不同硬度聚丙烯酰胺调控骨髓间充质干细胞的定向分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0956

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 3981-3986.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0956

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

不同硬度聚丙烯酰胺调控骨髓间充质干细胞的定向分化

郭江龙，何静，吴方

四川大学，国家生物材料工程研究中心，四川省成都市 610000

修回日期:2018-05-29 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 吴方，研究员，四川大学，国家生物材料工程研究中心，四川省成都市 610000；并列通讯作者：何静，助理研究员，四川大学，国家生物材料工程研究中心，四川省成都市 610000
作者简介:郭江龙，男，1993年生，江西省泰和县人，2018年四川大学毕业，硕士，主要从事干细胞定向分化研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81671826)；国家重点研发计划(2016YFC1101903)

Directed differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells under regulation by polyacrylamide with different stiffness

Guo Jiang-long, He Jing, Wu Fang

National Engineering Research Center for Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Revised:2018-05-29 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Wu Fang, Researcher, National Engineering Research Center for Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China; He Jing, Assistant researcher, National Engineering Research Center for Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
About author:Guo Jiang-long, Master, National Engineering Research Center for Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81671826; the National Key Research and Development Research Program of China, No. 2016YFC1101903

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞微环境：是指细胞活动范围多种因素的组合，包括物理微环境和化学微环境。从单个细胞的角度讲，微环境主要由胞外基质、细胞周围同型异型细胞以及细胞分泌的生物因子、离子和蛋白构成，这些物质为细胞提供了生物化学信号。与此同时，细胞外基质的微观拓扑结构、机械性能以及器官活动引起的机械力变化也为细胞提供了生物物理信号，这些信号综合调节细胞的行为，但每一种因素的变化还与组织或细胞种类特异性相关。了解细胞微环境的物理、化学及生物要素，并在体外实现组织工程构建具有十分重要的意义。
材料微环境：包括材料的弹性、黏度以及细胞外基质涂层材料等。干细胞的定向分化受材料微环境因素的影响。当组织损伤时，干细胞接受体内信号并聚集迁移到受伤组织中发挥修复功能。但是，在很多临床案例中，由于组织损伤引发的炎症反应，大量异常的细胞外基质分泌并沉积，失去了原有的纤维化瘢痕，所形成微环境不能诱导迁移的干细胞进行定向分化，显著抑制了组织的再生功能。

摘要
背景：基底材料硬度可以直接影响干细胞的分化命运，但是干细胞向不同体细胞分化的敏感程度及调控机制目前尚不清楚。
目的：探讨基底力学性能对骨髓间充质干细胞分化的影响及其机制。
方法：通过调控聚丙烯酰胺的力学强度，使之弹性模量分别与神经组织(0.5 kPa)、软骨组织(10 kPa)、心肌组织(20 kPa)以及骨组织(40 kPa)类似。采用酶联免疫吸附法检测骨髓间充质干细胞在不同弹性模量基底上的分化情况，采用细胞骨架染色及免疫荧光染色观察骨髓间充质干细胞在基底上的细胞骨架形态以及黏着斑蛋白表达。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞在低硬度基底上向神经和软骨方向分化趋势明显，而高硬度基底上向心肌以及成骨方向分化的趋势不明显，说明骨髓间充质干细胞向神经以及软骨方向分化时，对材料的力学性能敏感，向心肌以及成骨方向分化时对材料的力学性能不敏感；②随着基底硬度的提高，黏着斑蛋白的表达量增高，说明在低硬度基底上，骨髓间充质干细胞感应的力学信号较低，激活了某些与软骨和神经分化相关的信号通路的表达，从而促进干细胞向神经和软骨方向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2084-4580(郭江龙)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 聚丙烯酰胺, 细胞分化, 细胞骨架, 力学信号, 黏着斑蛋白, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The hardness of substrate materials can directly affect the differentiation fate of stem cells, but the sensitivity and regulatory mechanism of stem cells differentiating into different somatic cells are still unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of substrate mechanical properties on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and its mechanism.
METHODS: In this study, the mechanical strength of polyacrylamide was modulated to be similar to that of nerve tissue (0.5 kPa), cartilage tissue (10 kPa), myocardial tissue (20 kPa) and bone tissue (40 kPa), respectively. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells on the substrate with different elastic moduli was detected using ELISA, and cytoskeleton morphology and vinculin expression were detected using cytoskeleton staining and immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells on the substrate with low stiffness trended to differentiate into nerve and cartilage, while the cells on the substrate with high stiffness had no obvious trend to differentiate into cardiocytes and osteoblasts. This indicated that bone marrow mesenchymal stem cells were sensitive to the mechanical properties of the material during nerve and cartilage differentiation, while were insensitive to the mechanical properties of the material during cardiocyte and osteoblast differentiation. (2) The expression level of vinculin increased as the substrate stiffness increased, indicating that the mechanical signals induced by bone marrow mesenchymal stem cells on low stiffness substrates are relatively low, which can activate certain signaling pathways related to cartilage and neural differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Acrylamides, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郭江龙，何静，吴方. 不同硬度聚丙烯酰胺调控骨髓间充质干细胞的定向分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 3981-3986.

