膝关节应力负荷减少对小鼠早期骨关节炎软骨和软骨下骨的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1432

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (35): 5611-5618.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1432

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膝关节应力负荷减少对小鼠早期骨关节炎软骨和软骨下骨的影响

邵毅杰1，姜华晔1，高超1，罗宗平2，杨惠林1

(1苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215000；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215000)

收稿日期:2019-05-16 出版日期:2019-12-18 发布日期:2019-12-18
通讯作者: 罗宗平，特聘教授，苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215000 通讯作者：杨惠林，主任医师，博士生导师，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215000
作者简介:邵毅杰，男，1993年生，江苏省苏州市人，汉族，在读硕士，主要从事骨关节炎的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81320108018，31570943，31270995)，项目负责人：罗宗平

Effect of reduction of mechanical loading on subchondral bone and articular cartilage of early osteoarthritis in mice

Shao Yijie1, Jiang Huaye1, Gao Chao1, Luo Zongping2, Yang Huilin1

(1the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 2Institute of Orthopedics at Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China)

Received:2019-05-16 Online:2019-12-18 Published:2019-12-18
Contact: Luo Zongping, Professor, Institute of Orthopedics at Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Corresponding author: Yang Huilin, Chief physician, Doctoral supervisor, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
About author:Shao Yijie, Master candidate, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81320108018, 31570943, and 31270995 (all to LZP)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
膝关节应力负荷：正常膝关节维持软骨的生理稳态依赖于合适的膝关节应力负荷，应力负荷被认为是骨骼肌肉组织的调节器，过大或过小的应力负荷都会对关节软骨和软骨下骨产生不利影响。
骨关节炎：是目前全世界患病率较高的慢性进展性疾病，影响主要的负重关节(如髋关节、膝关节)，引起关节软骨退变、软骨下骨重塑、滑膜炎症及骨赘形成。最新研究表明，机械应力在骨关节炎的发病进展中起着重要的作用。正常的关节负荷以及活动所产生的适度机械应力有助于维持关节软骨的合成及分解代谢。过度的关节负荷会引起软骨细胞的分解代谢增加，导致软骨的软化、纤维化及溃疡形成，最终导致软骨丢失，引起骨性关节炎。

摘要
背景：骨关节炎目前在全球发病率较高，但其内在发病机制研究仍不透彻。
目的：探究膝关节应力负荷减少对早期骨性关节炎小鼠软骨和软骨下骨的影响。
方法：经苏州大学附属第一医院实验动物伦理委员会批准，选取48只雄性成年(8周龄)C57BL/6小鼠，随机分为正常组、关节炎模型组、运动神经切断+模型组以及运动神经切断+假手术组，每组12只。骨关节炎造模前1周进行胫神经联合腓总神经横断，造模后4，8周每组分别处死6只小鼠，收集每组小鼠的右侧膝关节标本，分别进行Micro-CT扫描、组织学染色、足印分析及肌肉萎缩检测。
结果与结论：①造模后4周及8周，运动神经切断+模型组中骨体积分数值低于关节炎模型组(P < 0.05)。运动神经切断+模型组骨体积分数值与运动神经切断+假手术组差异无显著性意义(P > 0.05)。造模后8周运动神经切断+模型组骨体积分数值高于造模后4周(P < 0.05)；②造模后4周及8周，运动神经切断+模型组中的OARSI评分低于关节炎模型组(P < 0.05)。造模后8周，运动神经切断+模型组中的OARSI评分高于造模后4周(P < 0.05)；③相比于关节炎模型组，造模后4周及8周运动神经切断+模型组中后足足宽减少(P < 0.05)；右胫前肌及右小腿三头肌湿质量减少(P < 0.05)；④结果表明，膝关节负荷减少后，小鼠软骨下骨骨量明显降低，关节软骨层厚度减少，提示适宜的关节负荷对维持关节软骨和软骨下骨的稳态有着重要的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-8655-1513(杨惠林)

