脂肪间充质干细胞来源外泌体对角质形成细胞增殖和迁移的影响与机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1527

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
外泌体：为直径30-120 nm的微小囊泡，在生理或病理条件下，由细胞内膜以出芽形式形成的多泡体，参与细胞间的信息交流及多种生理或病理过程。现有研究已证明，间充质干细胞来源外泌体在减少心肌损伤、促进神经再生及免疫调节等方面具有重要作用，预示间充质干细胞来源外泌体具有潜在的治疗前景。
角质形成细胞：表皮的主要成分，能够不断的分化与更新，从而使新生的细胞与脱落的角质细胞保持平衡，以达到维持表皮正常厚度。在创面愈合过程中，角质形成细胞发挥着重要作用，因此，深入研究角质形成细胞增殖与迁移，对皮肤生物学和促进创面愈合具有重要的意义。

摘要
背景：皮肤烧烫伤是一类非常常见且致死和致残率极高的疾病，探索有效促进伤口愈合的方法意义重大。
目的：探讨脂肪间充质干细胞来源外泌体是否对角质形成细胞增殖与迁移产生影响及其潜在机制。
方法：采用胰酶消化法培养人角质形成细胞，并利用角质形成细胞特异标记蛋白Keratin 14进行鉴定；超速离心法分离人脂肪间充质干细胞来源外泌体，并利用外泌体特异标记蛋白CD9、CD63和CD81进行鉴定；将纯化好的脂肪间充质干细胞来源外泌体，以不同质量浓度(0，10，20，50，100 mg/L)加入第3代角质形成细胞中，在处理的不同时间点(0，12，24，48 h)进行增殖和迁移相关指标检测。
结果与结论：脂肪间充质干细胞来源外泌体促进角质形成细胞增殖和迁移，在质量浓度为50 mg/L和处理48 h时增殖最显著，脂肪间充质干细胞来源外泌体可能通过调控ERK、AKT和STAT3蛋白的磷酸化而促进角质形成细胞增殖与迁移。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9739-8796(田新立)

关键词: 脂肪间充质干细胞, 外泌体, 角质形成细胞, 细胞增殖, 细胞迁移, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Skin wounds caused by burns and scalds are diseases of high morbidity and mortality rate, and it is urgent to find an effective way to facilitate wound healing.
OBJECTIVE: To investigate whether adipose-derived mesenchymal stem cell exosomes can vary the proliferation and migration of keratinocytes and the potential mechanisms.
METHODS: Human keratinocytes were cultured using trypsin digestion method, and identified by detection of keratinocyte specific marker protein Keratin 14. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells were obtained by ultracentrifugation and identified by the exosome specific marker proteins CD9, CD63 and CD81. The purified exosomes were added to keratinocytes at different concentrations (0, 10, 20, 50, 100 mg/L) to detect the proliferation and migration of keratinocytes at different time points (0, 12, 24, 48 hours).
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived mesenchymal stem cell exosomes facilitated the proliferation and migration of keratinocytes. The greatest improvement in the proliferation of keratinocytes was detected when the mass concentration was 50 g/mL after 48 hours of treatment. Meanwhile, the phosphorylation of ERK, AKT and STAT3 was strengthened with the existence of exosomes, indicating that adipose-derived mesenchymal stem cell exosomes may promote the proliferation and migration of keratinocytes through promoting the phosphorylation of ERK, AKT and STAT3.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Keratinocytes, Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Exosomes, Cell Proliferation, Cell Movement, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

田新立，江波，颜洪. 脂肪间充质干细胞来源外泌体对角质形成细胞增殖和迁移的影响与机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(1): 68-73.

Tian Xinli, Jiang Bo, Yan Hong. Effect of adipose-derived mesenchymal stem cell exosomes on the proliferation and migration of keratinocytes and the underlying mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(1): 68-73.