Guo Jiang-long, He Jing, Wu Fang. Directed differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells under regulation by polyacrylamide with different stiffness[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 3981-3986.

图/表（结果） 2

2.1 动态力学分析弹性模量 通过动态力学分析的数据，可以发现最终聚丙烯酰胺的弹性模量与作者最初设计的弹性模量相近，实际的弹性模量分别为0.75，9，21，36 kPa，与神经组织、软骨组织、心肌组织和骨组织模量类似，见图1。

2.2 细胞增殖结果 细胞在弹性模量10，20，40 kPa的材料上培养时，细胞数量随着时间的增加而增加，而细胞在弹性模量0.5 kPa的材料上培养时，细胞数量始终处于较低的水平。总体来看，细胞的增殖结果为10 kPa>40 kPa>20 kPa>0.5 kPa，见图2。

2.3 细胞骨架与黏着斑蛋白复染结果 细胞在材料上第1天时，总体来看都偏弱，细胞在弹性模量0.5，10，40 kPa的材料上培养时，相对于20 kPa与对照组，骨架较为明显，这说明在第1天时细胞铺展不完全。

从鬼笔环肽的染色结果来看，第3天时细胞在弹性模量10 kPa与40 kPa的材料上培养时，细胞骨架较为清晰，细胞在弹性模量20 kPa和0.5 kPa的材料上培养时，骨架较弱，且细胞形态呈圆形。从细胞骨架的清晰程度来看，10 kPa>40 kPa>对照组>20 kPa>0.5 kPa。

从黏着斑蛋白的染色结果看，细胞在弹性模量40 kPa的材料上培养时，黏着斑蛋白的表达量最高。细胞在弹性模量20 kPa的材料上培养时，虽然骨架形态较弱，但是黏着斑蛋白的表达呈现较高的水平。在弹性模量10 kPa的材料上培养时，虽然细胞骨架最为清晰，但是黏着斑蛋白的表达量较低。细胞在弹性模量0.5 kPa的材料上培养时，黏着斑蛋白的表达量最低。总体来看，黏着斑蛋白的表达量为：对照组>40 kPa>20 kPa>10 kPa>0.5 kPa，见图3。

2.4 细胞分化相关标志物表达 微管蛋白、巢蛋白是神经细胞分化晚期的标志物。Ⅱ型胶原与聚焦蛋白聚糖广泛存在于软骨细胞外基质中，是软骨细胞分化的标志物。缝隙连接蛋白是一种表达在心肌细胞中的跨膜蛋白；心肌肌钙蛋白I存在于心肌细胞胞浆中，是心肌细胞分化的标志物。骨钙素在骨钙代谢调节中起重要作用；碱性磷酸酶是骨组织中合成的一类功能性酶，是成骨分化的标志物，见图4。

BMSCs在0.5 kPa的基底上培养时，随着培养天数的增加，神经分化相关蛋白微管蛋白、巢蛋白的表达量增多，巢蛋白的表达量在第14天时明显高于其他组，微管蛋白的表达量在第7天和第14天明显高于其他组的基底材料。

BMSCs在0.5 kPa与10 kPa的基底上培养时，软骨分化标志物Ⅱ型胶原的表达量在第14天时要显著高于其他组，而聚焦蛋白聚糖的表达量在10 kPa的基底上较高，尤其是在第3天与第5天时，表达量远高于其他组。

成骨分化的标志物碱性磷酸酶和骨钙素的表达量在4组基底上没有表现出明显的差别。

心肌细胞分化的特征蛋白缝隙连接蛋白和心肌肌钙蛋白I的表达，虽然在各组之间存在一定的差别，但无明显规律。

参考文献

[1] Guilak F, Cohen DM, Estes BT, et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix.Cell Stem Cell. 2009;5(1):17-26.

