胰岛素样生长因子结合蛋白2促进神经胶质瘤干细胞的增殖与迁移侵袭

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0999

摘要/Abstract

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文题释义：
胰岛素样生长因子结合蛋白2：是一种分子质量为31-32 ku的可溶性蛋白，由保守的N末端、C末端与高度可变中间区3个区域组成，其结构中含有18个半胱氨酸，组成9个链内二硫键，在蛋白与蛋白、蛋白与细胞外基质间发挥着重要作用。
ERK通路：是一组能够被细胞外信号分子激活的丝/苏氨酸蛋白激酶，是MAKP家族的重要组成部分，其可将细胞表面的信号传导给细胞核，调控细胞的生长和分化，蛋白磷酸化是其活化形式。

摘要
背景：目前关于血清胰岛素样生长因子结合蛋白2(recombinant insulin like growth factor binding protein 2，IGFBP-2)对神经胶质瘤影响的分子机制仍不明确，并且内源性IGFBP-2无法解释血清中IGFBP-2的一系列作用，需进一步阐明外源性IGFBP-2的作用。
目的：观察IGFBP-2干预后神经胶质瘤干细胞的增殖与迁移侵袭能力变化。
方法：采用免疫磁珠技术从人胶质瘤细胞U251细胞中分离CD133⁺胶质瘤干细胞，免疫荧光染色检测细胞CD133、Nestin的表达进行鉴定；将CD133⁺胶质瘤干细胞分2组干预，以500 μg/L IGFBP-2干预48 h作为实验组，未经IGFBP-2干预作为对照组。CCK-8法检测细胞增殖能力，Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力，采用Western blot检测PCNA、Ki-67、ERK及p-ERK蛋白表达。
结果与结论：①实验组培养2-5 d的吸光度值明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；实验组细胞增殖相关蛋白PCNA、Ki-67表达高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②实验组迁移细胞数明显多于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③实验组侵袭细胞数明显多于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④两组ERK蛋白表达无差异，但实验组p-ERK蛋白明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，IGFBP-2可促进神经胶质瘤干细胞的增殖、迁移与侵袭，并且ERK通路可能在其中发挥了一定的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4416-1503(赵伟)

关键词: IGFBP-2, 神经胶质瘤, 肿瘤干细胞, 细胞增殖, 细胞迁移, 细胞侵袭, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: To date, the molecular mechanism of recombinant insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP-2) on glioma is still unclear. Endogenous IGFBP-2 cannot explain a series of roles of IGFBP-2 in serum, and the roles of exogenous IGFBP-2 should be further elucidated.
OBJECTIVE: To observe the effect of IGFBP-2 on the proliferation, migration and invasion of glioma stem cells.
METHODS: CD133⁺ glioma stem cells were isolated from U251 human glioma cells by immunomagnetic bead technique. CD133 and nestin expression was detected by immunofluorescence staining. CD133⁺ glioma stem cells were divided into two groups: the cells were treated with 500 μg/L IGFBP-2 for 48 hours as experimental group, and the cells without intervention of IGFBP-2 as control group. Cell counting kit-8 method was used to detect cell proliferation ability. Transwell chamber assay was used to detect cell migration and invasion ability. Western blot assay was used to detect the expression of PCNA, Aki67, ERK and p-ERK proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: The cell absorbance of the experimental group was significantly higher than that of the control group at 2-5 days of culture (P < 0.05), and the expression of PCNA and Ki-67 in the experimental group was also significantly higher than that in the control group (P < 0.05). The number of migrated cells and invasive cells in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Although there was no difference in the expression of ERK protein between the two groups, the expression of p-ERK protein in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). To conclude, IGFBP-2 can promote the proliferation, migration and invasion of glioma stem cells, in which the ERK pathway may play a certain role.

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Key words: Neoplastic Stem Cells, Insulin-Like Growth Factor Binding Protein 2, Glioma, Cell Proliferation, Cell Movement, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

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引言

胰岛素样生长因子结合蛋白2(recombinant insulin like growth factor binding protein 2，IGFBP-2)是1986年由Mottola首先在BRL-3A细胞中发现的^[1-2]，随后学者开始对其展开了研究。IGFBP-2是一种分子质量为31-32 ku的可溶性蛋白，由保守的N末端、C末端与高度可变中间区3个区域组成，其结构中含有18个半胱氨酸，组成9个链内二硫键，在蛋白与蛋白、蛋白与细胞外基质间发挥着重要作用^[3-6]。IGFBP-2存在于体液中，其中在脑脊液中的含量较为丰富，主要由脑内脉络丛与软脑膜合成，参与大脑发育。在创伤、缺氧、细胞再生等非生理状态下，脑内的IGFBP-2含量会异常升高，并且升高的IGFBP-2主要来源于星形胶质细胞与小胶质细胞。