关键词: 骨关节炎, 应力负荷, 关节软骨, 软骨下骨, Micro-CT, 足印分析, 骨体积分数, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Osteoarthritis has a high incidence in the world, but its underlying pathogenesis is still not thoroughly studied.
OBJECTIVE: To investigate the effect of reduction of mechanical loading on subchondral bone and articular cartilage of early osteoarthritis in mice.
METHODS: The study was approved by the Laboratory Animal Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Soochow University. Forty-eight male adult C57BL/6 mice (8 weeks old) were randomly divided into normal group, osteoarthritis model group, motor nerve transection+osteoarthritis model group, and motor nerve transection+sham group, 12 mice in each group. We simulated the reduction of mechanical loading in knee joint via tibial nerve combined with common peroneal nerve transection, which was performed at 1 week before the osteoarthritis induction. Six mice in each group were sacrificed at 4 and 8 weeks after modeling. The right knee joints of each group were collected for micro-CT scanning, histological staining, footprint analysis and muscle atrophy detection, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The bone volume fraction in the motor nerve transection+osteoarthritis model group was lower than that in the osteoarthritis model group at 4 and 8 weeks after modeling (P < 0.05). There was no significant difference in the bone volume fraction between motor nerve transection+osteoarthritis model and motor nerve transection+sham groups (P > 0.05). The bone volume fraction in the motor nerve transection+osteoarthritis model group was increased significantly at 8 weeks compared with that at 4 weeks after modeling (P < 0.05). (2) The OARSI score in the motor nerve transection+osteoarthritis model group was lower than that in the osteoarthritis model group at 4 and 8 weeks (P < 0.05). OARSI score in the motor nerve transection+osteoarthritis model group at 8 weeks was higher than that at 4 weeks after modeling (P < 0.05). (3) Compared with the osteoarthritis model group, the hindfoot base widths in the motor nerve transection+osteoarthritis model group at 4 and 8 weeks were decreased significantly (P < 0.05), and the wet weights of the right tibial anterior muscle and the calf triceps muscle were decreased (P < 0.05). (4) These results indicate that reduction of mechanical loading in knee joint induced by peripheral motor nerve transection leads to bone loss of subchondral bone and reduction thickness of articular cartilage layer, suggesting that the appropriate joint mechanical loading plays an important role in maintaining the homeostasis of articular cartilage and subchondral bone.

Key words: osteoarthritis, mechanical loading, articular cartilage, subchondral bone, micro-CT, footprint analysis, bone volume fraction, the National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

邵毅杰，姜华晔，高超，罗宗平，杨惠林. 膝关节应力负荷减少对小鼠早期骨关节炎软骨和软骨下骨的影响[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(35): 5611-5618.

Shao Yijie1, Jiang Huaye1, Gao Chao1, Luo Zongping2, Yang Huilin1. Effect of reduction of mechanical loading on subchondral bone and articular cartilage of early osteoarthritis in mice [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(35): 5611-5618.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析所有48只小鼠耐受手术良好，无小鼠出现意外死亡，未出现感染迹象。

2.2 Micro-CT分析结果造模后4周及8周，典型的Micro-CT冠状面图像见图3A，无论4周还是8周，关节炎模型组的内侧胫骨软骨下骨的骨体积分数增加，表现为骨硬化。相反，运动神经(胫神经联合腓总神经)切断后，小鼠膝关节内侧胫骨软骨下骨的骨体积分数急剧减少，表现为骨丢失。与关节炎模型组比较，造模后4周及8周运动神经切断+模型组中骨体积分数降低(P < 0.001)，见图3B，C。运动神经切断+模型组与运动神经切断+假手术组之间差异无显著性意义。另外，运动神经切断+模型组8周时骨体积分数较4周有所增加(P < 0.05)。

