2.1  实验动物数量分析  选取造模成功的新西兰大白兔30只，分为3组，实验过程无脱失，进入结果分析30只。

2.2  一般情况  骨关节炎模型造模6周后按照马氏骨关节炎模型造模验证方法验证实验动物造模成功^[19]，症见：造模关节僵硬、肿胀，股四头肌萎缩，关节腔见软骨颜色白硬，软骨面光泽度降低，软骨面有不同程度粗糙、糜烂、溃疡形成，关节周缘骨刺形成，造模过程中未见固定肢体出现坏死、压疮等现象，实验动物灌胃过程中未出现死亡者。

2.3  软骨组织苏木精-伊红染色、病理学改良Mankin’s评分  骨关节炎模型造模成功后苏木精-伊红染色提示基质染色变浅，软骨细胞数量明显减少，血管入侵潮线结构，改良Mankin’s评分6.78±0.53。实验兔灌胃后牛膝总皂苷组苏木精-伊红染色提示基质染色无明显变化，软骨细胞数量较空白对照组增多，软骨细胞呈卵圆形，潮线结构恢复正常，改良Mankin’s评分为3.46±0.45。硫酸氨基葡萄糖组苏木精-伊红染色提示基质染色变浅，软骨细胞数量减少，血管入侵潮线结构，改良Mankin’s评分6.74±0.57。空白对照组苏木精-伊红染色提示基质染色变浅，软骨细胞数量明显减少，血管入侵潮线结构，改良Mankin’s评分6.92±0.49。牛膝总皂苷组与硫酸氨基葡萄糖组、空白对照组改良Mankin’s评分相比有统计学意义(P < 0.05)。见图1。

2.4  软骨组织电镜观察  见图2。电镜醋酸铀和柠檬酸铅双染色：牛膝总皂苷组图a显示软骨细胞呈卵圆形，细胞及胞膜完整，表面微绒毛稀疏短小，胞质可见粗面内质网，部分粗面内质网扩张成空泡状，细胞核完整，核内染色质分布均匀，胞膜外软骨囊清晰可见，图b显示纤维组织排列致密，规则；图c硫酸氨基葡萄糖组显示：软骨细胞呈卵圆形，细胞及胞膜完整，表面微绒毛稀疏至缺失，胞质可见大量空泡状粗面内质网，细胞核完整但不规则，核内异染色质分布分布于核膜之下，胞膜外软骨囊不明显，图d显示纤维组织排列致密，不规则；空白对照组图e显示软骨细胞呈卵圆形，细胞及胞膜完整，表面微绒毛稀疏短小，胞质可见粗面内质网和纤维蛋白丝，部分线粒体扩张成空泡状，细胞核完整但不规则，核内异染色质分布分布于核膜之下，胞膜外软骨囊不明显，图f显示纤维组织排列致密，不规则。

2.5  软骨组织低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子、Ⅱ型胶原mRNA表达  qRT-PCR检测结果分析表明，与硫酸氨基葡萄糖组、空白对照组相比，牛膝总皂苷组低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子mRNA表达量显著降低(P < 0.01)，与硫酸氨基葡萄糖组相比，牛膝总皂苷组Ⅱ型胶原mRNA表达量均明显增加(P < 0.05)。硫酸氨基葡萄糖组与空白剂量组比较Ⅱ型胶原mRNA表达量均明显增加(P < 0.05)，而低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子mRNA表达量差异无显著性意义(P > 0.05)。见图3。

骨关节炎是临床常见疾病，以关节软骨细胞显著减少、软骨基质崩解、软骨下骨退变及继发性骨质增生为主要病理特征^[1]，临床以关节疼痛、肿胀、运动障碍等为特征表现，严重影响了人体健康，目前尚无理想药物治疗。在前期研究基础上，已证实牛膝能促进实验兔骨关节炎模型关节软骨修复，牛膝总皂苷含药血清体外能促进软骨细胞增殖^[2-3]。

骨关节炎是以关节软骨退行性病变、软骨下骨硬化、滑膜炎为特征，并伴有骨头摩擦、僵硬、疼痛及活动受限等症状的一种代谢性疾病^[4]。目前该疾病的治疗主要分为手术治疗和药物治疗，早期可行关节镜灌洗、清创术、微骨折诱导和自体软骨细胞移植^[5]，目前临床效果仍不理想，疾病终末期常需行关节置换，但该术式为骨关节炎终末期的治疗手段^[6]。药物治疗作为骨关节炎的一线疗法，为患者减轻临床症状、延缓关节损害、提高生活质量的关键措施。但各种药物的易用性、安全性、适用范围、有效性、不良反应等方面各不相同^[7]，理想的骨关节炎关节修复治疗应需恢复软骨细胞再生能力及抗炎症破坏作用。