[2] Takahashi I, Masuda T, Kohsaka K, et al. Molecular Mechanisms of Mechanical Stress Response during Chondrogenesis. J Biome Sci Eng.2009;4(3):307-317.

[3] Angele P, Yoo JU, Smith C, et al. Cyclic hydrostatic pressure enhances the chondrogenic phenotype of human mesenchymal progenitor cells differentiated in vitro.J Orthop Res. 2003;21(3):451-457.

[4] 彭小玲. 弹性基底力学性能测量及其调控细胞粘附的机制研究[D]. 北京:北京大学, 2012.

[5] Dado D, Sagi M, Levenberg S, et al. Mechanical control of stem cell differentiation.Regen Med. 2012;7(1):101-116.

[6] Daley WP, Peters SB, Larsen M.Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine.J Cell Sci. 2008; 121(Pt 3):255-264.

[7] Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, et al. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.Cell. 2006;126(4):677-689.

[8] Oh SH, An DB, Kim TH, et al. Wide-range stiffness gradient PVA/HA hydrogel to investigate stem cell differentiation behavior. ActaBiomater. 2016;35:23-31.

[9] Wang LS, Du C, Chung JE, et al. Enzymatically cross-linked gelatin-phenol hydrogels with a broader stiffness range for osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. ActaBiomater. 2012;8(5):1826-1837.

[10] McAndrews KM, Kim MJ, Lam TY,et al.Architectural and mechanical cues direct mesenchymal stem cell interactions with crosslinked gelatin scaffolds.Tissue Eng Part A. 2014; 20(23-24):3252-3260.

[11] Seib FP, Prewitz M, Werner C, et al. Matrix elasticity regulates the secretory profile of human bone marrow-derived multipotentmesenchymal stromal cells (MSCs). Biochem Biophys Res Commun. 2009;389(4):663-667.

[12] Kwon HJ, Yasuda K.Chondrogenesis on sulfonate-coated hydrogels is regulated by their mechanical properties.J MechBehav Biomed Mater. 2013;17:337-346.

[13] Cameron AR, Frith JE, Cooper-White JJ.The influence of substrate creep on mesenchymal stem cell behaviour and phenotype.Biomaterials. 2011;32(26):5979-5993.

[14] Murphy CM, Matsiko A, Haugh MG, et al. Mesenchymal stem cell fate is regulated by the composition and mechanical properties of collagen-glycosaminoglycan scaffolds.J MechBehav Biomed Mater. 2012;11:53-62.

[15] Du J, Chen X, Liang X, et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity.ProcNatlAcadSci U S A. 2011;108(23):9466-9471.

[16] Shih YR, Tseng KF, Lai HY, et al. Matrix stiffness regulation of integrin-mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.J Bone Miner Res. 2011;26(4):730-738.

[17] McBeath R, Pirone DM, Nelson CM, et al. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.Dev Cell. 2004;6(4):483-495.

[18] Geiger B, Bershadsky A, Pankov R, et al. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2(11):793-805.

[19] Gingras AR, Ziegler WH, Frank R, et al. Mapping and consensus sequence identification for multiple vinculin binding sites within the talin rod.J Biol Chem. 2005;280(44): 37217-37224.

[20] Xing B, Jedsadayanmata A, Lam SC.Localization of an integrin binding site to the C terminus of talin.J Biol Chem. 2001;276 (48):44373-44378.

[21] Ulmer TS, Calderwood DA, Ginsberg MH, et al. Domain-specific interactions of talin with the membrane-proximal region of the integrin beta3 subunit. Biochemistry. 2003;42(27):8307-8312.

[22] Vogel V, Sheetz MP.Cell fate regulation by coupling mechanical cycles to biochemical signaling pathways.CurrOpin Cell Biol. 2009;21(1):38-46.

[23] Wang PY, Tsai WB, Voelcker NH.Screening of rat mesenchymal stem cell behaviour on polydimethylsiloxane stiffness gradients.ActaBiomater. 2012;8(2):519-530.

[24] Mao AS, Shin JW, Mooney DJ.Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 2016;98:184-191.

[25] Park JS, Chu JS, Tsou AD, et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β.Biomaterials. 2011;32(16):3921-3930.

[26] Wang LS, Boulaire J, Chan PP, et al. The role of stiffness of gelatin-hydroxyphenylpropionic acid hydrogels formed by enzyme-mediated crosslinking on the differentiation of human mesenchymal stem cell.Biomaterials. 2010;31(33):8608-8616.