2.3 组织学染色结果如图4A所示，造模后4周，关节炎模型组软骨表面蛋白聚糖丢失(局部番红O失染)，软骨表面粗糙，软骨细胞死亡。运动神经切断+模型组软骨表面轻微蛋白聚糖丢失，软骨表面较为光滑。造模后8周，骨关节炎模型组软骨表面磨损较为严重，软骨细胞大量死亡。运动神经切断+模型组软骨表面蛋白聚糖丢失范围较4周大。运动神经切断+假手术组4周及8周并未见到明显的蛋白聚糖丢失。图4B为OARSI半定量评分，随着时间的进展，关节炎模型组及运动神经切断+模型组软骨退变逐渐加重(P < 0.001)，与关节炎模型组比较，造模后4周及8周运动神经切断+模型组软骨退变减轻(P < 0.001)。运动神经切断+假手术组造模后4周及8周相比于正常组软骨OARSI评分无明显差异。图4C，D示，造模后4周及8周时运动神经切断+假手术组软骨厚度较正常组降低，且8周时降低更为明显。

2.4 足印分析结果运动神经(胫神经联合腓总神经)切断后，小鼠右足行五趾并拢、足轻度外翻。图5A为小鼠足印示意图，图5B为各组小鼠的足印图，从中可以发现运动神经切断组造模后4周及8周右前足和右后足足印重叠或接近。造模后4周及8周时，相比于关节炎模型组，运动神经切断+模型组后足足宽降低(P < 0.001)，见图5C，D。此外，运动神经切断+模型组和运动神经切断+假手术组后足足宽在4周时与在8周时无明显差别。

2.5 肌肉湿质量造模后4周及8周时，相比于关节炎模型组，运动神经切断+模型组右侧小腿三头肌肌肉湿质量明显降低(P < 0.001)，见图6A，B。运动神经切断+模型组右侧小腿三头肌肌肉湿质量在造模后8周时要比4周稍降低，但差异无显著性意义。造模后4周及8周时，相比于关节炎模型组，运动神经切断+模型组右侧胫前肌肌肉湿质量明显降低(P < 0.001)，见图6C，D。运动神经切断+模型组右侧胫前肌肌肉湿质量在造模后4周与8周无明显差异。

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引言

骨性关节炎是目前全世界患病率较高的慢性进展性疾病，影响主要的负重关节(如髋关节、膝关节)^[1]，引起关节软骨退变、软骨下骨重塑、滑膜炎症及骨赘形成^[2]。目前在美国大约有2 700万人以及在世界范围内大约有6.3亿人都患有骨性关节炎，且膝关节是目前为止最普遍的受影响关节^[3]。目前关于骨关节炎的发病机制还未完全清楚。近年来的研究表明力学在骨关节炎的发生发展中起着关键的作用，临床上很多膝关节骨关节炎患者下肢力线已发现明显变化^[4-6]。因此，针对于骨关节炎的力学研究显得尤为重要。

机械应力在骨关节炎的发病进展中起着重要的作用。正常的关节负荷以及活动所产生的适度机械应力有助于维持关节软骨的合成及分解代谢^[7]。过度的关节负荷会引起软骨细胞的分解代谢增加，导致软骨的软化、纤维化及溃疡形成，最终导致软骨丢失，引起骨性关节炎^[8-10]。除此之外，过少的关节负荷同样也会对关节软骨产生损害。动物研究表明，延长关节制动可以引起软骨变薄、组织软化、蛋白聚糖含量减少，从而导致基质纤维化、溃疡形成和侵蚀^[11]。临床研究发现，脊柱损伤患者由于关节不能得到有效负荷，软骨厚度进展性减少，并且减少的速度比骨性关节炎患者还高^[12]。