图/表（结果） 1

2.1 人ADSCs和人角质形成细胞的分离和鉴定结果 分离出的ADSCs呈成纤维样形状，且增殖率高，见图1A。为了进一步确定分离细胞即为ADSCs，对细胞进行成脂诱导分化培养2周，油红O染色呈阳性，见图1B。

第3代人角质形成细胞均分裂活跃，胞体饱满，个体较小呈骰子状，细胞形态均一性好，见图1C。进一步通过角质形成细胞特异标记蛋白Keratin14免疫荧光染色鉴定，提示所分离的细胞为角质形成细胞，见图1D。

2.2 人ADSCs来源外泌体的鉴定结果 利用超速离心法分离ADSCs来源外泌体，通过免疫印迹法检测外泌体特异标记蛋白CD9、CD63和CD81表达，见图2。分离的外泌体表达CD9、CD63和CD81，而ADSCs并未或者很少表达外泌体特异标记蛋白，表明成功分离出ADSCs来源外泌体。

2.3 人ADSCs来源外泌体对角质形成细胞增殖的影响 角质形成细胞分别加入不同质量浓度(10，20，50，100 mg/L) ADSCs来源外泌体培养48 h后，采用MTT法检测各组细胞的体外增殖情况，见图3A，在加入外泌体后，角质形成细胞的增殖速度显著高于PBS阴性对照组，且呈浓度依赖性增长，在质量浓度为50 mg/L时增殖最显著；随后加入50 mg/L ADSCs来源外泌体培养0，12，24，48 h，采用MTT法检测各组细胞的体外增殖情况，见图3B，外泌体能够显著促进角质形成细胞增殖，且随着时间的增加而增加。

为进一步验证上述实验结果，角质形成细胞分别加入PBS和50 mg/L ADSCs来源外泌体培养48 h后，采用免疫印迹法检测细胞增殖标记物ki-67的表达水平，得到与MTT法相似的结果，见图3C和3D。以上结果提示，人ADSCs来源外泌体可以显著促进角质形成细胞在体外的增殖。

2.4 人ADSCs来源外泌体对角质形成细胞迁移的影响 角质形成细胞加入50 mg/L ADSCs来源外泌体培养，利用细胞划痕法观察24 h和48 h后各组细胞的迁移情况，见图4，在加入外泌体后，角质形成细胞的迁移速度显著高于PBS阴性对照组，且随着时间的增加而增加。以上结果提示，外泌体可以显著促进角质形成细胞的迁移。

2.5 人ADSCs来源外泌体对角质形成细胞相关信号通路蛋白的影响 研究发现，ERK1/2、AKT和STAT3信号通路在创面愈合过程中起到重要的作用，包括细胞增殖、迁移和血管生成等^[26]。因此，实验检测ADSCs来源外泌体是否通过ERK1/2、AKT和STAT3信号通路进而影响其增殖与迁移，见图5。角质形成细胞加入50 mg/L ADSCs来源外泌体培养48 h后，ERK1/2、AKT和STAT3的磷酸化水平显著高于PBS阴性对照组。以上结果提示，外泌体可能通过ERK1/2、AKT和STAT3信号通路进而影响其增殖与迁移。

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引言

皮肤的烧烫伤是一类非常常见且致死率和致残率极高的疾病^[1]，其不但破坏了皮肤正常的屏障功能，而且还损伤了皮肤的痛温觉和触觉等生理功能^[2]，给患者造成极大痛苦，也给家庭和社会带来沉重的经济和社会负担^[3]。然而遗憾的是，在目前技术水平和治疗条件下，仍有近半数患者伤口无法及时愈合而形成病理性瘢痕等后遗症，尚缺乏有效的治疗方法^[4]。创面再上皮化是一个以角质形成细胞为主导的多因素协同作用的过程，能否实现再上皮化对创面愈合转归有着重要的影响^[5]。在此过程中，作为表皮的主要构成细胞，角质形成细胞不仅从伤口周围向伤口处迁移并大量增殖而覆盖创面，其同时还分泌各种细胞因子和生长因子来调节整个愈合过程^[6]。伤口的愈合过程涉及细胞迁移、增殖、血管形成、胞外基质的形成和组织重构等一连串复杂的分子机制和细胞学行为^[7-9]。但事实上，经久不愈的伤口往往存在生长因子和趋化因子减少^[10]，血管生成能力、细胞增殖和迁移能力下降等不利因素^[11-12]。因此，急需找到新的方法来逆转这些病理性变化而促进伤口的愈合。