近年来的研究发现，IGFBP-2在中枢神经肿瘤患者肿瘤组织、血清中异常升高，所以可将其作为中枢神经肿瘤的一个特异性标志物^[7-9]。国内刘小兵^[10]检测了40例WHOⅠ-Ⅳ级胶质瘤患者血浆和脑脊液中的IGFBP-2水平，发现胶质瘤高级别患者血浆、脑脊液的IGFBP-2水平较高，并且术前IGFBP-2浓度低于术后3 d但高于术后2周，得出IGFBP-2与胶质瘤恶性程度相关，动态监测其在血清及脑脊液的浓度改变具有临床意义。已有研究证实IGFBP-2 mRNA及蛋白表达水平与脑胶质瘤的恶性程度呈正相关，提示IGFBP-2在脑肿瘤的恶性转化、肿瘤坏死及转移中起重要作用^[11-13]。目前关于血清IGFBP-2对神经胶质瘤影响的分子机制仍不明确，并且内源性IGFBP-2无法解释血清中IGFBP-2的一系列作用，需进一步阐明外源性IGFBP-2的作用。因此，实验主要观察外源性IGFBP-2干预对神经胶质瘤干细胞增殖与迁移侵袭能力的影响及可能的分子机制。

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材料方法

1.1 设计 体外对比细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年8至9月在川北医学院完成。

1.3 材料 人胶质瘤细胞U251(JN-B175，上海纪宁生物科技有限公司)；IGFBP-2(上海康朗生物科技有限公司)；胎牛血清(江苏科特生物科技有限公司)；CCK-8溶液、牛血清白蛋白、DMEM培养液、DMEM/F12培养液(北京索莱宝科技有限公司)；胰蛋白酶(上海雅心生物技术有限公司)；FITC标记的抗鼠IgG、抗兔IgG抗体及TRITC标记抗鼠IgG、抗兔IgG抗体(艾博抗(上海)贸易有限公司)；免疫磁珠分选试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)；干细胞培养液(上海斯丹赛(干细胞)生物技术有限公司)；结晶紫(成都莱宝科技有限公司)；兔抗人CD133单克隆抗体、鼠抗人Nestin单克隆抗体、PCNA一抗、Ki-67一抗、ERK一抗、p-ERK一抗(北京奥维亚生物技术有限公司)；酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；流式细胞仪(Guava EasyCyte^TM 8HT，美国)；Transwell小室(北京萌壮科技有限公司)；荧光显微镜、倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；凝胶电泳成像分析仪(BDA digital，德国)。

1.4 方法

1.4.1 胶质瘤细胞的培养 取含有人胶质瘤细胞U251细胞悬液的冻存管，置于37 ℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5 mL培养液；1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，入培养瓶中培养过夜。待细胞汇合80%时，消化传代。

1.4.2 胶质瘤干细胞的分离培养 参照以往文献中的方法分离肿瘤干细胞^[14]。取对数生长期的人胶质瘤细胞U251，制备成单细胞悬液，计数后重悬于300 μL含0.5%牛血清白蛋白、2 mmoL/L乙二胺四乙酸与PBS(pH=7.2)的MACS缓冲液中，首先加入100 μL Fc受体阻断剂，然后加入100 μL CD133微磁珠标记细胞，混匀，4 ℃避光放置30 min；加1 mL缓冲液，300×g离心10 min，弃上清液，加500 μL缓冲液，制成细胞悬液；将分离柱置于磁场中润洗，缓冲液重悬细胞后注入分离柱内，待悬液完全通过后用缓冲液冲洗分离柱，得到CD133^-细胞；去除磁场后快速冲洗分离柱，洗脱细胞为CD133⁺细胞。采用流式细胞仪检测细胞纯度：将磁珠标记的CD133⁺细胞(约含1×10⁶)重悬于DMEM培养基中，加入10 μL PE-CD133抗体，4 ℃孵育30 min，PBS洗涤后立即送流式细胞仪分析结果。将CD133⁺细胞接种于干细胞培养液(含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、2%B27、100 mg/L青霉素及100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养液)中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱培养，每三四天换液1次。取第3次传代的CD133⁺细胞进行脑肿瘤干细胞标志物CD133和Nestin免疫荧光检测。

1.4.3 细胞免疫荧光染色鉴定 取第3代CD133⁺细胞，接种于经多聚赖氨酸预处理过的载玻片上，加入1 mL 40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，0.01 mol/L PBS清洗3次， 5 min/次；滴加0.3%TritonX-100/PBS溶液室温通透20 min，0.01 mol/L PBS清洗3次，5 min/次；滴加含体积分数10%羊血清室温封闭30 min，洗去封闭液，滴加Nestin、CD133单克隆抗体，4 ℃过夜；0.01 mol/L PBS清洗3次，5 min/次；加入TRITC和FITC标记的荧光二抗，避光孵育1 h，PBS冲洗3遍，加入DAPI室温孵育10 min，PBS冲洗3遍，缓冲甘油封固，镜下观察。

