1.1 设计 细胞学实验观察。
1.2 时间及地点 实验于2016年9月至2018年2月在广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室、广西颅颌面畸形临床医学研究中心、颌面外科疾病诊治研究重点实验室(广西高校重点实验室)完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 出生24 h的SD乳鼠,由广西医科大学实验动物中心提供,雌雄不限,实验动物许可证号:SCXK桂 2009-0002。动物实验方案经广西医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号:201601007)。
1.3.2 实验用主要试剂及仪器 番茄红素(粉剂,Sigma公司,美国);α-MEM培养基(Hyclone,美国);胎牛血清(Hyclone,美国);碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国);β磷酸甘油、维生素 C、地塞米松(索莱宝科技有限公司,北京);茜素红(源叶生物科技有限公司,上海);酶标定量测试仪 (MultiskanMS-352,雷勃,芬兰);倒置显微镜(Olympus,日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 番茄红素培养基的配制 1 mg番茄红素溶解于 2 mL二甲基亚砜,α-MEM培养基加胎牛血清稀释成含有10,102,103及104 nmol/L的体积分数10%FBS培养基,0.22 µm针头式滤器过滤后用于细胞培养。培养液铝箔纸包裹后4 ℃避光保存。
1.4.2 成骨细胞原代培养 出生24 h的SD乳鼠3只,无菌操作取出头颅顶骨,清除骨膜、血管等结缔组织;小剪刀剪碎后0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化20 min,消化终止后离心5 min,弃上清;加入0.1%Ⅱ型胶原酶,消化60 min,离心后弃上清;加入含体积分数20%FBS的α-MEM培养基反复吹打后过滤骨碎片,取细胞悬液接种于培养瓶中;置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养;次日更换培养液,以后每隔两三天换液1次,传代至第3-6代细胞待用。
1.4.3 成骨细胞碱性磷酸酶染色鉴定(钙钴法) 制作成骨细胞爬片,镜下观察细胞融合度达到80%以上进行固定。滴加基质液,在恒温培养箱中避光孵育,15 min后轻甩去掉多余基质液,染色液1染色5 min,水洗,甩干。染色剂2染色30 s,水洗30 s,甩干。复染30 s,水洗30 s,甩干后镜检。
1.4.4 实验分组 实验分为H2O2组、对照组及10,102,103,104 nmol/L番茄红素组。H2O2组用含100 μmol/L双氧水的培养液处理24 h后更换为体积分数10%FBS培养;对照组用体积分数10%FBS培养;药物处理组用含10,102,103,104 nmol/L番茄红素的体积分数10%FBS培养24 h后,弃去培养液,加入含100 μmol/L双氧水的培养液24 h后,弃去培养液,更换为体积分数10%FBS继续培养。
1.4.5 MTT法检测各组成骨细胞增殖 将培养至第3代的细胞消化计数,调节细胞浓度为5×107 L-1,接种于96孔板中,每组接种20个孔。细胞贴壁后去除原培养基开始进行干预。所有干预措施结束后,分别在第1,3,5,7天进行MTT检测细胞增殖。每组取5个复孔,每孔加入MTT液10 µL,37 ℃恒温箱中避光孵育4 h后,将培养基吸除,加入100 µL二甲基亚砜,震荡10 min,用酶标仪于595 nm波长测吸光度值(A)。
1.4.6 碱性磷酸酶活性检测 将培养至第3代的细胞消化计数,调节细胞浓度为5×107 L-1,接种于24孔板中,每组接种16个孔。细胞贴壁后去除原培养基开始进行干预。所有干预措施结束后,各组加用成骨矿化诱导液(含维生素C 50 mg/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L,地塞米松0.1 μmol/L)进行培养。分别在第3,5,7,10天检测细胞碱性磷酸酶活性。每次取4个复孔,按照试剂盒说明书进行操作,分别计算各组碱性磷酸酶活性。
1.4.7 茜素红矿化结节检测 将培养至第3代的细胞消化计数,调节细胞浓度为5×107 L-1,接种于6孔板中,每个组接种3个复孔。培养3 d后待细胞达到80%融合后开始进行干预。所有干预措施结束后,各组加用成骨矿化诱导液进行培养。21 d后弃去培养液,PBS洗3次,体积分数95%乙醇固定 15 min,茜素红染色5 min,蒸馏水冲洗后拍照。加入10%氯化十六烷基吡啶,室温放置1 h,每孔取出100 μL溶液置于96孔板,562 nm波长测定吸光度值。
1.5 主要观察指标 ①成骨细胞鉴定结果;②不同浓度番茄红素对成骨细胞增殖的影响;③不同浓度番茄红素对氧化应激条件下成骨细胞增殖和分化的影响;④不同浓度番茄红素对双氧水处理的成骨细胞矿化能力影响。
1.6 统计学分析 SPSS 19.0软件进行统计学分析。统计描述分析观察到所有数据均呈正态分布,方差齐。3组间均数的比较采用成组样本的单因素方差分析法,LSD法检验对组间样本均数进行两两比较,以
P < 0.05为差异有显著性意义。