间与剂量依赖性。

2.3 二甲双胍诱导胃癌干细胞凋亡 为了进一步探讨二甲双胍对胃癌干细胞凋亡的影响，分别用1，5，10 mmol/L二甲双胍处理胃癌干细胞24，48，72 h，应用流式细胞仪检测二甲双胍诱导的胃癌干细胞凋亡情况，见图3。随着二甲双胍浓度增高和作用时间延长，胃癌干细胞的凋亡逐渐增多。结果提示，二甲双胍可诱导胃癌干细胞发生凋亡，且呈时间与剂量依赖性。

2.4 二甲双胍影响胃癌干细胞中PI3K和Akt mRNA的表达 用1，5，10 mmol/L二甲双胍分别处理胃癌干细胞 24，48，72 h，随后应用RT-qPCR检测PI3K和Akt mRNA表达的变化，见图4。结果显示，经二甲双胍处理后Akt mRNA的表达明显降低，PI3K mRNA降低不明显。

2.5 激活Akt信号通路影响二甲双胍对胃癌干细胞增殖与凋亡的作用 为了进一步探讨二甲双胍对Akt通路的影响，分别将胰岛素样生长因子1、二甲双胍、二甲双胍与Akt激活剂胰岛素样生长因子1作用于胃癌干细胞，用PBS作为对照：①应用Western blot检测PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的变化，结果显示经二甲双胍处理后p-Akt和Akt的表达明显降低，PI3K降低不明显；Akt激活剂胰岛素样生长因子1作用后，胃癌干细胞中Akt与p-Akt的表达明显升高，提示二甲双胍可降低Akt的表达并抑制其磷酸化，Akt激活剂能显著降低二甲双胍对p-Akt的抑制作用，见图5A；②应用MTT检测细胞增殖活力，结果显示二甲双胍与Akt激活剂联合应用组胃癌干细胞的增殖活力明显高于对照组，见图5B；③应用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示二甲双胍与Akt激活剂联合应用组胃癌干细胞的凋亡率明显低于对照组，见图5C。以上结果提示Akt激活剂能部分拮抗二甲双胍对胃癌干细胞增殖的抑制作用，而且能部分逆转二甲双胍诱导的胃癌干细胞凋亡。

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引言

胃癌是世界范围内引起癌症相关死亡的第二大原因^[1]。目前，临床治疗仍以手术结合常规化疗为主^[2]。近年来，国内外多项研究表明胃癌也具有异质性，包含参与肿瘤发生和增殖的细胞亚群，即胃癌干细胞，其数量并不因为手术治疗和(或)化疗而减少，相反还会出现富集现象^[3-4]。胃癌干细胞不仅具有与肿瘤干细胞相同的自我更新和不对称分裂性质，构成了胃癌组织分化的细胞起源，还具有与胚胎干细胞相同的分化潜能，可在体外培养条件下分化形成血管内皮样及腺体样结构^[5-6]。黄辉等^[7]通过对胃癌干细胞株和胃癌细胞株的同期培养与观察发现，胃癌干细胞除了具有较普通胃癌细胞更强的肿瘤发生与形成能力，还具有较强的迁移与侵袭能力，并通过分泌促进血管生长的相关因子直接或间接促进肿瘤血管的形成，从而在胃癌的抗药、复发、侵袭与转移中发挥主导作用。已有研究表明胃癌干细胞比已分化的普通胃癌细胞更能抵抗化疗药物的杀灭作用^[8]。因此，靶向胃癌干细胞为临床有效治疗胃癌提供新思路。