取对数生长期的CD133⁺细胞，以500 μg/L IGFBP-2干预48 h作为实验组，未经IGFBP-2干预作为对照组进行下列实验。

1.4.4 细胞增殖能力 将CD133⁺细胞重悬为单细胞悬液，以每孔3×10⁴的密度接种于96孔板，共设置2组，每组设6个复孔，分别用含0(对照组)，500 μg/L(实验组) IGFBP-2的干细胞培养液培养5 d，每天检测增殖情况。具体方法为：每孔加入10 μL CCK-8溶液混匀，于37 ℃培养箱内孵育4 h，采用酶联免疫仪检测各孔在波长450 nm处的吸光度值，描绘细胞生长曲线。实验重复3次，最后取均值。

1.4.5 细胞迁移能力 取对数生长期的CD133⁺细胞，加入含0(对照组)，500 μg/L(实验组)IGFBP-2的干细胞培养液干预48 h后，消化细胞，采用无血清培养基调整细胞浓度，以4×10⁷ L^-1的细胞浓度铺于Transwell小室上层腔室，每孔200 μL；然后，将500 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基加入Transwell小室下层腔室，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养24 h，吸出上室内培养液，PBS清洗，用棉签将微孔膜上层的细胞擦拭去，在室温下用甲醇固定15 min，用0.1%结晶紫染色20 min，PBS清洗2次，每张膜中央及周围部分各随机取3个视野，在倒置显微镜下计数微孔膜下层的细胞，取均值^[15-16]。

1.4.6 细胞侵袭能力 先将1 g/L的Matrigel基质胶铺于Transwell小室(上层腔室)聚碳酸酯膜上，37 ℃放置1 h，然后在每孔加入200 μL DMEM培养基使胶重构；取对数生长期的CD133⁺细胞，加入含0(对照组)，500 μg/L(实验组)IGFBP-2的干细胞培养液干预48 h后，消化细胞，其余的实验步骤同1.4.5中迁移能力实验的内容。

1.4.7 Western blot检测相关蛋白表达 消化收集两组细胞，采用添加蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA裂解液裂解细胞，抽提总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。取蛋白约60 μg，采用SDS-PAGE凝胶电泳2 h，转膜；加入一抗[PCNA(1∶1 000)、Ki-67(1∶1 000)、ERK(1∶2 000)、p-ERK(1∶500)] 4 ℃孵育过夜，加入对应的二抗孵育2 h，采用凝胶电泳成像分析仪进行灰度测定。

1.5 主要观察指标 IGFBP-2干预后，CD133⁺胶质瘤干细胞增殖、迁移侵袭能力及ERK、p-ERK蛋白的表达变化。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0统计学软件进行组间t检验，设定检验水准为α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

神经胶质瘤是常见的原发性颅脑肿瘤，由大脑和脊髓胶质细胞癌变产生，每年发病率为3-8人/10万人，病因主要为遗传高危因素和环境致癌因素相互作用导致的，还有一些遗传易感因素，如神经纤维瘤病(Ⅰ型)及结核性硬化疾病等遗传疾病，目前主要有手术、放疗、化疗、靶向治疗等手段，治疗效果均不太理想，患者存活率仍较低。因此寻找有效的治疗方法是人们一直努力的方向。

CD133蛋白在白血病、脑肿瘤、大肠癌、前列腺癌等多种实体肿瘤干细胞中均有表达，提示其是一种广谱的肿瘤干细胞标志物，在肿瘤干细胞的分选和鉴定中具有一定的参考价值。Nestin是一种中间丝类型的蛋白，能够特异性表达在神经上皮干细胞上的一种分子标记物，在很多中枢神经系统肿瘤中呈阳性表达。实验采用免疫磁珠技术从胶质瘤细胞系中分选出CD133⁺细胞，经过体外培养，成功培养出悬浮生长的细胞球，免疫荧光染色显示，CD133⁺细胞Nestin及CD133表达呈阳性，鉴定其为胶质瘤干细胞。

