pH敏感壳聚糖与地塞米松磷酸钠纳米载药体系制备及炎症抑制作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0919

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (22): 3550-3556.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0919

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pH敏感壳聚糖与地塞米松磷酸钠纳米载药体系制备及炎症抑制作用

陈娜¹，谢铁民²，张一凡²，王江¹，王庆峰²

¹解放军沈阳军区总医院中医科，辽宁省沈阳市 110016；²沈阳师范大学粮食学院，辽宁省沈阳市 110032

收稿日期:2018-06-11 出版日期:2018-08-08 发布日期:2018-08-08
通讯作者: 王庆峰，讲师，沈阳师范大学粮食学院，辽宁省沈阳市 110032
作者简介:陈娜，女，1981年生，辽宁省沈阳市人，汉族，辽宁中医药大学毕业，硕士，药师，主要从事药事管理，中药现代化研究。
基金资助:
沈阳市科技局，沈阳市科技计划项目(18-013-0-44)

Preparation and inflammation suppression of pH sensitive chitosan/dexamethasone sodium phosphate nano-drug delivery system

Chen Na¹, Xie Tie-min², Zhang Yi-fan², Wang Jiang¹, Wang Qing-feng²

¹Department of Traditional Chinese Medicine, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; ²College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110032, Liaoning Province, China

Received:2018-06-11 Online:2018-08-08 Published:2018-08-08
Contact: Wang Qing-feng, Lecturer, College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110032, Liaoning Province, China
About author:Chen Na, Master, Pharmacist, Department of Traditional Chinese Medicine, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
Supported by:
the Science and Technology Research Project of Shenyang, No. 18-013-0-44

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

壳聚糖应用于药物运输体系中的特性：具有生物吸附性能；pH敏感，不同的pH条件下释药速率可调；可提高药物的穿透作用，帮助疏水药物通过细胞膜；成胶条件温和，可与多种类型交联剂成胶；易修饰，壳聚糖表面大量羟基和氨基可根据要求修饰。目前壳聚糖应用于药物运输体系中的主要形式有纳米粒、微球和水凝胶。

地塞米松磷酸钠：是肾上腺糖皮质激素药物，参与人体糖、脂肪、蛋白质物质代谢，可制成针剂、口服及外用制剂。同其他糖皮质激素类药物相比，地塞米松磷酸钠属激素类长效药，具有更强的抗炎、抗毒素、抗休克作用，且无留钠、排钾作用，是抢救垂危患者不可缺少的“皮质激素药物之王”。

背景：在治疗肺部哮喘过程中，地塞米松磷酸钠存在毒性大、体内代谢时间短等问题，因此急需一种以缓释方式给药的地塞米松磷酸钠制剂，以解决上述问题。

目的：制备pH敏感壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒，考察其载药量、微观形貌、粒径分布及体外释放等特性，同时考察其炎症抑制作用。

方法：以壳聚糖为原料，采用离子凝胶法制备pH敏感壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒，检测其载药量、微观形貌、粒径分布及体外释放特性。将32只SD大鼠随机分为4组，正常组第0，7天分别皮下注射1 mL生理盐水，第14天起雾化吸入生理盐水1 mL，1次/d，30 min/次，连续7 d；哮喘组第0，7天分别皮下注射1 mL致敏液，第14天起雾化吸入含1%卵白蛋白的生理盐水1 mL，1次/d，30 min/次，连续7 d；对照组激发前30 min腹腔注射地塞米松磷酸钠(0.25 mg/kg)，其余同哮喘组；实验组激发前30 min腹腔注射壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒(地塞米松磷酸钠0.25 mg/kg)，其余同哮喘组；14 d后取肺组织，进行苏木精-伊红染色。