二甲双胍(Metformin，Met)是被临床上广泛应用的一种糖尿病起始治疗首选药物，具有抑制肝脏糖异生、增强骨骼肌葡萄糖摄取的作用^[9]。流行病学研究发现，应用二甲双胍治疗的糖尿病患者的癌症发病率明显低于未应用二甲双胍治疗的患者^[10]。根据这一发现，学者纷纷通过体内外实验探讨二甲双胍对不同类型肿瘤的抗癌活性^[11]。国内外研究团队先后证实二甲双胍对食管癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌等肿瘤细胞和肿瘤干细胞的增殖具有抑制作用^[12-15]。也有研究发现二甲双胍与化疗药物联合应用治疗乳腺癌、急性早幼粒细胞白血病、黑素瘤和神经胶质细胞瘤时可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性并直接诱导肿瘤细胞凋亡^[16-19]。至今，二甲双胍的抗癌机制研究主要集中在MAPK、AMPK/mTOR和PI3K/Akt信号通路^[20]。Scherbakov等^[21]研究发现Akt信号通路与乳腺癌二甲双胍抵抗有关，Akt信号通路可能成为克服抵抗的新靶点。Yu等^[22]研究证实二甲双胍可通过抑制Akt通路诱导神经胶质细胞瘤干细胞的凋亡。Shen等^[23]研究发现槲皮素通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导胃癌干细胞凋亡。涂江江等^[24]分别检测胃癌干细胞和胃癌细胞中PI3K、Akt的表达，发现胃癌干细胞中PI3K、Akt蛋白与mRNA的表达明显高于胃癌细胞，推测PI3K/Akt信号通路与胃癌进展密切相关。Courtois等^[25]通过体内外实验研究发现二甲双胍可能通过靶向胃癌干细胞来抑制肿瘤的生长。目前国内外尚未有关于二甲双胍能否通过调控PI3K/Akt信号通路途径发挥抑制胃癌干细胞自我更新的体外实验研究报道。基于此，该研究拟体外培养胃癌干细胞并进行鉴定，探讨二甲双胍是否通过PI3K/Akt信号通路影响胃癌干细胞的增殖与凋亡。

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材料方法

1.1 设计 体外细胞干预实验。

1.2 时间及地点 于2017年2月至2018年2月在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞 人胃癌SGC7901细胞株购于中国科学院(上海)细胞库。

1.3.2 实验试剂与仪器 二甲双胍(美国Sigma-Aldrich公司)；RPMI-1640培养基(美国Hyclone公司)；DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国PeproTech公司)；胰蛋白酶、MTT(美国Sigma-Aldrich公司)；Akt激活剂胰岛素样生长因子1(美国Selleck Chemicals公司)；表皮生长因子(以色列ProSpec公司)；碱性成纤维细胞生长因子(美国Amresco公司)；B27细胞培养添加剂(美国Invitrogen公司)；抗PI3K、Akt、p-Akt、β-actin抗体(美国Abcam公司)；抗CD44抗体(美国Santa Cruz公司)；DyLight 488 AffiniPure荧光二抗(美国Abcam公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒(日本Takara公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；CO₂细胞培养箱(美国Thermo公司)；凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；酶标仪(美国Thermo公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；ABI 7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人胃癌SGC7901细胞培养 将复苏后的SGC7901细胞以1×10⁴的密度移入培养瓶中，加入3 mL含有体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中常规培养，每日换液，待细胞贴壁生长至铺满瓶底85%后，胰酶消化并传代。

1.4.2 胃癌干细胞培养 根据文献[25]报道的方法，将人胃癌SGC7901细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，PBS洗涤3次，DMEM/F12培养基洗涤1次，以每孔100个的密度将细胞接种于24孔板，加入含20 μg/L表皮细胞生长因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和2%B27的DMEM/F12培养基对细胞进行常规培养，每隔2 d换液30%，倒置相差显微镜下观察细胞富集成球后按照1∶3进行传代。

1.4.3 胃癌干细胞鉴定 参照文献[26]应用免疫荧光法检测干细胞标记物CD44。取上述传至第3代的肿瘤细胞球，用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于6孔培养板，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养，12 h后取出细胞吸去培养液，PBS漂洗5次，预冷丙酮室温固定10 min，PBS洗涤3次，体积分数为10%山羊血清室温封闭30 min，弃去血清，滴加兔抗人CD44抗体(工作浓度1∶50)4 ℃避光孵育过夜，次日平衡至室温，滴加荧光标记山羊抗兔二抗，室温避光孵育60 min，荧光显微镜下观察并摄片。

1.4.4 流式细胞术检测CD44⁺胃癌干细胞比例 根据文献[27]报道方法，取第3代肿瘤细胞球，用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，PBS洗涤，与CD44抗体一起冰上孵育30 min，PBS洗涤，1 000 r/min离心3 min，流式细胞仪检测CD44⁺细胞比例。

