Notch信号通路和miR-21在周围神经损伤修复中的交互作用机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0931

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (32): 5139-5144.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0931

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Notch信号通路和miR-21在周围神经损伤修复中的交互作用机制

杨凯云，孙佩佩，武文亮，刘海春

山东大学齐鲁医院骨外科，山东省济南市 250012

收稿日期:2018-03-05 出版日期:2018-11-18 发布日期:2018-11-18
通讯作者: 刘海春，博士，副主任医师，山东大学齐鲁医院骨外科，山东省济南市 250012
作者简介:杨凯云，女，1987年生，山东省烟台市人，汉族，2012年山东大学毕业，硕士，研究实习员，主要从事骨基础相关研究。
基金资助:
山东省重点研发计划(2017GSF218047)

Interactions of Notch signaling pathway and miR-21 in peripheral nerve repair

Yang Kai-yun, Sun Pei-pei, Wu Wen-liang, Liu Hai-chun

Department of Orthopedics, Shandong University Qilu Hospital, Jinan 250012, Shandong Province, China

Received:2018-03-05 Online:2018-11-18 Published:2018-11-18
Contact: Liu Hai-chun, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, Shandong University Qilu Hospital, Jinan 250012, Shandong Province, China
About author:Yang Kai-yun, Master, Research assistant, Department of Orthopedics, Shandong University Qilu Hospital, Jinan 250012, Shandong Province, China
Supported by:
the Key Research and Development Program of Shandong Province, No. 2017GSF218047

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Notch信号通路：Notch是一类跨细胞膜受体蛋白，当其与受体结合并水解时，产生称为Notch胞内域的结构，作为转录因子调节目标基因表达。Notch信号通路与周围神经修复过程中的作用已经受到广泛关注。同时，Notch信号通路也被报道在维持干细胞特性以及介导数种干细胞向特定细胞系分化过程中均发挥重要作用。
微小RNA：是一类小分子的非编码单链RNA，其长度20-25个核苷酸。这些小RNA能够与特定的mRNA结合，调控或阻断蛋白编码基因的表达，控制其最终成为蛋白的过程。近年来，学者们发现其在骨髓间充质干细胞的多样化表达进程中具有重要调控作用，这种作用既可体现在转录水平上，又在转录后调控中得到显现，其中主要在转录后水平负性调控靶基因的表达。

摘要
背景：神经损伤修复是外科临床和基础研究的主要热点之一。小间隙套管治疗周围神经损伤的作用在前期研究中已经得到证实，但详细机制未能明确。同时Notch信号通路和微小RNA系统逐渐成为该领域的潜在热点，但二者的相关作用尚未得到明确报道证实。
目的：观察携带骨髓间充质干细胞的小间隙套管对周围神经损伤的治疗作用，探究Notch信号通路和miR-21在治疗过程中的相互作用关系。
方法：体内实验中制造SD大鼠喉返神经8 mm缺损模型，分为假手术组、小间隙组和小间隙+骨髓间充质干细胞组，治疗后测定电生理结果，Western blot测定Notch信号通路和微小RNA表达情况。体外实验中在小间隙套管内培养骨髓间充质干细胞并行神经元方向诱导，通过改变Notch/miR21表达情况，检测神经标记物的表达情况，分析骨髓间充质干细胞活性变化。
结果与结论：神经染色和肌电图结果均确认了骨髓间充质干细胞的治疗效果。在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中，Notch信号表达明显增强，miR-21表达明显上扬。通过进一步调控两因素表达发现，人为激活Notch信号或使miR-21过表达后骨髓间充质干细胞向神经分化的能力明显增强，抑制Notch信号后，骨髓间充质干细胞神经分化能力减弱，同时miR-21的促进作用失效。发现Notch信号通路和miR-21为骨髓间充质干细胞联合小间隙套接治疗周围神经损伤可能的重要促进机制，其中Notch信号通路具有更高级别的促进或抑制作用等级。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-1862-2812(刘海春)