除了关节软骨，近些年来机械应力对骨的影响研究越来越受到人们的关注。针对人体去应力负荷的研究，如长时间卧床休息或长时间太空飞行，会导致骨形成的尿液生物标志物减少，骨吸收的尿液生物标志物增加，相当于是松质骨和皮质骨的丢失^[13-14]。动物研究表明，大鼠尾巴悬挂模型通常用来模拟人体失重，这些模型也证明了骨吸收增加以及骨形成减少，同时还伴有肌肉质量减少^[15-16]。小鼠尾巴悬挂2周后，远端股骨和近端胫骨减少23%-50%骨小梁体积，肌肉质量减少10%-55%^[17]。以上这些研究表明机械应力对于维持关节软骨和骨的稳态都起着至关重要的作用。目前动物研究关于去负荷或负荷减少对骨与软骨的影响一般通过尾椎悬挂模型来实现，运动神经损伤引起的关节负荷减少对骨与软骨的影响报道较少。

在临床实践中，下肢运动神经损伤(如胫神经及腓总神经损伤)常继发于下肢暴力骨折、手术、肌内注射等^[18-20]。胫神经及腓总神经损伤后常表现为胫前肌及小腿三头肌渐进性萎缩以及足外侧麻木，修复过程极为缓慢^[21]。此外，患侧下肢运动能力及协调性减弱，关节负荷减少。在该实验中，作者通过外周运动神经(胫神经联合腓总神经)横断，在不影响膝关节正常屈、伸活动下，通过影响下肢运动能力及协调性来减少膝关节负荷，从而探索关节负荷减少对小鼠膝骨关节炎软骨下骨以及关节软骨的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机分组对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年6月至2018年6月在苏州大学附属第一医院南区骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠48只，体质量22-25 g，购于昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2018-0006。

1.3.2 实验试剂 EDTA•2Na(上海Sigma-Aldrich贸易有限公司)；体积分数为10%中性甲醛溶液(上海源叶生物科技有限公司)；苏木精-伊红染液、番红-快绿染液(上海Sigma-Aldrich贸易有限公司)；异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3.3 实验仪器 Micro-CT(比利时SkyScan公司)；电子天平(北京赛多利斯科学仪器公司)；正置显微镜(日本Olympus公司)；石蜡包埋机(德国Leica公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验设计及分组选取48只雄性成年C57BL/6小鼠，随机分为正常组、关节炎模型组、运动神经切断+模型组以及运动神经切断+假手术组，每组12只。通过对小鼠胫神经联合腓总神经切断来模拟膝关节应力负荷减少。骨关节炎造模前1周进行胫神经联合腓总神经横断，造模后4周每组处死一半小鼠，造模后8周处死剩下一半小鼠，收集每组小鼠的右侧膝关节标本，分别进行Micro-CT扫描、组织学染色、足印分析及肌肉萎缩检测。

1.4.2 关节炎模型的建立小鼠适应饲养环境1周后，采用异氟烷持续吸入麻醉，观察角膜反射消失后进行右膝备皮，碘伏消毒后铺无菌手术单。沿着右膝髌韧带内侧依次切开皮肤、筋膜、关节囊，向外侧脱位髌骨，屈曲膝关节，暴露出内侧半月板韧带，用显微剪刀离断内侧半月板韧带。用无菌生理盐水清洗关节腔后逐层缝合切口，碘伏消毒切口及周围皮肤^[22]，见图1。假手术组暴露出内侧半月板韧带后，不做任何处理，然后逐层缝合；运动神经切断+模型组为运动神经切断联合关节炎造模组；而运动神经切断+假手术组为运动神经切断联合假手术组。

1.4.3 运动神经(胫神经联合腓总神经)横断手术骨关节炎造模前1周，对小鼠施行运动神经(胫神经联合腓总神经)横断手术。小鼠适应饲养环境1周后，采用持续吸入麻醉(异氟烷浓度4%，氧气流量0.2 L/min)，观察角膜发射消失后进行右外侧大腿备皮。在大腿中部做一个小切口，用剪刀对股二头肌之间进行钝性分离，暴露坐骨神经及其3个分支(腓肠神经、胫神经以及腓总神经)，在坐骨神经分支的远端使用8-0丝线结扎胫神经以及腓总神经，用剪刀剪除远端神经残端2-4 mm，注意不要损伤腓肠神经，逐层缝合肌肉及皮肤^[23]。术后小鼠可在鼠笼中自由活动、进食及饮水，见图2。