1.4.5 MTT法检测二甲双胍对胃癌干细胞增殖活性的影响 取第3代胃癌干细胞制成细胞悬液，以1×10⁵ L^-1细胞浓度接种于96孔板，每孔100 μL，常规培养24 h，换液去除悬浮细胞，分别加入终浓度为1，5，10 mmol/L的二甲双胍溶液，继续培养24，48，72 h，不同药物浓度和时间点分别设5个复孔。药物干预结束的不同时间点，分别取出96孔板，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，以二甲基亚砜为空白对照，避光孵育4 h后每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液，室温轻摇10 min，酶标仪在570 nm波长处检测各孔吸光度值，计算相对增殖率。

1.4.6 流式细胞术检测二甲双胍对胃癌干细胞凋亡的影响 取第3代胃癌干细胞制成细胞悬液，以1×10¹⁰ L^-1的细胞浓度接种于培养瓶中，常规培养24 h，换液去除悬浮细胞，分别加入终浓度为1，5，10 mmol/L的二甲双胍溶液，继续培养24，48，72 h，不同药物浓度和时间点分别设3个复瓶。药物处理结束的不同时间点，取出培养瓶，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，1 500 r/min离心5 min收集细胞至离心管中，PBS洗涤3次，每个离心管内加入1 mL预冷的体积分数为70%乙醇4 ℃固定，24 h后1 000 r/min离心3 min，弃上清，加入1 mL预冷PBS将细胞悬浮均匀；上机前，每个离心管内加入0.5 mL碘化丙啶进行染色，37 ℃避光孵育30 min，应用流式细胞仪在488 nm波长处检测细胞凋亡情况。

1.4.7 RT-qPCR检测二甲双胍对胃癌干细胞PI3K和Akt mRNA表达的影响 取第3代胃癌干细胞制成细胞悬液，以1×10¹⁰L^-1的细胞浓度接种于培养瓶中，常规培养24 h，换液去除悬浮细胞，分别加入终浓度为1，5，10 mmol/L二甲双胍溶液，继续培养24，48，72 h，收集细胞，加入Trizol进行冰上裂解，严格按RNA提取步骤提取总RNA，然后用反转录试剂盒获取cDNA；参照SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒说明书，分别以PI3K、Akt为引物，β-actin为内参，反应体系为20 μL，在ABI7500型实时定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。引物如下，PI3K：5'-CAT CAC TAC GTG CTG CTC TAA-3'，3'-CAG TAG TTC CGA TTG TTC ATG-5'；Akt：5'-GCT GAT GGC GCA TGC TGA CA-3'，3'-CGG TGC GTC AGC TCG ATC AT-5'；β-actin：5'- CAG TGT CAT GCC GTA CAG CT-3'，3'-TGA ACA GCA ATC GCT ATC AC-5'。

1.4.8 Akt通路激活剂对胃癌干细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响 取第3代胃癌干细胞制成细胞悬液，以1×10¹⁰ L^-1的细胞浓度接种于培养瓶中，常规培养24 h，分别将100 mg/L Akt激活剂胰岛素样生长因子1、8 mmol/L二甲双胍、8 mmol/L二甲双胍+100 mg/L Akt激活剂胰岛素样生长因子1加入培养基中，等体积PBS作为对照，继续常规培养24 h后收集细胞，分别采用上述MTT法和流式细胞术检测胃癌干细胞的增殖与凋亡；应用Western blot法检测胃癌干细胞中PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达，收集各组胃癌干细胞放入离心管内，加入预冷的全细胞裂解液冰上裂解细胞5 min，12 000 r/min离心5 min，小心吸取上清液，用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，然后用煮沸法使其变性，将40 μg蛋白上样进行10% SDS-PAGE电泳、硝酸纤维素膜转印、3%脱脂牛奶封闭30 min，加入PI3K(1∶200)、Akt(1∶200)、p-Akt(1∶200)和β-actin(1∶1 000)抗体4 ℃孵育，次晨弃去一抗加入特异性二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，应用增强型化学发光试剂盒在凝胶成像仪中进行显色，并用Quantiy One软件分析条带灰度，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值进行半定量分析。

1.5 主要观察指标 ①细胞增殖活力；②细胞凋亡；③PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达；④PI3K和Akt mRNA的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计分析，应用GraphPad Prism 6.0软件进行绘图；计量数据采用x(_)±s表示，两组间比较用t 检验，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

