体外循环灌注系统下应用脉络宁治疗下肢挤压伤-挤压综合征模型猪

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1141

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (11): 1723-1729.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1141

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体外循环灌注系统下应用脉络宁治疗下肢挤压伤-挤压综合征模型猪

王雷1，聂鑫1，尹叶锋2，秦新愿2，陈天贵2，高磊2，卢立振1，王江宁2

(首都医科大学附属北京世纪坛医院，1骨科，2矫形外科，北京市 100038)

收稿日期:2018-12-18 出版日期:2019-04-18 发布日期:2019-04-18
通讯作者: 王江宁，博士，主任医师，教授，首都医科大学附属北京世纪坛医院矫形外科，北京市 100038
作者简介:王雷，男，1994年生，山东省临沂市人，汉族，首都医科大学在读硕士，医师，主要从事创伤骨科、矫形外科相关疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81473502)，项目负责人：王江宁

Effect of combined application of extracorporeal circulation perfusion system and Mailuoning on crush injury and crush syndrome in pig models

Wang Lei1, Nie Xin1, Yin Yefeng2, Qin Xinyuan2, Chen Tiangui2, Gao Lei2, Lu Lizhen1, Wang Jiangning2

(1Department of Orthopedics, 2Department of Orthopedic Surgery, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medal University, Beijing 100038, China)

Received:2018-12-18 Online:2019-04-18 Published:2019-04-18
Contact: Wang Jiangning, MD, Chief Physician, Professor, Department of Orthopedic Surgery, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medal University, Beijing 100038, China
About author:Wang Lei, Master candidate, Physician, Department of Orthopedics, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medal University, Beijing 100038, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81473502 (to WJN)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
体外循环灌注系统：是由课题组多年前为解决离断肢体体外保存而设计的“体外模拟体内生理环境断肢寄养系统”改良而来的血液净化系统，前期研究已证实该系统具有模拟体内生理环境条件、清除断肢缺血坏死产物的作用，目前被用于下肢缺血性疾病及下肢挤压伤的临床及基础研究。
脉络宁：脉络宁注射液是在四妙勇安汤的基础上，以中医理论为指导，采用中西医结合的方法研究成的中药复方注射剂，由牛膝、金银花、玄参及石斛等中药组成。现代研究表明，脉络宁具有抗凝、溶栓、解痉、扩张血管、抗自由基以及改善微循环和内皮细胞保护作用及保护、修复血管等药理作用。

摘要
背景：严重挤压伤及其引起的挤压综合征具有很高的致残率和致死率，严重威胁伤者生命。减少挤压解除后有害物质的回流入血是防治挤压综合征的关键。
目的：观察体外循环灌注系统下应用脉络宁注射液对猪下肢挤压伤-挤压综合征的防治作用。
方法：将巴马小型猪24只(购自北京通和生泰比较医学研究所)随机分为4组，每组6只，分别为正常对照组、模型组、常规灌注组及脉络宁灌注组，除正常对照组外其他3组用自制挤压装置行挤压伤造模，模型组造模完毕即刻恢复自身血供，常规灌注组与脉络宁灌注组分别给予常规血液灌注及脉络宁血液灌注1 h后恢复自身血供。
结果与结论：①血液生化及ELISA法检测显示，与模型组相比，常规灌注组和脉络宁灌注组灌注完毕后 48 h生存率升高，血清肌酐、尿素氮、钾离子、肌红蛋白、肌酸激酶、白细胞介素1β及白细胞介素水平明显降低(P < 0.05)，脉络宁灌注组灌注完毕后6 h肌酸激酶、肌红蛋白水平低于常规灌注组(P < 0.05)；②氧化应激因子检测显示，与模型组及常规灌注组相比，脉络宁灌注组骨骼肌丙二醛水平、胞浆内细胞色素C及凋亡诱导因子含量明显降低(P < 0.05)，而骨骼肌超氧化物歧化酶活性、线粒体内细胞色素C及凋亡诱导因子含量显著升高(P < 0.05)；③透射电镜结果显示，脉络宁灌注组骨骼肌超微结构较模型组及常规灌注组更接近正常组织，模型组与常规灌注组组织损伤情况相近；④结果表明，体外循环灌注系统下应用脉络宁对模型猪下肢挤压伤-挤压综合征具有一定的防治作用，可以为该病的治疗提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4741-779X(王雷)