1.4.4 Micro-CT分析造模后4周及8周，各组小鼠采用颈椎脱臼法处死，取右膝关节，剔除肌肉及筋膜，用体积分数为10%甲醛固定，固定48 h后进行Micro-CT扫描，分辨

率为9 μm，扫描完成后进行三维重建，定量分析膝关节胫骨内侧软骨下骨的变化^[24]。

1.4.5 组织病理学染色上述右膝关节标本在体积分数为10%甲醛溶液中固定48 h，PBS充分清洗后用10%EDTA(pH=7.4)在摇床上进行脱钙，共14 d，脱钙液每24 h更换1次，脱钙完全后常规用乙醇进行梯度脱水，正丁醇透明，石蜡包埋后进行组织连续切片，厚度为6 μm，苏木精-伊红染色及番红O-快绿染色观察膝关节胫骨内侧软骨退变程度，采用OARSI评分(目前国际上评价骨关节炎严重程度的常用评分方法)来评估骨关节炎严重程度^[25]。

苏木精-伊红染色步骤：烘片55 ℃ 30 min，经历脱蜡、脱二甲苯、水化后，苏木精染色3 min，水洗5 min，1%盐酸乙醇分化30 s，水洗5 min，氨水反蓝30 s，水洗5 min，伊红染色1 min，体积分数为95%乙醇1 min/次×2次，体积分数为100%乙醇1 min/次×2次，二甲苯1 min/次×2次，中性树脂封固。

番红O-快绿染色步骤：烘片55 ℃ 30 min，经历脱蜡、脱二甲苯、水化后，苏木精染色3 min，水洗5 min，1%盐酸乙醇分化30 s，水洗5 min，氨水反蓝30 s，水洗5 min，快绿1 min，1%乙酸30 s，番红O溶液中60 min，体积分数为95%乙醇1 min/次×2次，体积分数为100%乙醇1 min/次×2次，二甲苯1 min/次×2次，中性树脂封固。

1.4.6 足印分析造模后4周及8周，处死小鼠前，对其步态进行足印分析。首先，在小鼠前爪和后爪分别涂上颜色不同的染料，放在预先准备好的跑道上，跑道上铺上白纸，把小鼠放在跑道起始处，在终点处放置鼠粮，让小鼠从跑道起始处行走至跑道终点处，在白纸上留下一连串足印。每只小鼠测量5次，每次测量选取连续两步做分析^[26]。

1.4.7 肌肉萎缩检测造模后4周及8周，处死小鼠，完整分离出双侧胫骨前肌及小腿三头肌，称质量^[27]。

1.5 主要观察指标 ①骨体积分数；②苏木精-伊红染色、番红O-快绿染色结果及骨关节炎评分(OARSI评分)；③后足足宽；④小腿三头肌及胫前肌湿质量。

1.6 统计学分析所得数据采用SPSS 17.0统计软件进行t 检验分析，计算结果以平均值±标准误表示，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

该实验探索了膝关节负荷减少后对小鼠早期骨关节炎软骨下骨和关节软骨的影响。研究发现膝关节负荷减少后，小鼠软骨下骨骨量明显降低，关节软骨层厚度减少，提示适宜的关节负荷对维持关节软骨和软骨下骨的稳态有着重要的作用。