结果与结论：①随着地塞米松磷酸钠质量浓度的增加，壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒载药量逐渐增加； ②壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒为白色椭圆形，95%纳米颗粒直径在40-70 nm之间，平均粒径为53.2 nm；③在pH=7.4的模拟肠液中，地塞米松磷酸钠缓慢地从纳米颗粒中出来，120 min后全部释放；在pH=2.1和pH=4.6的模拟胃液中，120 min内没有地塞米松磷酸钠释放出来；④苏木精-伊红染色显示，哮喘组支气管平滑肌肥厚，黏膜充血水肿，并有大量炎症细胞浸润；对照组支气管炎症性有所减轻；实验组支气管炎症明显减轻，支气管壁周围仅有少量炎症细胞浸润；⑤结果表明，pH敏感壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒具有缓释功能，可抑制哮喘大鼠肺泡灌洗液中炎症细胞的产生。

ORCID: 0000-0002-2467-3205(陈娜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 壳聚糖, pH敏感性, 载药体系, 地塞米松磷酸钠, 炎症细胞, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: The clinical utilization of dexamethasone sodium phosphate in the treatment of asthma is limited due to its toxicity and short metabolic time, which means, a slow-release preparation of dexamethasone sodium phosphate is a good solution.

OBJECTIVE: To prepare a pH sensitive chitosan/dexamethasone sodium phosphate nanoparticle, and to investigate its drug loading, microstructure, particle size distribution, in vitro release characteristics, and anti-inflammatory effect.

METHODS: Chitosan as raw material was used to prepare pH sensitive chitosan/dexamethasone sodium phosphate nanoparticles by ionic gelation method. Drug-polymer interactions, morphology, particle size distribution and in vitro release characteristics of the nanoparticles were then detected. Thirty-two Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: the normal group was subcutaneously injected 1 mL of normal saline at days 0 and 7, and inhaled 1 mL of atomized saline, 30 minutes per day, from day 14 to day 21. The asthma group was subcutaneously injected 1 mL of sensitization solution at days 0 and 7, and inhaled 1 mL of atomized saline solution containing 1% ovalbumin, 30 minutes per day, from day 14 to day 21. The control group was intraperitoneally injected dexamethasone sodium phosphate (0.25 mg/kg) at 30 minutes before induction of asthma, and the other procedures were the same as those used in the asthma group. The experimental group was intraperitoneally injected chitosan/dexamethasone sodium phosphate nanoparticles (0.25 mg/kg dexamethasone sodium phosphate) at 30 minutes before induction of asthma, and the other procedures were the same as those used in the asthma group. Lung tissue samples from each rat were taken at day 14 for histological observation using hematoxylin-eosin staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the increase of dexamethasone sodium phosphate concentration, the drug-loading rate of chitosan/dexamethasone sodium phosphate nanoparticles increased gradually. (2) The chitosan/dexamethasone sodium phosphate nanoparticles obtained were white oval, 95% of which had a diameter of 40-70 nm, with the average diameter being 53.2 nm. (3) In the simulated intestine solution (pH=7.4), sodium dexamethasone phosphate was gradually released from the nanoparticles and completely released within 120 minutes. In the simulated gastric juice (pH=2.1 and pH=4.6), no sodium dexamethasone phosphate was released within 120 minutes. (4) Hematoxylin-eosin staining results showed that the bronchial smooth muscle in the asthma group was hypertrophic accompanied by mucosal hyperemia and edema and infiltration of plenty inflammatory cells. Bronchial inflammation was relieved in the control group, and considerably alleviated in the experimental group, where only a small number of inflammatory cells were infiltrated around the bronchial wall. We make a conclusion from these findings that pH-sensitive chitosan/dexamethasone sodium phosphate nanoparticles exhibit a slow-release potential, which can be used to inhibit the production of inflammatory cells in asthmatic rats given broncho-alveolar lavage

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Inflammation, Asthma, Delayed-Action Preparations, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

陈娜，谢铁民，张一凡，王江，王庆峰. pH敏感壳聚糖与地塞米松磷酸钠纳米载药体系制备及炎症抑制作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(22): 3550-3556.

Chen Na, Xie Tie-min, Zhang Yi-fan, Wang Jiang, Wang Qing-feng. Preparation and inflammation suppression of pH sensitive chitosan/dexamethasone sodium phosphate nano-drug delivery system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(22): 3550-3556.