间充质干细胞因其具有分离方便、低免疫排斥性、可转分化以及可为组织再生提供适宜环境等特性而成为再生医学领域极具应用前景的一类细胞^[13-14]。脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)就是其中重要的细胞之一，据文献报道，在皮肤受到创伤后，ADSCs可迅速被趋化至伤口部位并通过直接的细胞间接触以及旁分泌各种细胞因子和生长因子等方式促进伤口的愈合^[15-16]。而且后续的研究证实ADSCs条件性培养液可促进参与伤口愈合过程的成纤维细胞的迁移和增殖^[17]。然而对于角质形成细胞，ADSCs是否可以促进其增殖和迁移以及其分子机制，目前仍不清楚。

外泌体为直径30-120 nm的微小囊泡，在生理或病理条件下，由细胞内膜以出芽形式形成的多泡体^[18-19]，参与细胞间的信息交流及多种生理或病理过程^[20-21]。根据现有研究结果，外泌体被认为是细胞之间沟通的一种新机制^[22]，对急性肾小管损伤、肝纤维化等具有保护作用^[23-24]，同时其还具有促进神经突起生长的作用^[25]。因此，作者推测ADSCs旁分泌的外泌体很可能是ADSCs影响角质形成细胞迁移和增殖的重要机制。此外，由于外泌体成分复杂，其在不同损伤条件下介导的下游分子信号通路亦会有所不同，此次研究将对其影响角质形成细胞迁移和增殖的潜在分子机制加以探索。

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材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3月至2018年3月在西南医科大学附属医院整形烧伤外科完成。

1.3 材料 新鲜皮肤组织块和脂肪组织分别来源于西南医科大学附属医院就诊的自体皮肤移植患者[6例，年龄(20±10)岁]和抽脂患者[6例，年龄(30±10)岁]。所有患者及家属被告知该研究的目的和程序，并签署了知情同意书，研究方案经西南医科大学附属医院伦理委员会批准。

实验试剂和仪器：PBS、Dispase酶、胰蛋白酶、胎牛血清、角质形成细胞专用培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基(美国GIBCO公司)；Keratin 14、CD9、CD63、CD81、ki-67、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3抗体(美国Abcam公司)；Anti-Rabbit荧光二抗和GAPDH(北京中山金桥公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)；BCA蛋白试剂盒和MTT(上海碧云天公司)；丝裂霉素C(美国Invitrogen公司)；成脂诱导液(苏州赛业生物公司)；荧光显微镜FSX100(日本奥林巴斯公司)；超速离心机(美国Beckman公司)；酶标仪(美国Thermo公司)；凝胶成像仪(美国Alpha Innotech公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人角质形成细胞分离与培养 选取自体头部皮肤移植手术后剩余的完整皮肤组织，面积约3 cm²，使用含有青霉素和链霉素的PBS清洗3次，放入含有Dispase酶的15 mL离心管中4 ℃过夜，分离表皮和真皮组织后，将表皮置于含有0.05%胰蛋白酶的离心管中37 ℃消化约15 min，期间每两三分钟吹打数次，加入含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，180×g转速离心5 min，重悬细胞，细胞计数后，将3×10⁶细胞铺于T75培养瓶中，使用角质形成细胞专用培养基KSFM进行培养，每2 d换液，待细胞完全汇合后进行传代培养。

1.4.2 人角质形成细胞免疫荧光鉴定 人角质形成细胞培养约3代后，接种于有无菌盖玻片的培养板中培养过夜，加入40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3遍，每次5 min；0.5% Triton X-100打孔5 min，PBS洗3遍，每次5 min；1% BSA室温孵育30 min后，加入1∶100稀释的Anti-Keratin 14抗体4 ℃孵育过夜，PBS洗3遍，每次5 min；1∶100稀释的Anti-Rabbit荧光二抗室温避光孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min；用抗淬灭封固剂封固，荧光显微镜下观察。

1.4.3 人ADSCs分离与培养 选取抽脂术后的脂肪组织，使用含有青霉素和链霉素的PBS清洗3次，用0.5%Ⅰ型胶原酶37 ℃恒温摇床震荡消化约40 min，过滤除去未消化的组织，1 000 r/min离心5 min，用含有体积分数为10%胎牛血清和青-链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，于体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱中培养，3 d后换液，当细胞密度达到80%时进行传代。