关键词: 喉返神经, 周围神经损伤, 小间隙套接, miR-21, Notch通路, NICD, Hes-1, 骨髓基质干细胞, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Nerve injury repair is one of the major surgical hot spots in clinical and basic research. Small-gap sleeve method has been confirmed to have therapeutic effects on peripheral nerve injuries, but the detailed mechanism is unclear. The Notch signaling pathway and the microRNA system have gradually become potential hotspots in this field, but their interactions have not yet been clearly reported.
OBJECTIVE: To observe the performance of bone marrow mesenchymal stem cells-packed small-gap sleeve in the treatment of peripheral nerve injuries and to explore the interactions of Notch signaling pathway and miR-21 during the repair process.
METHODS: Models of 8 mm-recurrent laryngeal nerve defects were made in Sprague-Dawley rats and randomly divided into three groups: sham operation group, small-gap sleeve group and combined group (small-gap sleeve carrying bone marrow mesenchymal stem cells). After transplantation, neuroelectrophysiological results were measured, and the expression of Notch signal and miR-21 was determined by western blot assay. Bone marrow mesenchymal stem cells cultured in a small-gap sleeve undertook neuronal induction. By changing the expression of Notch/miR21, we detected the expression of neural markers and analyzed the activity of bone marrow mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells had therapeutic effects on peripheral nerve injuries as confirmed by neurostaining and electromyogram. During the neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, the expressions of Notch signal and miR-21 were significantly increased. Activation of Notch signal or miR-21 overexpression could strengthen the neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, while inhibition of Notch signal weakened the neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and miR-21 lost its promotion effect. Overall, Notch signaling pathway and miR-21 are considered to promote the therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cells combined with small-gap sleeve for peripheral nerve injuries, in which Notch signaling pathway has stronger promotion or inhibition roles.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Receptors, Notch, MicroRNAs, Peripheral Nerves, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

杨凯云，孙佩佩，武文亮，刘海春. Notch信号通路和miR-21在周围神经损伤修复中的交互作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(32): 5139-5144.

Yang Kai-yun, Sun Pei-pei, Wu Wen-liang, Liu Hai-chun. Interactions of Notch signaling pathway and miR-21 in peripheral nerve repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(32): 5139-5144.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析填充骨髓间充质干细胞的小间隙套管对体内周围神经损伤治疗作用实验中小间隙组和小间隙+骨髓间充质干细胞组各有1只大鼠在实验终点前不明原因死亡，分别给予补充实验补齐。评估抑制miR-21对骨髓间充质干细胞治疗作用影响的实验中30只大鼠全部成活至实验终点。

2.2 填充骨髓间充质干细胞的小间隙套管对大鼠喉返神经损伤治疗作用

2.2.1 神经电生理结果如图1所示，损伤后4周小间隙组神经传导速度和动作电位幅度均显著低于对照组，而小间隙+骨髓间充质干细胞组神经传导速度和动作电位幅度均显著高于小间隙组，接近对照组水平，说明小间隙+骨髓间充质干细胞组的治疗效果优于小间隙组。

2.2.2 实时PCR结果实验选取miR-21等5种微小RNA家族成员作为检测靶点，检测了微小RNA在大鼠离体后神经组织中的异位表达情况。结果显示各组miR-221、miR-222、miR-133b和miR-16表达水平接近，对照组和小间隙组miR-21表达水平接近，而小间隙+骨髓间充质干细胞组中miR-21表达水平明显高于其他2组(图2)。

2.2.3 Western Blot检测实验选取Hes-1和NICD作为指标以观察Notch信号通路在大鼠离体后神经组织中的表达情况。如图3所示，其中小间隙组两种蛋白的表达量稍高于对照组，差异无显著性意义；小间隙+骨髓间充质干细胞组两种蛋白的表达量明显高于其他2组。

2.3 miR-21和Notch信号通路的表达变化观察

2.3.1 miR-21和Notch信号通路表达动态测定在体外条件下将骨髓间充质干细胞加入小间隙套管中进行神经元方向诱导分化，连续测量结果可见miR-21的表达量随时间逐

渐增加(图4A)；Notch信号通路代表物Hes-1和NICD的表达亦随时间逐渐增强(图4B)，其中Hes-1的表达峰值出现于120 h时间点，NICD的表达峰值出现于144 h时间点。