目前较为常见的用来研究骨关节炎的模型主要有：自发性骨性关节炎、创伤性骨性关节炎(如前交叉韧带横断、内侧半月板去稳定等)以及化学诱导性骨性关节炎(关节腔注射木瓜蛋白酶、单碘醋酸钠、肿瘤坏死因子α以及秋水仙素等)^[28-29]。内侧半月板去稳定模型由于其关节炎进展缓慢，常用于早期骨性关节炎的研究^[30-31]。番红O-快绿染色发现内侧半月板去稳定后4周，胫骨内侧关节软骨呈现轻微的组织学改变，包括局部的蛋白聚糖丢失(番红O失染)，软骨表面粗糙、垂直裂隙等。内侧半月板去稳定后8周，胫骨内侧软骨表面出现磨损，软骨细胞死亡，番红O大范围失染等。这些是由于内侧半月板去稳定后，股骨内侧软骨与胫骨内侧软骨面直接接触，过度磨损导致。这些发现与其他研究基本一致^[32-33]。然而，在造模后4周运动神经切断+模型组软骨表面没有看到明显的退变，8周后软骨表面出现轻微退变，表现为局部蛋白聚糖丢失。运动神经切断+假手术组4周及8周并没有看到明显的软骨退变。作者认为，由于运动神经(胫神经联合腓总神经)切断后，同侧下肢踝部背伸及跖屈不能，小鼠行走时由对侧下肢代偿，导致小鼠行走时患侧膝关节负荷减少，所以运动神经切断+模型组软骨退变进展相比于关节炎模型组减缓。此外，运动神经切断+假手术组番红O-快绿染色发现软骨层厚度降低，且8周比4周更为明显，提示关节软骨发生了早期退变。

很多研究表明，在骨关节炎进展中存在软骨下骨异常重塑^[34-35]。Micro-CT分析发现，关节炎模型组在造模后4周和8周时右侧膝关节胫骨内侧软骨下骨骨体积分数增加，软骨下骨发生硬化，而运动神经切断组(包括运动神经切断+模型组以及运动神经切断+假手术组)软骨下骨骨体积分数显著降低，软骨下骨发生骨吸收现象。软骨下骨被认为是关节软骨的机械组成部分^[36]。正常情况下，软骨下骨中的

成骨细胞以及破骨细胞维持了骨形成和骨吸收的动态平衡。有研究表明骨关节炎不仅仅是关节软骨的损害，软骨下骨也参与其中。在早期的骨性关节炎中，软骨下骨-软骨交界面存在重塑，特别是在关节软骨损害部位覆盖的软骨下骨。除了软骨下骨的改变，关节边缘会形成骨赘，骨质增生会导致软骨下骨板的增厚^[37]。该实验中发生骨吸收可能是因为运动神经横断后，关节负荷减少引起的失用性骨质疏松。然而，作者发现运动神经切断组(包括运动神经切断+模型组以及运动神经切断+假手术组)8周时骨体积分数相比于4周有轻微的增加。原因可能有以下几点：①运动神经横断所引起的软骨下骨持续吸收主要表现在早期，实验只选择4周及8周这2个时间点有可能为中晚期；②外周神经具有一定的再生功能；8周时可能有局部的神经再生，部分恢复了骨的营养；③8周时，小鼠患侧肢体具有一定的代偿能力，关节负荷可能比4周时有轻微的增加。

下肢去神经支配诱发的下肢制动已经被广泛用来研究啮齿类动物的失用性骨质疏松^[38]。常见的方法是单侧坐骨神经切除术，坐骨神经高位切除后，实验动物下肢完全失神经支配，导致膝关节去应力负荷^[39]。在以上模型的基础上，保留了高位的坐骨神经，在膝关节平面横断其3个分支中的2个分支(胫神经以及腓总神经)，保留了腓肠神经，以减少小鼠发生自噬，同时保留了膝关节的屈伸功能。通过前期实验发现，不同于高位坐骨神经横断，小鼠术后患侧肢体并未完全丧失运动能力，而是行走时右下肢五趾并拢、足轻度外翻，行走时健侧肢体进行代偿。基于以上依据，采用横断胫神经联合腓总神经来模拟关节负荷减少。