关键词: 体外循环, 挤压伤, 挤压综合征, 脉络宁, 中药, 下肢, 肌红蛋白, 缺血再灌注损伤, 氧化应激

Abstract:

BACKGROUND: Severe crush injury and crush syndrome have high disability and mortality rates, which seriously threaten the lives of the injured. Reducing the return of harmful substances into blood after extrusion relief is the key to prevent and treat crush syndrome.
OBJECTIVE: To investigate the effect of combined application of extracorporeal circulation perfusion system and Mailuoning injection on crush injury and crush syndrome of lower extremity in pigs.
METHODS: Twenty-four Bama miniature pigs (provided by Beijing Tonghe Shengtai Institute for Comparative Medicine) were randomly divided into four groups (n=6/group): blank control, modeling, routine perfusion, and Mailuoning perfusion groups. The pigs in the latter three groups were used to establish the crush injury-crush syndrome model by self-made crush device. The modeling group restored blood supply after modeling immediately. The routine perfusion and Mailuoning perfusion groups respectively restored after receiving routine blood perfusion and Mailuoning perfusion treatment for 1 hour.
RESULTS AND CONCLUSION: The survival rate at 48 hours in the routine perfusion and Mailuoning perfusion groups were higher than that in the modeling group. Levels of creatinine, blood urine nitrogen, potassium ion concentration, myoglobin, creatine kinase, interleukin-1 beta and interleukin-6 in in the routine perfusion and Mailuoning perfusion groups were significantly decreased (P < 0.05). The levels of myoglobin and creatine kinase in the Mailuoning perfusion group at 6 hours were significantly lower than those in the conventional perfusion group (P < 0.05). Compared with the modeling and conventional perfusion groups, the malonaldehyde level in skeletal muscle, and contents of cytochrome C and apoptosis inducing factor in cytoplasm in the cytoplasm Mailuoning perfusion group were significantly decreased (P < 0.05), and the superoxide dismutase activity, and the contents of cytochrome C and apoptosis inducing factor in mitochondria were significantly increased (P < 0.05). Transmission electron microscope showed that the ultrastructure of skeletal muscle in the Mailuoning perfusion group was closer to the normal tissue than the modeling and conventional perfusion groups. The tissue injury condition was similar between modeling and conventional perfusion groups. These results indicate that the combined application of the extracorporeal circulation perfusion system and Mailuoning can prevent and treat the crush injury crush syndrome of the pig models and provide a new idea for the treatment of this disease.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Extracorporeal Circulation, Crush Syndrome, Tissue Engineering

中图分类号:

R453
R364

王雷，聂鑫，尹叶锋，秦新愿，陈天贵，高磊，卢立振，王江宁 . 体外循环灌注系统下应用脉络宁治疗下肢挤压伤-挤压综合征模型猪[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(11): 1723-1729.

Wang Lei1, Nie Xin1, Yin Yefeng2, Qin Xinyuan2, Chen Tiangui2, Gao Lei2, Lu Lizhen1, Wang Jiangning2 . Effect of combined application of extracorporeal circulation perfusion system and Mailuoning on crush injury and crush syndrome in pig models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(11): 1723-1729.