2.3.2 过表达miR-21条件下干预Notch信号通路的改变观察实验首先证实在骨髓间充质干细胞中加入神经分化诱导剂后，其表达6种神经相关蛋白的能力明显增强。随后，在此体系中分别应用预先用miR-21模拟物转染的骨髓间充质干细胞使其过表达miR-21，或加入Notch通路激动剂使Notch信号通路被激活，2种条件下骨髓间充质干细胞表达6种蛋白的能力均得到明显上调(图5A)。如果在miR-21转染后的骨髓间充质干细胞体系中继续加入Notch通路抑制剂，则对6种蛋白的表达能力产生了明显的中和或抑制作用(图5B)，说明Notch通路具有凌驾于miR-21之上的否决作用。

2.3.3 抑制miR-21对治疗作用的影响将miR-21抑制剂处理的骨髓间充质干细胞填充套管后重复2.1内容中的体内实验，损伤后4周行神经电生理检查，结果miR-21抑制组神经传导速度与动作电位波幅均较对照组明显降低(图6)。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞形态学、分子生物学观察实验。

1.2 时间及地点 2016年1至11月在山东大学齐鲁医院口腔医学研究所实验室完成。

1.3 材料健康成年雄性SD大鼠80只，鼠龄4-6周，体质量200-230 g，由山东大学医学院动物实验中心提供，许可证号SCXK(鲁)20130009。实验经山东大学齐鲁医院伦理审批委员会审核，审批号KYLL-2016-134。

实验用主要试剂及仪器：Western-Blot相关一抗、二抗购自美国Abcam公司；PVDF膜购自美国Merck公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购自碧云天生物技术研究所；实时PCR各引物由北京赛百盛公司合成；实时PCR检测套装购自美国Promega公司；Jagged-1/Fc购自美国Enzo公司；γ-分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibtor，GSI)购自美国Selleck公司；miR-21模拟物及抑制物由上海生工生物技术公司设计并生产，转染采用Lipofectamine 2000™试剂盒；壳聚糖小间隙套管由北京大学人民医院提供，制备方法参考文献[13-14]。肌电图观测系统为NDI-200P型肌电诱发电位仪，购自上海海神公司。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞获取用氯胺酮和甲苯噻嗪腹腔注射处死3只SD大鼠，游离并取出股骨及胫骨，用含有胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素及链霉素的无菌DMEM缓冲液冲洗，消毒并去除杂质组织。分别将两骨的骨骺端去除，应用DMEM完全培养基反复冲洗骨髓腔获得骨髓细胞悬液，将该悬液全部接种于细胞培养瓶(25 cm²)中。将所有培养瓶静置培养于培养箱中，保持体积分数5% CO₂，温度维持37 ℃。24 h换液，观察生长状态，48 h贴壁细胞长满到75%以上传代，PBS冲洗2遍后，加入无血清培养基，用细胞刮刀轻轻刮起细胞，吹打几次，800 r/min离心10 min，体积分数10%胎牛血清，50 mg/L巨噬细胞集落刺激因子的α-mem培养液重悬细胞，按照1∶3的比例传代。待细胞长满75%后刮起细胞，灌注小间隙套管，灌注细胞数为1×10⁸。

1.4.2 填充骨髓间充质干细胞的小间隙套管对体内周围神经损伤治疗作用将45只大鼠随机分为对照组、小间隙组和小间隙+骨髓间充质干细胞组，各15只。对照组：实施假手术，暴露喉返神经组织，仅切开神经外膜并行缝合；小间隙组：在同一水平利刃切除部分喉返神经造成8 mm神经缺损，切除神经后即刻应用单纯小间隙套管连接断端；小间隙+骨髓间充质干细胞组：同方法切除喉返神经造成 8 mm缺损，切除神经后即刻应用填充骨髓间充质干细胞的小间隙套管连接断端，将损伤两端神经外膜与小间隙套管边缘缝合固定。

损伤后4周行神经电生理检查，分别对比观测两组甲杓肌神经诱发电位波幅及传导速度恢复情况，通过环甲膜刺入甲杓肌，以观察到肌电为准。刺激电极为1对单极针电极，将其搭于喉返神经近段，负极置于远端，地极刺入胸骨前皮下。肌电图观测参数为刺激强度0.2 mA，波宽0.1 ms，扫描速度1 ms/DIV，0.1 mV/DIV。