1.4.4 人ADSCs成脂诱导分化 将第3-5代脂肪间充质干细胞以1×10⁷L^-1细胞浓度接种于6孔板中，每3 d换液，直至细胞达到100%融合，移去培养基，加入成脂诱导液开始诱导，诱导约2周，可观察到脂滴形成，利用油红O进行脂滴染色。

1.4.5 超速离心法分离人ADSCs来源外泌体 胎牛血清经100 000×g离心3 h并过滤后进行预处理。选取第3-5代ADSCs，当细胞汇合度达60%-80%，加入含有体积分数为10%预处理胎牛血清的DMEM/F12培养基培养48-72 h，收集细胞上清，利用超速离心法分离外泌体，首先2 000×g 4 ℃离心20 min去除细胞，10 000×g 4 ℃离心30 min去除细胞碎片，100 000×g 4 ℃离心70 min后，上清为无外泌体培养基，移去并保存，利用1 mL PBS重悬沉淀后，100 000×g 4 ℃离心70 min，100 μL PBS重悬沉淀，利用BCA蛋白试剂盒检测其浓度。

1.4.6 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达 ADSCs来源外泌体与ADSCs分别进行外泌体特异蛋白鉴定，加入细胞裂解缓冲液，冰上裂解细胞10 min，12 000 r/min离心10 min，提取蛋白质，采用BCA试剂盒进行蛋白定量，具体步骤：将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL，相当于标准品质量浓度分别为0，0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L，加适当体积样品到96孔板的样品孔中。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20-30 min。用酶标仪测定562 nm波长处吸光度值，根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。将测定好的样品煮沸变性，取等量样品以10%的SDS-PAGE进行电泳，将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜浸泡于5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，加入CD9、CD63和CD81抗体(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的特异性二抗(1∶5 000)室温摇床孵育1 h，1×TBST漂洗3遍，每遍5 min，加入化学发光底物并在凝胶成像系统进行显影，用Image J软件对条带灰度进行分析。

1.4.7 MTT法检测角质形成细胞增殖能力 将第3代角质形成细胞分别加入0，10，20，50，100 mg/L ADSCs来源外泌体培养48 h，以加入PBS为阴性对照组，移去培养液，加入0.5 g/L MTT 37 ℃孵育4 h，弃去MTT后加入150 μL二甲基亚砜，避光条件下培养板剧烈摇晃10 min，并利用酶标仪测试570 nm波长下的吸光度值。

将第3代角质形成细胞分别加入PBS和50 mg/L ADSCs来源外泌体培养0，12，24，48 h后，同上步骤进行MTT法检测细胞增殖情况，每组实验至少重复3次并收集数据。

1.4.8 细胞划痕实验观察角质形成细胞迁移情况 将第3代角质形成细胞以1.2×10⁶/cm²密度铺于12孔板中，培养过夜后，加入10 mg/L丝裂霉素C处理1 h，利用200 µL无菌枪头对细胞进行划痕，PBS洗3-5遍后，分别加入含有 50 mg/L ADSCs来源外泌体或等体积PBS的KSFM培养基进行培养，0，24，48 h利用倒置显微镜观察细胞迁移情况并照相。

1.4.9 细胞增殖和相关通路蛋白表达鉴定 第3代角质形成细胞通过50 mg/L外泌体处理48 h后，移去培养液，裂解细胞提取蛋白质后，具体处理步骤如1.4.6，加入ki-67、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3和GAPDH抗体(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，再用特异性二抗(1∶5 000)室温摇床孵育1 h，1×TBST漂洗3遍后，加入化学发光底物并在凝胶成像系统进行显影，Image J软件对条带灰度进行分析。通过计算各组目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白GAPDH灰度值的比值，对目的蛋白进行半定量并比较各组间表达水平的差异。

1.5 主要观察指标 ①人角质形成细胞和人ADSCs形态；②细胞免疫荧光和成脂分化实验鉴定细胞；③MTT法观察ADSCs来源外泌体干预后角质形成细胞增殖情况；④蛋白免疫印迹检测ADSCs来源外泌体干预后角质形成细胞增殖和相关通路蛋白表达；⑤细胞划痕实验观察ADSCs来源外泌体干预后角质形成细胞迁移水平变化。

1.6 统计学分析 实验数据用Image J软件进行采集，利用统计分析软件GraphPad Prism分析，所得数据用x(_)±s表示，采用t 检验或单因素方差分析进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