图/表（结果） 4

2.1 动物数量及生存率分析实验猪24只均进入结果分析，实验造模操作过程中无脱失和死亡。继续观察至实验开始后48 h，模型组死亡3只，常规灌注组死亡1只，空白对照组及脉络宁灌注组无死亡。模型组动物48 h生存率为50%，常规灌注组为83%，空白对照组与脉络宁灌注组为100%。结果显示模型组动物伤后48 h生存率较低，应用体外循环灌注处理可明显降低动物48 h生存率，且加入脉络宁的灌注效果更优于常规灌注组。

2.2 各组血清学指标变化 EILSA检测显示，与正常对照

组相比，模型组各个时间点血肌酐、尿素氮、K⁺、肌红蛋白、肌酸激酶、白细胞介素1β，6水平均明显升高(P < 0.05)，说明造模成功；与模型组相比，灌注两组各指标水平明显降低(P < 0.05)；灌注两组内比较显示6 h时脉络宁灌注组肌红蛋白、肌酸激酶水平显著低于常规灌注组(P < 0.05)；各血清指标6 h水平均较4 h上升，见表1，2。

结果表明体外循环灌注处理可以降低伤后细胞毒性物质的入血，减轻肾功能损伤和全身炎症反应，且加入脉络宁灌注处理可以在此基础上进一步降低主要细胞内容物的释放。

2.3 各组肌组织丙二醛含量及超氧化物歧酶活性变化丙二醛是氧自由基损伤生细胞引起脂质过氧化过程中生成的一种醛类物质，而超氧化物歧酶是人体防御内、外环境中氧自由基损伤的重要生物酶，两者可以共同反映氧化应激的程度。4组动物肌肉丙二醛含量与超氧化物歧酶活性结果见图1。

结果显示，相较于正常对照组，其他3组丙二醛含量明显升高、超氧化物歧酶活性明显降低；相较于模型组及常规灌注组，脉络宁灌注组丙二醛含量显著降低、超氧化物歧酶活性显著升高(P < 0.05)，模型组及常规灌注组间比较无显著差异。此结果表明挤压伤解除挤压后肌肉组织产生了明显的氧化应激损伤，应用脉络宁灌注方法可以有效降低肌组织的氧化应激，而应用单纯灌注处理则无明显效果。

2.4 各组肌组织胞浆及线粒体内细胞色素C及凋亡诱导因子蛋白表达变化见图2。Western Blot检测显示，与正常对照组相比，其他3组线粒体内的细胞色素C及凋亡诱导因子水平均显著降低，而胞浆内水平显著升高(P < 0.05)；与模型组及常规灌注组相比，脉络宁灌注组线粒体内两种蛋白水平明显升高，而胞浆内水平明显降低(P < 0.05)；模型组与常规灌注组胞浆与线粒体内2种蛋白水平均无显著差异。此结果提示，挤压解除后线粒体内凋亡因子向胞浆内释放转移，相较于单纯灌注方法，应用脉络宁灌注方法可以有效减少凋亡因子的释放，抑制下游凋亡反应的发生。

2.5 各组肌组织超微结构变化透射电镜观察显示，正常对照组肌丝排列规整，肌纤维I带及A带、Z线显示清晰，细胞核形态、位置正常，线粒体、内质网无肿胀，形态正常；模型组肌丝排列紊乱，肌纤维肿胀，部分溶解，Z线明显异常，线粒体肿胀明显，可见外膜破裂，嵴结构减少，肌核变性肿胀，可见较多炎症细胞浸润；常规灌注组可见线粒体明显肿胀，整体与模型组情况相近；脉络宁灌注组肌纤维排列较模型组及常规灌注组明显规整，形态基本正常，轻微肿胀，I带、A带、Z线仍清晰，线粒体轻度肿胀，嵴结构无明显减少，见图3。结果表明经过脉络宁灌注后肌组织损伤情况明显缓解，与正常结构最为相近，证明脉络宁具有减轻骨骼肌缺血再灌注损伤的作用，而单纯灌注组肌肉情况不佳，可能与其模拟了再灌注过程，引起了近似程度的再灌注损伤有关。

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引言

挤压伤是指人体血运丰富的部位(如四肢或躯干)受到长时间压榨或挤压所造成的损伤，而四肢占大多数^[1-3]。其中严重者在挤压解除后可发生以高血钾、酸中毒、肌红蛋白尿及急性肾损伤为主要特点的一系列全身并发症，称为挤压综合征，若救治不及时或不恰当，伤者将在被解救之后面临新的死亡风险。近年来由于自然灾害、交通创伤所导致的挤压伤-挤压综合征呈增多趋势，在地震伤中挤压综合征已成为除直接致死外的第二位死因^[4-5]。因此，挤压伤- 挤压综合征的防治成为院前急救及临床研究的热点和重点。