随后处死大鼠，获取损伤部位神经组织，Western Blot染色检测Notch信号通路相关蛋白Hes-1和NICD的表达情况：利用细胞裂解液收集组织中蛋白成分，按照BCA法测定蛋白样品浓度，采取SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉摇床常温封闭2 h。用抗Hes1和抗NICD的一抗稀释液稀释一抗，放入相应PVDF膜，4 ℃孵育过夜，次日加入HRP标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h。最后应用eECL发光液完成蛋白表达结果显影，利用影像分析软件记录结果。实验以β-actin作为内对照结果。

综合参考文献[11-12]，实时PCR筛查miR-21、miR-133b、miR-221、miR-222和miR-16五种miRNA的表达情况。利用TRIzol试剂盒自组织中提取总RNA，应用反转录套装将RNA反转录为cDNA，将获得的cDNA加入实时PCR系统，按照变性-退火-延伸三步法完成40个循环。反应结束后，根据扩增曲线和溶解曲线判断反应质量，用 2^-^△△^CT法鉴定相应miRNA的表达量，与正常对照组对照分析统计学意义。

1.4.3 骨髓间充质干细胞体外诱导分化中miRNA和Notch通路变化将骨髓间充质干细胞依次加入以诱导前培养基(胎牛血清+2% B27+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+ 20 μg/L表皮生长因子+100 U/mL青霉素+100 g/L链霉素)和诱导培养基(胎牛血清+10% 胎牛血清+2% B27+10μg/L 碱性成纤维细胞生长因子+10 μg/L表皮生长因子+ 100 U/mL青霉素+100 g/L链霉素)中，置于体外小间隙套管内培养，每24 h Western Blot染色检测Hes-1和NICD代表的Notch信号通路表达变化(方法同1.4.2)，实时PCR检测miR-21表达变化(方法同1.4.2)，自更换为诱导培养基日起连续测量7 d。

1.4.4 干预miR-21和Notch通路功能对骨髓间充质干细胞影响预先用miR-21模拟物转染部分骨髓间充质干细胞，将其分为miR-21阳性或阴性细胞，诱导分化后在分别加入Jagged-1/Fc嵌合蛋白(Notch 1通路激动剂，500 μg/L)或γ-分泌酶抑制剂GSI(Notch 1通路拮抗剂，1 μmol/L)处理细胞， Western Blot测定巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经型蛋白中链、β3微管蛋白六种神经细胞活性标志物的表达情况(方法同1.4.2)。β-肌动蛋白在测量中作为内对照。

为评估抑制miR-21对骨髓间充质干细胞治疗作用的影响，另取30只SD大鼠随机分为两组。同上文方法重复建立神经损伤模型，将未用miR-21抑制剂处理的骨髓间充质干细胞填充小间隙套管植入神经损伤处作为对照组，将应用miR-21抑制剂转染后的骨髓间充质干细胞填充套管作为miR-21抑制组。术后4周通过活体电生理检查比较两组间神经传导速度及动作电位波幅的差异(方法同1.4.2)。

1.5 主要观察指标 ①电生理指标结果；②Hes-1和NICD表达变化；③miR-21表达变化；④神经细胞活性标志物的表达变化。

1.6 统计学分析实验应用x(_)±s形式描述所有数据，采用SPSS 13.0统计软件(美国IBM公司)处理及分析数据结果。应用t 检验完成两组间数据分析，应用单因素方差分析完成多组间数据分析，Fisher最小显著差检验进一步完成多组间两两比较过程。应用非参数检验分析不符合正态分布或方差不齐的资料。P < 0.05为差异有显著性意义，显著性检验水准为α=0.05。

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讨论

近年来，小间隙人工神经套管在周围神经损伤领域取得了大量的基础研究成果，在临床研究中也得到了初步应用，但其与传统治疗方法相比优势仍十分有限，因此利用干细胞或其他技术强化其治疗效果，并深入探索其内在理论机制，是一种必然的研究方向。实验将骨髓间充质干细胞载入小间隙套管后治疗周围神经损伤获得了有效的强化治疗效果，改善了修复后神经组织形态，提高了神经信号的传导能力。同时实验发现Notch信号通路活化和miR-21表达上扬在这一过程中可能发挥了重要作用，Notch信号通路具有更高级别的促进或抑制作用强度。