[27] Zhang X, Jaramillo M, Singh S, et al. Analysis of regulatory network involved in mechanical induction of embryonic stem cell differentiation.PLoS One. 2012;7(4):e35700.

[28] Evans ND, Minelli C, Gentleman E, et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.Eur Cell Mater. 2009;18:1-13.

[29] Kraehenbuehl TP, Zammaretti P, Van der Vlies AJ, et al. Three-dimensional extracellular matrix-directed cardioprogenitor differentiation: systematic modulation of a synthetic cell-responsive PEG-hydrogel.Biomaterials. 2008; 29(18):2757-2766.

[30] Li Z, Guo X, Palmer AF, et al. High-efficiency matrix modulus- induced cardiac differentiation of human mesenchymal stem cells inside a thermosensitive hydrogel.ActaBiomater. 2012; 8(10):3586-3595.

[31] Gershlak JR, Resnikoff JI, Sullivan KE, et al. Mesenchymal stem cells ability to generate traction stress in response to substrate stiffness is modulated by the changing extracellular matrix composition of the heart during development. Biochem Biophys Res Commun. 2013;439(2):161-166.

[32] Puklin-Faucher E, Sheetz MP.The mechanical integrin cycle.J Cell Sci. 2009;122(Pt 2):179-186.

[33] Dupont S, Morsut L, Aragona M, et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.Nature. 2011;474(7350):179-183.

[34] Yang C, Zeisberg M, Mosterman B, et al. Liver fibrosis: insights into migration of hepatic stellate cells in response to extracellular matrix and growth factors.Gastroenterology. 2003;124(1):147-159.

[35] Li YY, Choy TH, Ho FC, et al. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation.Biomaterials. 2015;52:208-220.

[36] Carisey A, Ballestrem C.Vinculin, an adapter protein in control of cell adhesion signalling.Eur J Cell Biol. 2011;90(2-3): 157-163.

引言

近年，对干细胞体外分化影响因素的研究已从化学和生物方面开始聚焦于力学性能对干细胞分化的作用^[1-3]。越来越多研究表明，细胞外微环境及干细胞之间交互作用对调控干细胞生长、增殖和分化均具有非常重要的作用^[4]。近年来，研究人员通过调节基底材料的弹性模量，研究基质硬度对干细胞分化行为的影响及其机制^[5-6]。研究发现，基底材料的力学性能会直接影响干细胞分化命运的选择。Engler等^[7]分别在与脑组织、肌肉和骨骼类似的弹性基质上培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，发现BMSCs分别向神经细胞、肌细胞或骨细胞方向分化。Oh等^[8]通过制备不同弹性模量的聚乙烯醇/透明质酸复合水凝胶，成功调控BMSCs分化成神经细胞、骨骼肌细胞、软骨细胞、成骨细胞。越来越多的研究表明，基底材料的硬度对干细胞分化命运的选择起着重要的作用^[9-13]。BMSCs向不同细胞体系分化时，对材料力学刺激的敏感程度及其调控机制目前尚不清楚。因此，该研究重点关注BMSCs向不同方向分化对力学微环境的敏感度及其调控机制。

目前研究显示，黏着斑(vinculin)可以介导整合素与细胞骨架，对细胞感受力学刺激提供结构基础^[14-18]。黏着斑通过自身的功能结构与整合素连接并进一步与细胞骨架中的肌动蛋白发生作用^[19-21]。细胞在其运动过程中不断的通过细胞膜上伪足的伸长和收缩来探测外部环境，并将探测到的外部力学信号转换为细胞内化学信号来调节细胞的整体行为(如细胞增殖、细胞周期、细胞分化等)^[22]。在此过程中，整合素作为一个跨膜的黏着受体蛋白，介导由细胞外向细胞内的力-化学信号转导，而黏着斑蛋白作为黏着斑的主要组成成分，在整合素介导的力-化学信号转导通路中扮演重要角色^[23]。

因此，为了研究BMSCs定向分化的命运与力学性能之间的关系，通过调节聚丙烯酰胺原料配比溶度，分别制备弹性模量与神经组织、软骨组织、心肌组织和骨组织硬度相近的4种基底材料，通过不同硬度调节BMSCs分化命运，探究不同组织与基底硬度的相关性，并进一步探究黏着斑蛋白与细胞骨架对BMSCs分化命运的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年3至5月在四川大学生物材料楼细胞培养室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 7 d龄SD大鼠1只，性别不限，由四川达硕实验动物有限公司提供。