目前临床上针对挤压伤-挤压综合征的治疗大多是基于内科抗休克、纠正水电解质紊乱等对症治疗的基础上，必要时给予血液净化等，受压肢体一般仅给予常规换药处理。传统的救援观念是救出伤者后将其转移至能接受治疗的地方，然后才进行医疗处理^[6]，其治疗时间窗往往滞后于挤压解除时间，肢体缺血坏死产生的有毒物质回流入血已经对各全身脏器造成损伤^[7]，且治疗中缺乏对受压肢体供血恢复后出现的缺血-再灌注损伤进行有效干预，整体治疗效果欠佳^[8-9]，因此探索一种能够早期切断毒素入血、同时保护挤压肢体的治疗方法具有重大的临床意义。

有研究发现，严重挤压伤肢体的病理生理变化与离断肢体具有明显的相似性，课题组经过十余年的研究，建立起“体外模拟体内生理环境断肢寄养系统^[10-13]”，证实其可以有效清除断肢代谢产物，起到延长断肢保存时间的作用。此外，研究显示中药脉络宁具有改善肢体缺血-再灌注损伤的效果。

基于以上研究，实验将体外模拟体内生理环境断肢寄养系统进行改良，命名为“体外循环灌注系统”，并以脉络宁作为灌注液加入该系统，对猪在体下肢挤压伤-挤压综合征模型进行体外循环灌注，观察该方法防治挤压伤-挤压综合征的效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2018年3到9月在首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室完成。

1.3 实验动物健康成年雄性巴马小型猪24只，体质量24-26 kg，均在北京通和生泰比较医学研究所购买，动物许可证号：SCXK(京)2018-0003。经首都医科大学附属北京世纪坛医院实验动物伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组将24只小型猪随机分为4组，每组6只，分别为空白对照组、挤压伤模型组、常规灌注组、脉络宁灌注组。除空白对照组外其他3组动物制作下肢挤压伤模型。

1.4.2 体外循环灌注系统该系统为课题组独创，包括体外循环动力泵：替代心脏作用，为体外循环液提供动力，保证持续的体外灌注；婴儿膜肺：替代肺脏作用，氧合红细胞；体外血液抗凝机检测并注射肝素和鱼精蛋白，防止循环血液凝固；血透装置：替代肾脏作用，过滤血液中代谢废物，净化血液；压力测定仪：检测动脉灌注液的压力；恒温水箱：调控灌流液及血液温度，以达到实验设定温度。该系统可为肢体提供所需的循环保证。

1.4.3 下肢挤压伤-挤压综合征模型的建立

模型名称：	下肢挤压伤-挤压综合征猪模型
动物来源及品系：	北京通和生泰比较医学研究所，巴马小型猪
麻醉方法：	肌肉注射氯胺酮(1 g/mL)诱导麻醉，丙泊酚(10 g/L)用体积分数5%葡萄糖注射液1∶5稀释后耳缘静脉缓慢滴注
造模装置：	挤压模块与万能试验机自制挤压装置，挤压模块依据外文文献制作^[14]，由2块带齿金属夹板组成，中央设计梯形凹槽用于固定肢体。
方法：	将猪右后肢放置于挤压器齿状模组中，调整肢体位置使其股骨镶嵌入梯形卡槽，设置150 kg恒定压力开始挤压
建模成功的标准：	若动物手足徐动适当追加丙泊酚剂量直至麻醉满意，挤压5 h后模型建立成功。
最终动物处理情况：	取材均在麻醉下进行，实验造模操作过程中动物无脱失和死亡，全部建模成功。