近年来，Notch信号通路在周围神经损伤领域受到广泛关注，实验结果确认了Notch信号通路激活在所采用的治疗方案中的作用，其相关机制可能有两方面：①许旺细胞是周围神经损伤修复过程的核心成分之一，而Notch通路激活是这一过程中许旺细胞表型发生改变的重要特征^[15]。NICD的表达在横断后的周围神经组织中显著升高，而对其进行干扰最终可以导致神经髓鞘再生过程无法进行^[16]。反之，如果人为提高许旺细胞内NICD的表达量，可以观察到神经损伤后许旺细胞迅速进入去分化进程^[17]。因此许旺细胞的最终活化可能是治疗方案产生明显效果的机制之；②Notch信号通路可以介导数种干细胞分化过程，并且对于维持干细胞特性发挥重要作用^[18-19]。文献证实，Notch信号通路在神经系统中可以介导间充质干细胞的神经元方向分化，进而促进损伤后的神经功能康复过程^[20]。在Notch信号通路被激活后，细胞内开始进行Notch蛋白的切割清除过程，随后引导NICD进入细胞核，在转录层面进一步调节Notch相关目标及基因的表达，如Hes-1、细胞周期蛋白依赖性激酶2和p21^[21]，因此Notch信号通路活化可认为是治疗方案中骨髓间充质干细胞充分发挥作用的原因之一。

研究中同时筛选了数种miRNA的表达情况，最终发现miR-21的表达在骨髓间充质干细胞组中明显升高。miRNA是一种单链内源性小分子RNA，主要在转录后水平阶段调控目标基因的表达^[22-24]。在神经元的发育和分化过程中，miR-200家族被确认具有关键性调控作用^[25]。在神经保护和修复过程中，miR-21也被发现具有重要作用：如miR-21表达上调与颅脑损伤后神经逻辑功能的恢复具有明显相关性^[26]；miR-124可以促进骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞，并促进脊髓损伤后的功能康复^[27]；miR-21和miR-222可以通过抑制TIMP3以减少坐骨神经损伤后背根神经节的坏死，改善神经功能^[28]。实验进一步发现在体外骨髓间充质干细胞向神经组织诱导分化过程中，miR-21随时间进展表达浓度逐渐升高，证明了其在骨髓间充质干细胞的分化过程中也起到重要作用。同时，该过程中Notch信号通路活性也逐渐升高，证明了二者形成了某种相互作用的关系。

作者在最后重点探索了分别干预Notch通路和miR-21的功能对骨髓间充质干细胞神经方向分化的影响，结果显示应用Notch信号通路系统激活剂激活Notch信号通路系统，或应用miR-21模拟物提高miR-21表达，两过程均可以促进骨髓间充质干细胞的神经系统分化。该结果证明二者任一方的启动均可产生促进骨髓间充质干细胞分化的作用，同时也可能存在某种协同作用。添加Notch信号通路拮抗剂后，骨髓间充质干细胞的神经系统分化活性明显减弱。在另一条件下，应用miR-21抑制物处理骨髓间充质干细胞可以抑制骨髓间充质干细胞+小间隙套管疗法的治疗作用。该结果从另一方面证实二者任一方的抑制均可减弱骨髓间充质干细胞的神经修复活性。另一重要发现是抑制Notch信号通路活性后，不但可以单独抑制骨髓间充质干细胞的神经元样分化作用，同时miR-21高表达所介导的激活作用同样可以被减弱甚至中和。这说明Notch信号通路在否决效应上具有更强于miR-21的作用机制。前期文献报道可查得Notch和miR-21在Notch趋向急性T细胞型淋巴母细胞白血病中以及结直肠肿瘤发生过程中存在交互作用^[29-30]，但实验结果是二者在周围损伤领域交互作用的首次报道，这种交互作用有可能在周围神经损伤领域具有尚未发现的重要研究价值，值得后续研究进一步探索深入。

综上所述，研究证实了Notch信号通路和miR-21在骨髓间充质干细胞联合小间隙套管治疗周围神经损伤疗效中具有重要作用，二者任一方单独均可产生促进或抑制作用。研究首次证实在Notch信号通路和miR-21发生交互作用时，Notch信号通路具有更高级别的促进或抑制作用强度。这些结论为周围损伤领域进一步的理论机制研究提供了一个具有吸引力的参考方向。

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