图/表（结果） 5

2.1 壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒载药量的测定随着地塞米松磷酸钠加入量的增加，纳米颗粒的载药量也随之增加。重复数为10的条件下，当地塞米松磷酸钠的质量浓度依次为4，5，6 g/L时，地塞米松磷酸钠的载药量依次递增，分别为(24.13±1.29)%，(31.39±2.21)%，(36.98± 1.45)%，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，这与Pignatello等^[28]的文章结论是一致的。由于地塞米松磷酸钠溶液的pH为6.0，与地塞米松磷酸钠的解离常数pK2相近^[29]，而地塞米松磷酸钠电离为带两个负电荷的离子，可通过静电作用结合壳聚糖质子化的NH₃^{+ [30]}，在多聚磷酸钠的交联下形成纳米颗粒。另一方面，随着地塞米松磷酸钠质量浓度的递增，壳聚糖/地塞米松磷酸钠的载药量增长趋势却并未呈线性，如当地塞米松磷酸钠的质量浓度由4 g/L上升至5 g/L时，壳聚糖/地塞米松磷酸钠的载药量上升了近30%；当地塞米松磷酸钠的质量浓度由5 g/L上升至6 g/L时，壳聚糖/地塞米松磷酸钠的载药量上升了近17%，该结果说明当地塞米松磷酸钠的质量浓度为5 g/L时，该颗粒的载药量已达到峰值。

2.2 壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的红外光谱表征结果图3展示了地塞米松磷酸钠、壳聚糖/地塞米松磷酸钠和壳聚糖的红外光谱图，在1 458 cm^-1、1 380 cm^-1处的特征峰是P=O的振动引起的，并且在1 722 cm^-1和1 644 cm^-1的特征吸是C=O的振动引起的，而1 620 cm^-1特征峰是C=C伸缩振动引起的，这几个特征峰体现了地塞米松磷酸钠的分子结构特征^[27]；在2 390 cm^-1、1 090 cm^-1处的特征峰是由地塞米松磷酸钠和壳聚糖分子结构中的-CH₃和-C-O振动引起的；1 533 cm^-1特征峰是壳聚糖分子结构中的-NH3⁺基团的伸缩振动引起的^[31]。以上结果说明，地塞米松磷酸钠被包裹在壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒中。

2.3 壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒微观表征结果壳聚糖与地塞米松磷酸钠质量浓度比为1∶1制得相应的纳米颗粒，其形貌特征如图4所示，可以看出壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒为白色椭球形，大小约为50 nm。进一步采用激光粒度对所制得颗粒的粒径进行分析，如图5所示：95%的纳米颗粒直径在40-70 nm之间，平均粒径为 54.4 nm。

2.4 壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的体外释放性能如图6所示，为了研究壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒(壳聚糖与地塞米松磷酸钠质量浓度比为1∶1)的释放性能，样品被浸于不同pH值的缓冲液中。在pH=7.4的模拟肠液中，地塞米松磷酸钠缓慢地从纳米颗粒中出来，120 min后地塞米松磷酸钠全部释放；在pH=2.1和 pH=4.6的模拟胃液中，24 h内没有地塞米松磷酸钠释放出来。作为pH敏感的材料，壳聚糖可以有效控制其所包埋药物的释放速度，这是由于在模拟胃液中(pH=2.1和pH=4.6)，壳聚糖上存在质子化的-NH₃⁺，地塞米松磷酸钠也电离为带负电的分子，所以壳聚糖、地塞米松磷酸钠、多聚磷酸钠3者之间存在强烈的静电作用^[27-28]，导致地塞米松磷酸钠未能从纳米颗粒中释放出来；而在模拟肠液中(pH =7.4)，壳聚糖分子中的-NH₃⁺转化为-NH₂，此时壳聚糖、地塞米松磷酸钠、多聚磷酸钠之间的静电作用消失，引起地塞米松磷酸钠的释放。为进一步探讨壳聚糖/地塞米松磷酸钠的释放机制，将壳聚糖/地塞米松磷酸钠在pH=7.4条件下的释放曲线用R%= ktⁿ(power law model)进行拟合，其中，n是一个指数，当 0.43<n<0.85时，纳米颗粒中的药物释放属于控制扩散和溶解释放模型。经拟合得出：壳聚糖/地塞米松磷酸钠的拟合曲方程式为：y=0.205 0*t^0.35，n为0.35，属于Fickian释放模型^[32]。