目前组织工程利用中药修复组织损伤性疾病的研究逐年增加，已证实有些方药能够起到同类西药相当的疗效。而牛膝是治疗软骨损伤性疾病如骨关节炎的使用频率最高的中药^[8-9]，临床效果良好。目前牛膝主要有效成分包含多糖类、皂苷类、甾酮类等^[10]，多糖类具抗氧化、免疫调节作用^[11]；牛膝总皂苷具有促进软骨细胞增殖和抗炎症的作用^[12-15]；甾酮类具有促进蛋白质的合成、使受损细胞再生等作用^[16]。课题组前期研究证实怀牛膝醇提物含药血清能有效促进体外及体内软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原表达^[17]。因此，课题组拟通过牛膝总皂苷对实验兔骨关节炎模型进行灌胃，观察其对软骨组织、软骨细胞超微结构的改变及对低氧诱导因子1信号通路的影响，结果牛膝总皂苷组与硫酸氨基葡萄糖组、空白对照组比较，苏木精-伊红染色观察、病理学评分明显改善，电镜观察软骨细胞活力增加、纤维排列整齐，与文献研究报道相符^[18]。

根据前期研究基础，故课题组深入研究牛膝主要有效成分牛膝总皂苷对实验兔骨关节炎模型体内软骨修复及低氧诱导因子1信号通路的影响。 

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2017年10月至2018年11月在深圳北京大学香港科技大学医学中心完成，

1.3  材料

1.3.1  动物  新西兰大白兔32只，兔龄两三个月，体质量(1.47±0.56)kg，雌雄不限。由广东省实验动物中心提供，动物合格：SCXK(粤)2014-0035；实验动物中心许可证号：SYXK(粤)2010 -0106。实验操作符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.3.2  药物及试剂  倒置相差显微镜(Leica)；TRE-Trizol(Invitrogen)；Primers(上海生工)；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)；SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)；牛膝总皂苷(深圳市中医院药剂科制备)；硫酸氨基葡萄糖(批号 7KB0102，国药产品注册证号 HC20120036，信东生技股份有限公司提供)。

1.4  实验方法

1.4.1  骨关节炎模型兔造模及鉴定  健康新西兰兔32只，适应性喂养1周后将实验兔右膝关节用骨关节炎模型造模支具(专利号：201720079394.3)包裹好后于伸直位固定制动6周。造模6周后，验证骨关节炎造模是否成功。每天记录实验兔肢端血液循环、支具固定稳定度、活动量等情况，固定6周后随机抽取2只实验兔行骨关节炎模型鉴定^[2]。上述一兔一笼进行标准喂养，兔笼大小为80 cm×60 cm×40 cm，允许其在笼内自由活动。混合饲料喂养，自由饮水，每日去除兔粪和食物残渣，保证饲养环境清洁。每天观察实验兔的食量、活动度、尿便、步态及精神状况。

1.4.4  透射电镜检测软骨细胞及纤维  将待检测同一部位软骨组织块置于2.5%戊二醛，4 ℃固定过夜，0.1%PBS 漂洗4次，每次15 min，1%锇酸固定1 h，双蒸水漂洗4次，每次15 min，再脱水，以体积分数50%、70%、90%丙酮各1次，100%丙酮3次，每次15 min，丙酮∶环氧树脂=1∶1 浸1 h，丙酮∶环氧树脂=1∶2 浸2 h，纯环氧树脂浸透过夜；浸透后的标本于包埋胶囊的纯环氧树脂中，72 ℃ 8 h；超薄切片、染色：修块后切 60-90 nm 超薄片，200目铜网捞片，醋酸双氧铀－柠檬酸铅染色。

1.4.5  qRT-PCR检测软骨组织低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子、Ⅱ型胶原mRNA表达  根据目的基因的种属及名称，在NCBI数据库查询参考核苷酸序列，采用Primer 3.0设计Real Time PCR引物，引物序列经NCBI nBlast 比对无非特异性扩增，用于qRT-PCR实验。该实验目的基因引物序列如下(5’to 3’)。见表2。

分别收集3组软骨组织，检测低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子、Ⅱ型胶原mRNA表达。将软骨组织用Trizol试剂分别提取3组总RNA，再用随机引物，反转录酶转录为cDNA，然后以此cDNA第1链为模板，进行qRT-PCR扩增反应参数参考TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)试剂盒说明进行，Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线应用Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System的操作方法进行。

1.5  主要观察指标  ①软骨组织苏木精-伊红染色观察、病理学改良Mankin’s评分及软骨细胞电镜观察；②用qRT-PCR检测软骨组织低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子、Ⅱ型胶原mRNA表达。

1.6  统计学分析  用SPSS 23.0统计软件分析。数据用  x(_)±s表示。对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，组间比较用t 检验，不满足方差分析时用非参数检验，检验水准α=0.05，P > 0.05为差异无显著性意义。

骨关节炎为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。临床以缓慢发展的关节疼痛、肿胀、运动障碍等为特征表现。