胃癌干细胞的发现为胃癌治疗策略的发展提供了新视角。虽然近年来对胃癌干细胞的自我更新途径、化疗抵抗机制、microRNA表达谱等特性有了深入研究，但通过化合物有效控制胃癌干细胞生长的研究有限。王一等^[28]将人胃癌细胞系MKN45作为亲本细胞，观察二甲双胍对细胞的作用，发现二甲双胍不仅抑制胃癌干细胞的生长，还抑制细胞中Akt基因的表达，但没有深入探讨二甲双胍对胃癌干细胞的影响及可能机制。此研究将人胃癌SGC7901细胞株作为亲本细胞，应用添加生长因子的无血清培养基培养CD44⁺胃癌干细胞，阳性率达到(85.2±7.9)%，表明富集的胃癌干细胞可作为靶细胞用于二甲双胍抗胃癌作用的研究^[29-30]。

目前，二甲双胍对乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和卵巢癌等治疗的临床试验正在进行^[11]，但二甲双胍能否作为胃癌治疗药物以及如何具体应用还需要深入的药理学研究和长期的大样本临床试验^[31]。根据以往的研究结果选取影响非糖尿病患者血糖水平的临界剂量为最大作用浓度^[32]，依次设定浓度梯度，MTT结果显示，胃癌干细胞经1 mmol/L二甲双胍作用72 h后细胞增殖活力开始较对照组明显降低； 5 mmol/L二甲双胍作用48 h后细胞增殖活力明显低于对照组，作用72 h后细胞增殖活力明显低于作用48 h；10 mmol/L二甲双胍作用24 h后细胞增殖活力即明显低于对照组，并呈时间依赖性；说明低浓度二甲双胍随着作用时间的延长可以抑制胃癌干细胞的增殖，高浓度二甲双胍对胃癌干细胞增殖的抑制作用随作用时间的延长而增强，提示二甲双胍对胃癌干细胞的增殖抑制作用呈剂量与时间依赖性。张群慧等^[33]研究发现二甲双胍诱导结肠癌细胞周期阻滞及凋亡发生也是其潜在抗癌机制。于是，此研究应用流式细胞仪检测胃癌干细胞的凋亡情况，结果与MTT结果一致，胃癌干细胞的凋亡率随着二甲双胍作用浓度的增高和作用时间的延长而增加，10 mmol/L二甲双胍作用72 h后，细胞凋亡率达到最大，说明二甲双胍诱导胃癌干细胞凋亡也呈剂量与时间依赖性。

大量研究证实，PI3K/Akt信号通路参与细胞的增殖、凋亡等重要活动的调节，其调控的失衡与多种肿瘤的发生、发展及耐药密切相关，已成为值得深入研究的治疗靶点^[34]。关于二甲双胍作用于胃癌干细胞是否抑制Akt通路的活性，以及Akt信号通路的抑制是否进一步诱导胃癌干细胞发生凋亡的报道较少。RT-qPCR结果验证了胃癌干细胞中Akt mRNA的表达也随二甲双胍作用浓度的升高和作用时间的延长而降低，但PI3K的变化并不明显，提示二甲双胍可能抑制Akt的表达发挥负性调控Akt信号通路活性的作用。Akt蛋白处于该信号通路的中心位置，经磷酸化后被激活形成p-AKT，后者进一步使多个Akt下游蛋白发生磷酸化，从而调控肿瘤细胞的增殖与凋亡等^[35]。Akt蛋白水平的高低可准确反映Akt信号通路的激活情况^[36]。为了进一步证实二甲双胍抑制Akt磷酸化是否通过Akt信号通路介导，此研究使用Akt激活剂胰岛素样生长因子1进行验证。研究结果显示，胰岛素样生长因子1可以提高胃癌干细胞中Akt和p-Akt蛋白表达，明显减弱二甲双胍对细胞中Akt和p-Akt的抑制作用，说明二甲双胍下调胃癌干细胞中p-Akt蛋白的表达是通过抑制Akt信号通路实现的。

总之，二甲双胍具有抑制胃癌干细胞生长的潜力，并通过抑制Akt信号通路发挥增殖抑制与凋亡诱导作用，胃癌干细胞可能成为二甲双胍的潜在治疗靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程