2.5 各组大鼠肺组织病理学变化图7显示了地塞米松磷酸钠及壳聚糖/地塞米松磷酸钠颗粒对哮喘大鼠支气管炎症的治疗效果。可以看出，对照组大鼠支气管黏膜上皮结构完整，平滑肌无明显的增厚，肺泡壁清晰完整，间隔形态正常，无明显炎症细胞浸润；哮喘组大鼠支气管平滑肌肥厚，黏膜充血水肿，并有大量炎症细胞浸润，管腔内充满大量黏液，支气管壁周围有大量炎症细胞浸润；对照组大鼠支气管炎症改变有所减轻；实验组大鼠支气管炎症改变明显减轻，支气管壁周围仅有少量炎症细胞浸润。与单独使用地塞米松磷酸钠相比，由于以壳聚糖对地塞米松磷酸钠进行了包埋，该颗粒的缓释特性，使其可在炎症部分进行持续的治疗，因此壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒对大鼠肺部细胞炎症的抑制效果较单纯地塞米松磷酸钠效果要好。

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引言

地塞米松磷酸钠是肾上腺糖皮质激素药物，参与人体糖、脂肪、蛋白质物质代谢，可制成针剂、口服及外用制剂。同其他糖皮质激素类药物相比，地塞米松磷酸钠属激素类长效药，具有更强的抗炎、抗毒素、抗休克作用，且无留钠、排钾作用，是抢救垂危患者不可缺少的“皮质激素药物之王”^[1-2]。但口服地塞米松磷酸钠时，药物在胃、小肠部位很快释放吸收，在体内停留时间短，并且地塞米松磷酸钠有很强的毒副作用，加大口服剂量会引起全身不良反应，甚至死亡。因此，研发有效的地塞米松磷酸钠控释新剂型非常有意义^[3]。

20世纪60年代始，聚合物材料被用于药剂的研发和生产，以不同的方式组装成制剂，起到了调控药物释放速率、释放时间和释放部位的作用，对创造新剂型、提高药品质量和发展新型药物传输系统具有重要意义^[4-5]。聚合物载药体系主要为高分子聚合物载药体系，主要有水凝胶^[6]、纳米粒子^[7-8]、胶束和微球4大类^[9-11]。如地塞米松磷酸钠脂质体，李哲等^[11]以葡聚糖凝胶分离脂质体和游离醋酸地塞米松，制备醋酸地塞米松脂质体的滴眼液，获得了较高的封包率，其粒径较小，可显著延长药物的滞留时间。隋晓佳^[12]利用大豆油和蛋黄卵磷脂为载体材料，采用薄膜-超声法制备醋酸地塞米松纳米粒，所获得的球体均匀度较好，载药纳米粒的包封率约为96.71%。有研究以CaCl₂和Na₂HPO₄·12H₂O为前驱体，在十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮体系中，应用化学沉淀法制备纳米羟基磷灰石，其形态为长40-120 nm、宽约30 nm的纳米棒，并可负载地塞米松直接进行给药，在模拟体液环境中12 h的药物释放率为96.8%^[13]。聚乳酸多孔微球亦可成为地塞米松磷酸钠的载体，其所制备的载药多孔微球载药量为1 mg/g，40 d的药物释放率为61.6%。有研究以乳化-溶剂挥发法制备地塞米松微球后，再进一步应用静电纺丝技术制备胶原蛋白和聚己内酯复合地塞米松微球的纤维纳米支架，应用于大鼠脊髓缺损部位，发现所制得的材料与宿主无免疫反应，且随着时间的延长材料逐步降解。