1.4.4 体外循环的建立及实验处理 ①正常对照组不做任何处理；②模型组挤压伤模型建立完毕后即刻解除挤压，不做其他处理；③常规灌注组建模前于受挤压部位上端逐层切开，分离皮下组织及肌肉，止血，仔细解剖出股动、静脉，并行股动静脉插管并固定，确认固定牢靠后以生理盐水纱布覆盖切口，仅留置股动静脉接头于体外，将右后肢置入挤压装置进行挤压伤建模，待挤压时间满5 h时血管夹夹闭近端股动、静脉，结扎可见的侧支循环，将系统动静脉管路分别与猪股动静脉接头连接，近端上简易止血带阻断侧支循环，解除挤压，启动体外循环行自体同型血灌注，灌注流量为170 mL/min，设置温度为10 ℃，膜肺装置氧体积分数为10%，灌注时长1 h，灌注过程中以50 mL/h的速度滴入生理盐水50 mL，控制置换液速度保持系统出入量平衡，灌注完毕后拔除管路，压迫止血，松血管夹恢复自身血供，逐层缝合切口，无菌敷料覆盖包扎切口，送回动物房观察；④脉络宁灌注组在灌注同时向系统中以 50 mL/h的速度滴入脉络宁注射液(10 mL/支，南京金陵药业公司) 50 mL，其他步骤同常规灌注组。

1.4.5 实验标本采集于动物自身血供恢复后4 h及6 h时间点由耳缘静脉采集静脉血标本(为了保证被挤压肌肉产生毒素入血对远隔器官损害的时间各组一致，灌注两组在灌注完毕后4 h及6 h采集，即挤压解除后5 h及7 h进行采集)行生化及ELISA检测；各组于挤压解除后4 h取右后肢同部位胫前肌标本行生化及Western Blot检测，取胫前肌肉切片以戊二醛溶液固定，行透射电镜检测。

1.5 主要观察指标

1.5.1 各组血生化检测肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、钾离子(K⁺)水平通过尿素氮及肌酐及K⁺水平反映肾功能损伤情况，同时K⁺作为主要细胞内离子亦可反映细胞破坏程度。肌酐及尿素氮严格按照肌酐和尿素氮测定试剂盒(南京建成生物科技有限公司)说明书进行测定，K⁺浓度采用全自动生化分析仪(深圳Rayto)进行自动检测。

1.5.2 ELISA法测定公司血清肌红蛋白(MB)、肌酸激酶(CK)及白细胞介素1β，6水平各全血标本于2-8 ℃微量离心机离心15 min，取上清，严格按照ELISA试剂盒(美国ADL公司)方法测定肌红蛋白、肌酸激酶、白细胞介素1β，6水平。分别设标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100 μL，混匀，覆上板贴，温育2 h，弃去液体，甩干；每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新板贴，温育1 h，弃去孔内液体，甩干，洗板3次；甩干后每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，覆上新板贴，温育1 h，弃液甩干，洗板5次，每次2 min，甩干，每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色15-30 min，加终止溶液50 μL终止反应，终止后5 min内用全自动酶标仪(美国Thermo公司)读取吸光值。

1.5.3 Western blot法检测骨骼肌胞浆及线粒体内细胞色素C(cyt-c)及凋亡诱导因子(AIF)蛋白的表达取50- 100 mg组织于冰上剪成细小的组织碎片，冰浴3 min，600×g离心10-20 s，弃上清，再加入8体积预冷的胰酶消化液，冰浴20 min，600×g离心10-20 s，取沉淀弃上清，加入2体积线粒体分离试剂，重悬组织，用于洗去残余的胰酶，重复离心10-20 s，取沉淀弃上清，加入8体积线粒体分离试剂，冰浴上进行匀浆20-30次，600×g，4 ℃离心5 min，上清转移至另一离心管中，在11 000×g，4 ℃离心10 min，上清中包含细胞浆蛋白，沉淀中含有线粒体。

BCA试剂盒(上海碧云天公司)测定胞浆蛋白及线粒体蛋白的浓度，经蛋白变性、电泳分离、电转移得PVDF膜，脱脂奶粉封闭，浸泡于西稀释后的一抗孵育液中4 ℃过夜，洗去多余一抗，再浸泡于稀释后的相应HRP标记二抗孵育液中摇床孵育，洗去多余二抗，线粒体内以GAPDH(杭州贤至生物公司)作为内参，胞质以COXⅣ(英国abcam公司)作为内参，ECL法显色，曝光，BandScan软件分析灰度值，将目标蛋白与内参灰度值比值作为目标蛋白表达量。