胫神经联合腓总神经切断后，其所支配的小腿三头肌及胫前肌萎缩，4周时运动神经切断+模型组右侧小腿三头肌和胫前肌湿质量减少，8周时湿质量并未进一步减少。有研究表明，肌肉在保护关节方面起到着重要的作用，用肉毒梭菌诱导股四头肌萎缩后，新西兰大白兔髌股关节软骨发生明显退变，提示肌肉萎缩可能是骨关节炎发生及进展中的一个危险因素^[40-42]。此外，有临床研究表明股四头肌锻炼可以减慢老年人膝骨关节炎进展^[43]。另外的一项关于骨关节炎后胫前肌功能改变的研究发现小鼠内侧半月板去稳定术后1，4，8周，并没有发现组织学上的胫前肌肌肉萎缩及炎症，胫前肌功能的改变主要为胫前肌松弛速率减慢^[44]。足印分析显示4周时运动神经切断+模型组后足足宽减少，8周时后足足宽并未进一步减少。近些年来的研究表明，肌肉分泌的鸢尾素会直接激活骨细胞，增加骨硬化蛋白的含量，从而促进骨重建^[45]。作者认为运动神经横断后，软骨下骨出现骨吸收并不仅仅是由于患侧关节负荷的减少，可能与肌肉萎缩有关。

在该研究中，作者发现4周及8周运动神经切断组(包括运动神经切断+模型组以及运动神经切断+假手术组)与模型组相比骨体积分数下降了近50%。而在另一项研究中发现，大鼠尾椎悬挂2周后膝关节骨体积分数下降了约33%^[27]。相比于大鼠尾椎悬挂后引起的膝关节去应力负荷，该研究中小鼠膝关节并未完全去应力负荷，但运动神经切断组发现更大幅度的骨量丢失。由此推测如此大幅度的骨量丢失并不仅仅是由膝关节负荷减少所引起。有研究表明，单侧的坐骨神经切断在4周内会急剧的引起同侧股骨和胫骨松质骨的骨量丢失，4周后骨量丢失进展缓慢；同时，单侧坐骨神经切断引起感觉神经末梢来源的P物质释放减少，进一步用P物质受体拮抗剂处理后骨量丢失加重^[39]。已有研究表明，感觉神经在调节骨量方面起着十分重要的作用^[46]。由此可见，除了关节负荷减少，神经去支配引起的外周神经信号紊乱也会引起骨量丢失。另外，膝关节软骨下骨以及骨干中的营养主要来自于其间分布的血管。在正常的关节组织中，神经-血管的交互可以维持关节稳态。当发生骨关节炎时，这种稳态被打破。在骨关节炎发生时，新生血管周围通常伴随着神经生成。有研究表明，神经和血管的生成可以相互促进，血管可以分泌血管内皮生长因子促进神经生成，神经可以通过β-神经生长因子促进血管生成^[47]。因此，该研究并不能排除血管营养减少在骨量丢失中所起的作用。

同时实验存在一定的不足：首先实验选择4周及8周这2个时间点，没有做更早期(如1周，2周)的研究，不能更好地、连续地反映整个变化过程；其次是没有做更深一步的分子机制方面的研究；最后，小鼠和人体之间还存在着一定的差异，该研究中小鼠骨关节炎模型主要为力学不稳模型，而人骨关节炎的类型多种多样，如代谢相关性、年龄相关性以及外伤相关性等。从动物研究到临床转换还需要进行很长时间的探索。

总之，膝关节负荷减少后，小鼠软骨下骨骨量明显降低，关节软骨层厚度减少，提示适宜的关节负荷对维持关节软骨和软骨下骨的稳态有着重要的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

膝关节应力负荷减少对小鼠早期骨关节炎软骨和软骨下骨的影响

Effect of reduction of mechanical loading on subchondral bone and articular cartilage of early osteoarthritis in mice

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