除了神经胶质瘤，IGFBP-2在大多数肿瘤中异常表达，如肾上腺肿瘤^[17]、卵巢癌^[18]、前列腺癌^[19]、结肠癌^[20]、乳腺癌等^[21]，其在不同的肿瘤组织中发挥着不同的作用。但是目前关于IGFBP-2在神经胶质瘤中的作用机制及作用途径还在不断探索中。郭兆刚等^[22]采用免疫印迹筛选IGFBP-2高表达的胶质瘤细胞系，设计并合成了IGFBP-2特异的siRNA，将其导入筛选出的胶质瘤细胞系，采用MTT实验和流式细胞技术检测IGFBP-2下调对细胞增殖和细胞周期进程的影响，发现合成的IGFBP-2特异siRNA能够显著降低胶质瘤细胞系IGFBP-2的表达，siRNA介导的IGFBP-2表达下调可显著抑制胶质瘤细胞的增殖和细胞周期推进，得出了IGFBP-2对胶质瘤细胞的恶性表型具有促进作用的结论。因此实验进一步研究了IGFBP-2对胶质瘤干细胞增殖、迁移及侵袭能力等生物行为的影响，以期更进一步了解IGFBP-2的功能及为神经胶质瘤治疗提供一些新的选择思路^[23]。该研究采用外源性IGFBP-2干预神经胶质瘤干细胞，观察其增殖、迁移与增殖能力的变化，并分析其可能的作用途径。

CCK-8实验结果显示，随着培养时间的延长，未经IGFBP-2干预的胶质瘤干细胞增殖在第5天时有所下降；而经过IGFBP-2干预后，胶质瘤干细胞的增殖逐渐升高，并未出现下降现象，说明IGFBP-2可促进胶质瘤干细胞的增殖。韩圣等^[24]研究采用MTT比色法法检测外源性IGFBP-2对人胶质母细胞瘤细胞株U251增殖的影响，发现125，250，500 μg/L的IGFBP-2均可促进U251细胞的增殖(P<0.01)。但是早期有研究显示IGFBP-2对SHEP神经母细胞瘤增殖无影响^[25]。作者推测IGFBP-2对不同的神经胶质瘤细胞株可能具有不同的作用。因此研究只局限于人胶质瘤细胞U251一株，未来需要增加多株细胞进行对比，观察IGFBP-2对不同肿瘤细胞株的作用。

侵袭与转移是恶性肿瘤的基本属性之一，也是导致肿瘤患者死亡的重要原因之一^[26-29]。采用Transwell小室实验分析IGFBP-2对胶质瘤干细胞迁移与侵袭能力的影响。Transwell小室迁移实验显示，未经IGFBP-2干预的胶质瘤干细胞的迁移能力较差；经过IGFBP-2干预后，胶质瘤干细胞的迁移细胞数量明显增多，并且两组间迁移细胞数量比较差异有显著性意义，说明IGFBP-2可促进胶质瘤干细胞的迁移。Transwell小室侵袭实验显示，经过IGFBP-2干预后，实验组侵袭细胞数明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明IGFBP-2干预增强了神经胶质瘤干细胞的侵袭能力。综上可证实，IGFBP-2干预可促进神经胶质瘤干细胞的增殖、迁移与侵袭能力，与以往研究结果一致^[30]。

为了更进一步了解IGFBP-2促进胶质瘤干细胞增殖、迁移与侵袭能力的主要途径，该研究检测了IGFBP-2对ERK蛋白活化的影响。ERK通路是一组能够被细胞外信号分子激活的丝/苏氨酸蛋白激酶，是MAKP家族的重要组成部分，其可将细胞表面的信号传导给细胞核，调控细胞的生长和分化，蛋白磷酸化是其活化形式^[31-34]。多种胞外刺激可经G蛋白偶联受体、酪氨酸蛋白激酶受体或离子通道经Raf-MEK-ERK级联信号激活ERK，调节转录因子(如Elk-1、ATF2、STAT等)和一些激酶活性，促进细胞的增殖与蛋白质合成。多数研究已证实ERK信号转导通路参与调控肿瘤细胞的增殖与凋亡^[35-40]。Western blot检测结果显示，在经IGFBP-2干预前后，胶质瘤干细胞的ERK蛋白表达无明显变化，但是经过IGFBP-2干预后，胶质瘤干细胞的p-ERK蛋白明显升高，说明在IGFBP-2促进神经胶质瘤干细胞增殖、迁移与侵袭的过程中，ERK信号转导通路在其中发挥了一定的作用。

综上所述，该研究证实IGFBP-2可促进神经胶质瘤干细胞的增殖、迁移与侵袭，并且ERK通路可能在其中发挥了一定的作用；但是研究还有诸多不足：①研究只选择了一株胶质瘤细胞，并不具有普遍性，后期实验还应增加经典的胶质瘤细胞系；②通过PCR检测胶质瘤患者标本及分析胶质瘤细胞系的表达谱发现，IGFBP-2的表达涉及多条信号通路的转导，说明其作用途径复杂，后期需要大量实验围绕其上游调控分子与下游效应分子进行研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程