壳聚糖作为载药材料最为常见，是多糖的一种，作为生命有机体中重要组分的天然高分子，在自然界中广泛存在，具备良好的生物相容性、生物可降解性、易加工等特性，能够在生物体中酶解成易被活体吸收、无毒副作用的小分子物质，不会残留在活体内^[14]。此外壳聚糖的手征性、可再生、吸湿保湿、起泡性、乳化性和成膜性等良好的性质，使其在医药、纺织、食品、化妆品等领域得到了广泛应用^[15-16]。

壳聚糖应用于药物运输体系中的特性有：具有生物吸附性能；pH敏感，不同的pH条件下释药速率可调；可提高药物的穿透作用，帮助疏水药物通过细胞膜；成胶条件温和，可与多种类型交联剂成胶；易修饰，壳聚糖表面大量羟基和氨基可根据要求修饰^[17]。目前壳聚糖应用于药物运输体系中的主要形式有纳米粒、微球和水凝胶^[18]。如万古霉素的壳聚糖颗粒，可配合磷酸钙骨水泥制备相应的支架，用于非负重骨缺损修复^[19]；壳聚糖可以为膜载体，通过负载苦参碱制备苦参碱/壳聚糖/羧甲基壳聚糖载药膜，用于治疗口腔黏膜溃疡^[20]；利用原位法可制备纳米羟基磷灰石与壳聚糖复合微球，有效解决骨缺损修复过程中的细菌感染问题^[21]。壳聚糖本身也是极好的微胶囊载药材料^[22]。壳聚糖在地塞米松缓释剂制备中也被广泛应用，如邓广汉^[23]应用壳聚糖对地塞米松进行修饰后，制备了脂肪乳滴眼液，其可大幅提升塞米松在体系中的溶解度，有效增加给药浓度；另外，其可提高地塞米松的生物膜黏附性，延长药物滞留时间，实现缓释释放效果，并有效增加药物在眼内的分布。韦舜^[24]以表皮细胞生长因子复合地塞米松及含奥硝唑制备了相应的壳聚糖膜，其可有效提升对兔口腔黏膜的修复特性。

如上文所述，与其他激素类药物相比，地塞米松磷酸钠属长效药，抗炎性更强，对呼吸系统特别是下呼吸道炎症有着极强的治疗作用，常被用于治疗小儿下呼吸道感染^[25]。然而，临床上地塞米松往往以吸入的方式进行给药，吸收度差，且基本无缓释特性，该治疗作用持续时间较短，仅在吸入期间可以作用于肺部炎症部位，极大限制了地塞米松疗效。因此，如果以载药方式对地塞米松进行包埋，制备特定的给药体系，可有效提升地塞米松的临床治疗效果。如何将其靶向定位于肺部，是该方法的关键。大量研究表明壳聚糖除了保证地塞米松的缓释性能外，亦可增加其在体系中的溶解度，因此，以壳聚糖对地塞米松进行包埋制备相应的颗粒，是解决地塞米松临床缺点的突破口之一。

基于上述目的，实验室开展了对壳聚糖/地塞米松磷酸钠载药体系的研究，首先采用离子凝胶法制备壳聚糖/地塞米松磷酸钠，并进一步考察了壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的载药量、微观形态、粒径及体外缓释等颗粒，以及其对肺部炎症模型的安全性及治疗作用，以期为壳聚糖负载抗炎类药物的给药研究提供依据，对实现地塞米松磷酸钠及其衍生物的靶向控释给药、提高药物疗效、降低药物生物毒性提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计药物材料制备实验。

1.2 时间及地点于2016年5至12月在沈阳师范大学粮食学院创新中心完成药物的制备(药物实验)，及在解放军沈阳军区总医院完成(动物实验)。

1.3 材料

实验动物： 3月龄具有相同遗传背景的雄性SD大鼠32只，清洁级，体质量(300±40) g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。经解放军沈阳军区总医院动物伦理委员会伦理审查通过后，于解放军沈阳军区总医院动物房进行饲养及后续实验研究。

实验主要材料与试剂：壳聚糖(上海蓝季科技，脱乙酰度≥85%)；地塞米松磷酸钠(天津天药药业股份有限公司)；多聚磷酸钠(上海凌峰化学试剂有限公司，CP)；乙酰甲胆碱(sigma)；氢氧化铝凝胶(Thermo)。