1.5.4 各组骨骼肌丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性检测用预冷的PBS洗肌组织，去除残留血液，称质量后将组织剪碎并以1∶9的质量体积比与对应体积的PBS加入玻璃匀浆器中，充分研磨，最后将匀浆液于 5 000 r/min离心5-10 min，取上清作为待测样本，严格按照丙二醛及超氧化物歧酶试剂盒说明书进行操作，分别测得紫外线532 nm及550 nm处吸光值。

1.5.5 透射电镜观察骨骼肌组织超微结构各组骨骼肌标本取材后置于戊二醛溶液固定，按照常规透射电镜标本制作步骤行脱水、包埋、切片，于透射电镜下观察骨骼肌超微结构改变。

1.6 统计学分析采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，数据以x(_)±s表示，两组间数据比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSD检验，检验水准 α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

挤压伤与挤压综合征被认为是同一种疾病的两种不同阶段^[15]。挤压发生后骨骼肌出现横纹肌溶解^[16]，肌红蛋白、钾离子、肌酸激酶及炎症因子等各种细胞产物大量蓄积并随着压力的解除快速的释放入血^[17-18]，同时肢体再灌注后启动缺血再灌注损伤机制产生大量氧自由基，共同引起肾脏、心脏及肝脏等远隔脏器的损伤^[19-21]及内环境的紊乱，其中尤以肾脏最为明显，大量的肌红蛋白在肾小管内快速形成管型，阻塞损伤肾小管，引起急性肾功能损害甚至急性肾衰竭^[22]，是挤压伤患者后期最主要的死因之一，有学者指出任何血液净化治疗都不能解决已经形成的急性肾功能衰竭^[23]，所以减少有毒物质解压后的入血对挤压综合征的治疗尤为关键。

实验创新性的将用于断肢保存的“体外模拟体内生理环境断肢寄养系统”经过改良后应用于挤压伤-挤压综合征的治疗，其工作原理相当于对局部肢体进行血液净化处理，有别于常规的全身血液净化治疗，该系统设计拟从源头上阻断挤压解除初期大量毒素的入血并通过体外循环的方式将其分流并清除：在挤压伤肢体的挤压解除初期，携有高浓度一过性有毒物质的淤滞血液随静脉插管流入该系统，随后血液中的细胞内容物、炎症因子及代谢产物被血滤装置清除，最后经动脉插管回流到肢体，形成独立于全身血液循环之外的体外循环。该方法在理论上可最大限度的降低毒素入血，从预防的角度减轻各器官的损害，其干预时机是非常早期的。白斌等^[24]报道的经股静脉插管后应用便携式血液净化机治疗挤压综合征相关急性肾衰竭的动物犬与该实验思路具有一定相似性，同样寻求在伤肢静脉血回流初期进行干预。血清实验结果证明灌注治疗明显减轻了模型猪肾功能的损害，降低了有毒细胞产物的血液浓度及炎症因子的表达，有效提高伤后存活率，对挤压综合征具有一定的防治作用。大量临床研究也证明早期合理的血液净化治疗可以更好的改善挤压综合征^[25-30]，说明对于严重挤压伤患者时间就是生命，尽可能早期及时的干预是治疗的关键点之一。

血清结果显示模型组动物再灌注后6 h时各指标水平均4 h时升高，提示即便在血供恢复以后，肌细胞的坏死崩解仍是持续存在的，因此应尽可能避免肌肉组织的继发损伤，这对控制毒素的释放和保肢具有重要意义。挤压发生后受压部位远端血流阻断，骨骼肌长时间缺血造成缺氧损伤，解压后血供突然恢复将不可避免的造成肌肉的进一步损伤，即缺血-再灌注损伤^[31]，加重肢体的坏死，重者导致截肢及甚至危及生命^[32^，^33]。