1.3.2 实验试剂 丙烯酰胺(Acrylamide，Sigma公司)；甲叉双丙烯酰胺(Methylene diacrylamide，Sigma公司)；过硫酸铵(Ammonium Persulfate，Sigma公司)；四甲醛二乙胺(Tetramethylethylenediamine，Sigma公司)；牛骨Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ，天津市赛宁生物工程技术有限公司)；Sulfo-SANPAH Crosslinker(Themo Fisher Scientific公司)；ELISA试剂盒(Blue Gene公司)；鬼笔环肽(Phalloidin，Sigma公司)；Vinculin一抗，二抗，核染料Hoechest(Sigma公司)；荧光素双醋酸酯(Fluorescein diacetate，FDA) (Sigma公司)；CCK-8试剂盒(DoJinDo公司)；胎牛血清(Hyclone，Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)；1%的青霉素链霉素(Gibco，Invitrogen Corporation，USA)；α-MEM培养基(Hali Corporation，Chengdu，China)。

1.4 实验方法

1.4.1 BMSCs的提取与培养 提取SD大鼠股骨和胫骨骨髓中的原代BMSCs，加入含体积分数为10%的胎牛血清、1%青霉素链霉素的α-MEM培养基，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养。每3 d更换1次培养基，待细胞长满后用胰蛋白酶消化并传代，传至第2代用于后续正式的细胞实验。

1.4.2 不同弹性模量聚丙烯酰胺的制备与性能测试 配置30%的丙烯酰胺溶液，1%的甲叉双丙烯酰胺溶液，10%的过硫酸铵溶液。通过改变丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的溶度的比例，分别制备弹性模量为0.5，10，20，40 kPa的聚丙烯酰胺^[24-26]。聚丙烯酰胺的弹性模量与之对应的原料配方见表1。通过动态力学分析仪检测水凝胶的弹性模量。

1.4.3 聚丙烯酰胺的表面改性 配置5 g/L的N-sulfosuccinyimidyl-6-(4′-azido-2′-nitrophenylamino)hexanoate(sulfo-SANPAH)溶液，滴加在聚丙烯酰胺表面，并用365 nm的紫外光照射30 min，如此反复2次，照射完成之后用PBS清洗剩余的光引发剂，随后在聚丙烯酰胺表面涂覆一层事先配置好的Ⅰ型胶原(2 g/L)，并在4 ℃条件下避光反应过夜。将改性好的材料在接种细胞之前分别用PBS与α-MEM培养基浸泡。

1.4.4 细胞增殖检测 将2×10⁴的BMSCs 1 mL接种在材料表面，以BMSCs直接在培养板上培养为对照组。在第3，5，7，14天时，吸出旧的培养基，加入含10% CCK-8试剂的培养基，置于细胞培养箱37 ℃条件下培养3 h，使用酶标仪在450 nm波长条件下测量吸光度，吸光度值的大小能够反映出细胞的增殖情况。

1.4.5 细胞分化相关标志物检测 为了考察BMSCs向神经元细胞、软骨细胞、心肌细胞、成骨细胞分化的情况，将细胞在材料表面分别培养3，5，7，14 d，取出培养基，采用酶联免疫分析试剂盒测定微管蛋白(β-tublin)、巢蛋白(Nestin)、Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ)、聚焦蛋白聚糖(Aggrencaan)、缝隙连接蛋白(connexin Protein，CX43)、心肌肌钙蛋白I(cadiactroponin I，CTNI)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)和骨钙素(osteocalcin，OCN)水平。通过酶标仪在450 nm波长条件下测定样品的吸光度值，与标准品的吸光度值对比，从而计算出蛋白的具体表达量。

1.4.6 黏着斑蛋白与细胞骨架复染 细胞在材料表面培养1，3 d时，采用鬼笔环肽与黏着斑蛋白复染，观察细胞骨架与黏着斑蛋白的表达情况。样品用PBS清洗3次后用40 g/L多聚甲醛固定，室温孵育20 min，同样用PBS清洗之后用0.1% PBS-T在4 ℃下孵育透膜，弃去PBS-T并清洗之后加4% PBS-B在37 ℃的条件下孵育30 min，加入黏着斑蛋白一抗4 ℃孵育过夜，弃去一抗用PBS清洗之后加入二抗室温避光孵育1 h，弃去二抗，PBS清洗，加入多聚甲醛固定10 min，再用PBS清洗之后加入事先配好的鬼笔环肽室温避光孵育40 min，弃去鬼笔环肽，用PBS清洗后加入Hoechest染细胞核，37 ℃孵育5 min。在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架以及黏着斑蛋白表达情况。