实验主要仪器：DDHZ-300台式恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂)；88-1型恒温磁力搅拌器(上海志威电器）；AL-204型电子天平；紫外-可见光谱Varian Cary 50；红外光谱仪(Nicolet Magna-IR 550Ⅱ)；透射电镜1230(JEOL)；离心机(Hettich Universal 32)；MWCO14000透析袋(上海绿鸟生物科技)；超速冷冻离心机(Backman)；雾化吸入器(BARI，MASTER)；-80 ℃超低温冰箱(Thermo)；移液枪(eppendorf)；12.5 cm弯头剪，弯头止血钳，镊子(上海医疗器械集团有限公司)；Reicher-Jung 820-Ⅱ型超薄切片机 (Reichert-Jung)；XDS-1B型生物显微镜(Olympus)。

实验主要试剂配制：致敏用卵白蛋白溶液配置方法：将1 mg卵白蛋白和10 mg Al(OH)₃凝胶溶于1 mL生理盐水中，现配现用；雾化用卵白蛋白溶液：1将0 mg卵白蛋白溶于10 mL生理盐水中用针管混匀，现配现用；1%戊巴比妥钠：将0.1 g戊巴比妥钠加入10 mL生理盐水中溶解，备用；将37%甲醛与ddH₂O按1∶9稀释，现配现用；乙酰胆碱激发液：用生理盐水将乙酰胆碱配成10，33，100， 330 mg/L等不同质量浓度的激发液。

1.4 实验方法

1.4.1 壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的制备壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的制备按照文献[26]报道的方法，略有改动。配置0.5 g/L的壳聚糖溶液，用HCl调pH值为5.5-5.7后备用。同时配置4.0，5.0，6.0 g/L的地塞米松磷酸钠溶液，调pH值为6.0后备用。将1 mL不同质量浓度的地塞米松磷酸钠溶液逐滴滴加到磁力搅拌下的8 mL的壳聚糖溶液中，继续搅拌10 min。再加入0.5 g/L多聚磷酸钠溶液1 mL，继续搅拌30 min。最后，18 000 r/min 4 ℃超速冷冻离心，冷冻干燥沉淀物。

1.4.2 地塞米松磷酸钠标准工作曲线的制作含地塞米松磷酸钠的PBS溶液在240 nm处有最大吸收值。将地塞米松磷酸钠溶于PBS中(pH=7.4)，分别配制3，6，9，12，15，18，21，24，27，30 mg/L的地塞米松磷酸钠-PBS溶液。分别取3 mL溶液，用紫外-可见光谱扫描全谱(图1)，绘制地塞米松磷酸钠的标准工作曲线(图2)。得其回归方程：Y=0.001 5+0.026 5 C[C(mg/L)为地塞米松磷酸钠的质量浓度，R²=0.999 27，n=11]。

1.4.3 壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的表征

粒径分布：根据文献[26]报道的方法进行。

壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒载药量的测定：取一定量干燥的壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒，放入15 mL离心管中，加10 mL PBS(pH=7.4)。将离心管置于37 ℃恒温摇床中，100 r/min水平震荡24 h，再5 000 r/min离心 5 min，取上清液测地塞米松磷酸钠的含量，按下述公式计算载药量^[27]。

LC(%)=m₁/m₂×100%，其中，LC为载药量；m₁为上清液中地塞米松磷酸钠质量(μg)；m₂为壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的质量(μg)。

壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱表征：用波长范围为4 000-500 cm^-1 Nicolet傅里叶变换红外光谱测定，取干燥后的壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒、地塞米松磷酸钠和壳聚糖，样品量与KBr的混合比例为1∶100，油压机上加压到80 Pa以上，维持3 min，制成厚度0.5-1.0 mm的薄片进行检测。

壳聚糖/地塞米松磷酸钠的激光粒度仪和透射电镜微观表征：用激光粒度仪测定纳米悬混液的粒径分布。取壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗，加高纯水稀释至一定倍数，制备成粒悬混液后滴加在铜网上，以2%磷钨酸钠液染色，在透射电镜下观察其粒径大小和形态。