目前普遍认为缺血再灌注后氧自由基的大量生成在缺血-再灌注损伤中起到关键作用，其合成增多主要与线粒体单电子还原、黄嘌呤氧化酶增多、儿茶酚胺自氧化增强、钙超载以及中性粒细胞呼吸暴发等有关^[34]。其中线粒体内出现的“钙超载”现象，一方面影响氧化磷酸化和电子传递链、导致自由基生成增多^[35]，另一方面可使超氧化物歧酶生成减少，机体对自由基的清除能力降低，使氧自由基过量生成，引发脂质过氧化反应损伤细胞膜、细胞器乃至核酸，导致细胞溶解坏死。研究表明高浓度的氧自由基能够导致线粒体功能的丧失，而线粒体是内源性凋亡通路的重要起始部位，最终引发细胞凋亡^[36-38]，是缺血-再灌注损伤影响组织器官的重要途径和表现形式。研究显示其机制与氧自由基引发线粒体膜通透性转换孔开放有关，孔道开放导致线粒体通透性增加和膜电位下降，进一步影响氧化磷酸化的同时线粒体吸水膨胀、外膜破裂，线粒体内外膜间的促凋亡蛋白(如细胞色素C及凋亡诱导因子)等释放到细胞质中，进一步激活下游复杂的凋亡反应^[39-40]。

为了解决这一问题，课题组创新性的将中药脉络宁注射液作为灌注液加入灌注系统，脉络宁注射液是在四妙勇安汤的基础上研究成的中药复方注射剂，研究表明脉络宁注射液具有清除氧自由基、增加组织超氧化物歧酶活性、减轻骨骼肌及脑组织缺血再灌注损伤，保护内皮细胞缺氧损伤的作用^[41-44]。

实验结果显示肢体经脉络宁灌注后较模型组及常规灌注组骨骼肌丙二醛含量明显减少，超氧化物歧酶活性明显提高，表明脉络宁可以减轻肌组织氧化应激损伤，与以往研究报道相一致；经灌注后骨骼肌线粒体内细胞色素C及凋亡诱导因子含量较模型组、常规灌注组明显升高，但胞浆内明显降低，说明脉络宁可以减少凋亡因子自线粒体释放到胞外，抑制细胞凋亡发生，其机制可能通过对氧自由基的清除实现；电镜检测结果与其他结果保持一致趋势；且血清结果显示相较于常规灌注，经脉络宁灌注后细胞内容物肌红蛋白与肌酸激酶水平明显降低，提示脉络宁的应用可以一定程度上减轻肌细胞的溶解坏死，有益于挤压综合征的控制。此外，通过实验结果发现常规灌注组产生了与模型组相似程度的缺血-再灌注损伤，进一步印证了该系统模拟真实血供情况的作用。以上结果共同表明，相较于常规血液灌注，加入脉络宁注射液的灌注方法可以减轻骨骼肌的氧化应激及细胞凋亡，抑制骨骼肌缺血-再灌注损伤，在保护肢体的同时有助于控制全身挤压伤综合征的进展，是一种理想的灌注液选择。

综上所述，应用体外循环灌注系统对模型猪挤压伤肢体进行灌注的方法可以通过从源头上清除挤压伤肢体毒素的方式减轻肾功能损伤及炎症反应，同时在灌注液中加入脉络宁可以通过缓解肢体缺血-再灌注损伤，减轻伤肢肌肉损伤，从全身及局部改善模型猪挤压伤-挤压综合征，是一种系统全面的干预方法，应用前景值得期待。实验旨在为该疾病的临床诊疗提供一种新的思路与方法，目前处于初级阶段，仍存在一定的局限性，如残留侧支循环对结果的影响，缺乏对各项指标的长期跟踪，以及脉络宁清除自由基、抑制细胞凋亡的具体机制问题等都有待于在后续的研究中继续探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

体外循环灌注系统下应用脉络宁治疗下肢挤压伤-挤压综合征模型猪

Effect of combined application of extracorporeal circulation perfusion system and Mailuoning on crush injury and crush syndrome in pig models

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