实验探索了ADSCs外泌体是否能够影响角质形成细胞的增殖和迁移，并对其分子机制进行了初步探索。结果显示，ADSCs外泌体可显著促进角质形成细胞在体外的增殖和迁移，且该过程可能与相关通路的磷酸化水平改变有关。

外泌体作为细胞的重要组成成分，近年来已被证实为细胞和细胞之间沟通的全新机制^[27]。现有的研究表明外泌体是由信使RNA、小RNA和各种蛋白质等多种成分组成的复合体^[20^，^28]。前期文献报道提示间充质干细胞外泌体可通过向临近靶细胞传递信使RNA和小RNA来促进受损组织的修复^[22^，^29]。同时，激活的蛋白也可被外泌体转移至靶细胞并产生相应的生物学效应^[30-31]。在该研究中，作者首先在体外分离出ADSCs，然后利用超速离心法分离出外泌体，并且检测到了CD9、CD63和CD81等外泌体标记分子的表达，结果表明成功分离出了ADSCs外泌体。近年来，外泌体因为被发现在多种疾病模型中充当了间充质干细胞旁分泌介质的作用而受到学术界高度关注，目前已有的文献报道提示这些外泌体分别在减少心肌梗死面积、减轻急性肾小管损伤、促进卒中后的功能恢复以及缓解急性肺损伤之后的炎性反应等方面均扮演着重要的角色^[27^，^32-34]。尤其重要的是，除了以上作用，间充质干细胞外泌体还被发现可促进成纤维细胞的增殖和迁移^[35]。因此，鉴于外泌体对皮肤愈合的促进作用和角质形成细胞在伤口愈合中的关键角色，作者推测ADSCs外泌体很可能也会通过影响角质形成细胞的生物学行为(如增殖、迁移)而影响皮肤伤口的愈合。而在该研究中，细胞划痕和MTT实验结果分别提示，在外泌体存在的条件下，角质形成细胞在体外的迁移和增殖速度较阴性对照组显著提高。这些结果证明了ADSCs外泌体的确可促进角质形成细胞在体外的迁移和增殖，这与作者的推测一致。

伤口愈合是一个极其复杂的过程，其需要众多细胞的增殖、迁移以及大量的分泌物，而这一切均得益于一系列重要分子通路的激活和参与。已有报道提示，MAPK通路、Wnt通路和mTOR通路等均在伤口愈合过程中扮演了重要角色^[36-39]。外泌体作为一种特殊的细胞间信号通路，其本身也可以诱导细胞内一系列重要信号通路的激活，包括AKT、STAT3和ERK等，这些信号通路被激活之后可上调靶细胞中各类生长因子(例如肝细胞生长因子、白细胞介素6、胰岛素样生长因子1、神经生长因子等)的表达^[40]。因此在该研究中同样也检测了外泌体存在和去除条件下ERK1/2、AKT和STAT3的表达，结果显示外泌体存在条件下，角质形成细胞内ERK1/2、AKT和STAT3的磷酸化水平较阴性对照组显著增高，这与前期Shabbir等^[35]在成纤维细胞实验中报道的结果基本一致。从该研究及前期研究结果看，外泌体对细胞生物学行为(如增殖、迁移)的影响及其分子机制，似乎有一定共性而不是细胞特异的，这一重要特点将为外泌体应用于生物学其他领域以及不同疾病的治疗提供潜在可能。在该研究条件下外泌体激活了ERK1/2、AKT和STAT3等重要信号通路，由于这些信号的激活可促进各类生长因子的表达进而促进细胞的生长和增殖等，作者推测这很可能就是外泌体促进角质形成细胞在体外迁移和增殖的重要分子机制。

总之，该研究证明ADSCs外泌体可以显著促进角质形成细胞在体外的增殖和迁移。同时，还发现ADSCs外泌体促进角质形成细胞在体外的增殖和迁移可能是通过激活ERK1/2、AKT和STAT3等信号通路来实现的。基于上述实验结果，并结合国内外文献报道，有理由相信间质细胞来源外泌体很可能是未来促进伤口愈合的一种安全且有效的重要介质。尽管如此，外泌体中具体何种成分在其中发挥了作用，相关分子通路磷酸化水平上下游调控机制等仍待更深入的研究加以阐明。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程