1.5 主要观察指标 ①激光共聚焦显微镜下的细胞骨架形态；②黏着斑蛋白表达；③神经、软骨、心肌、成骨分化标志物的表达量；④细胞增殖情况。

1.6 统计学分析 数据用SPSS 8.0软件进行单因素方差分析或t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

目前，学界普遍认为基底的力学性能对干细胞的定向分化有重要影响。基底的硬度通过影响细胞行为(如细胞骨架、细胞迁移)从而调控干细胞的定向分化^[27-34]。Mao等^[24]发现，BMSCs向成骨方向分化同时受到基底硬度以及细胞间相互作用的影响，较硬的基底以及细胞生长环境中细胞的数量能够促进成骨分化标志物碱性磷酸酶的表达。Li等^[35]发现未经改性的胶原支架能够促进干细胞骨架的铺展，从而促进软骨分化。

在该研究中可以看到，基底材料硬度为0.5 kPa时促进BMSCs向神经细胞方向分化；基底材料硬度为10 kPa时促进BMSCs向软骨方向分化；干细胞向心肌细胞方向分化的规律在各组基底上不明显，其中的原因一方面可能是力学调控对心肌细胞分化不敏感，另一方面可能是没有制备出合适的基底来调控心肌分化，其中的原因还需进一步实验确认。当基底硬度为40 kPa时，BMSCs向成骨分化的规律也不明显。ELISA的初步结果表明BMSCs向神经细胞以及软骨细胞分化时，对基底的物理性能十分敏感，BMSCs向心肌细胞以及成骨细胞分化时，对基底的物理性能不敏感。因此可以得出结论，BMSCs向不同的体细胞分化时对材料的力学性能的敏感程度不同，BMSCs向神经细胞以及软骨细胞分化时，对材料的力学性能较为敏感，但是BMSCs向心肌细胞以及成骨细胞分化的规律不明显，

为了进一步探究干细胞定向分化受力学性能调控的机制，进行了骨架染色与黏着斑蛋白的免疫荧光染色，对其中的机制问题进行了初步的探究。从细胞的骨架以及黏着斑蛋白的表达来看，BMSCs在10 kPa与40 kPa时，细胞骨架较为明显，而在其他基底材料上的细胞骨架较弱。而从黏着斑蛋白的表达来看，基底材料的硬度越高，黏着斑蛋白的表达量越高。综上所述，BMSCs向神经细胞以及软骨细胞分化时，受到基底材料硬度的影响十分明显，并且当黏着斑蛋白的表达较低的情况下，BMSCs向神经与软骨方向的趋势显著。

黏着斑在细胞内不仅可以与肌动蛋白纤维结合，并可以将肌动蛋白微丝锚定在细胞膜上，因此黏着斑在维持细胞形态、调节细胞黏附和迁移等方面发挥重要作用^[36]。近年来，许多研究表明，黏着斑蛋白作为黏着斑的一个重要组成成员，通过黏着斑介导整合素与细胞骨架相连，为整合素介导的细胞力-化学信号转导提供了结构基础^[19]。在该研究中，作者发现黏着斑蛋白的表达随着基底硬度的提高而提高，基底硬度越高，细胞感应到的力学信号越强。因此作者可以推测，BMSCs在0.5 kPa的基底上培养时，细胞骨架不明显，黏着斑的表达量最少，BMSCs此时感应的力学刺激最弱，黏着斑的低表达可能也影响到了BMSCs在某些方面的生理活动，如迁移、细胞黏附等，从而BMSCs向神经细胞方向分化。当BMSCs在10 kPa的基底上培养时，细胞呈现比较清晰的细胞骨架，黏着斑蛋白的表达比在0.5 kPa时高，但比BMSCs在20 kPa与40 kPa时低，此时BMSCs向软骨方向分化。综上说明，BMSCs向神经方向以及软骨方向分化时，感受到的力学信号较弱，黏着斑的表达水平较低，进而影响到干细胞的某些生理活动，这些生理活动进而会影响某些与细胞定向分化下游的信号通路的表达，不同程度地激活或者抑制某些信号分子。当然，具体影响到那些生理活动以及信号通路，值得进一步探究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同硬度聚丙烯酰胺调控骨髓间充质干细胞的定向分化

Directed differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells under regulation by polyacrylamide with different stiffness

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.