释药行为：取所制得的壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒(壳聚糖与地塞米松磷酸钠质量浓度比为1∶1)，放入生理溶液浸泡过的透析袋中，透析袋两端夹紧；精密量取PBS 50 mL(pH=7.4)，放入100 mL烧杯中；将装药透析袋移入装有溶出介质的烧杯中，保持漏槽状态，密封杯口；将烧杯置于恒温震荡器内，(37±1) ℃下50 r/min水平震荡。定时取3 mL溶出介质，同时加入3 mL释放介质，紫外光谱分析介质中地塞米松磷酸钠的含量，计算得出地塞米松磷酸钠浓度和药物释放率，以累积释放率和时间关系作体外释药曲线。再分别用pH=2.1的PBS和pH=4.6的10%磷酸盐-柠檬酸/乙醇溶液测定地塞米松磷酸钠的释药率。

1.4.4 壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的药理活性

动物造模：将32只SD大鼠随机分4组，每组8只。正常组，第0，7天分别分3点皮下注射1 mL生理盐水，第14天起雾化吸入生理盐水1 mL，1次/d，每次30 min，连续7 d；哮喘组，第0，7天分别分3点皮下注射1 mL致敏液(卵白蛋白)，第14天起雾化吸入含1%卵白蛋白的生理盐水1 mL，1次/d，每次30 min，连续7 d；对照组，哮喘激发前30 min腹腔注射地塞米松磷酸钠(0.25 mg/kg)，其余同哮喘组；实验组，哮喘激发前30 min腹腔注射壳聚糖/地塞米松磷酸钠(地塞米松磷酸钠0.25 mg/kg)，其余同哮喘组。

14 d后安乐处死，取肺组织标本苏木精-伊红染色灌洗完后，取出未灌洗的右肺组织，中叶以体积分数10%中性甲醛溶液固定6 h，剩余肺组织液氮保存。甲醛固定后的右肺中叶组织，脱水后石蜡包埋，做组织切片，行苏木精-伊红染色。

苏木精-伊红染色：①组织脱水、透明、浸蜡：体积分数10%中性甲醛2 h；体积分数80%乙醇1 h；体积分数95%乙醇过夜；无水乙醇Ⅰ1 h；无水乙醇Ⅱ2 h；无水乙醇+丙酮(4∶1)30 min；二甲苯Ⅰ30 min；二甲苯Ⅱ30 min；石蜡Ⅰ(45-50 ℃)60 min；石蜡Ⅱ(56-58 ℃)60 min；石蜡Ⅲ(56-58 ℃)60 min；②组织经石蜡包理后，先用冰预冷，用切片机切成4 µm蜡片；③切片脱蜡染色、脱水、透明、封固：二甲苯Ⅰ10 min；二甲苯Ⅱ10 min；无水乙醇2 min；体积分数95%乙醇2 min；体积分数80%乙醇2 min；自来水洗2 min；苏木精染色10 min；自来水洗1 min；1%盐酸乙醇分3 s；水洗10 s；促蓝液返蓝30 s；流水冲洗15 min；0.5%伊红水溶液染色2 min；自来水洗3 s；体积分数80%乙醇3 s；体积分数95%乙醇3 s；无水乙醇10 s；石碳酸二甲苯(1∶4)5 min；二甲苯Ⅰ2 min；二甲苯Ⅱ2 min；二甲苯Ⅲ2 min；中性树胶封固，显微镜观察并拍照。

1.5 主要观察指标 pH敏感壳聚糖/地塞米松磷酸钠纳米颗粒的载药量、微观形貌、粒径分布及体外释放等特性，以及炎症抑制作用。

1.6 统计学分析实验过程中，全部实验数据以PASW Statistics 18.0.0 (SPSS 18.0)进行计算。获得的计量资料，以x(_)±s表示，以独立样本t 检验进行实验；计数资料以卡方检验进行，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

pH敏感壳聚糖与地塞米松磷酸钠纳米载药体系制备及炎症抑制作用

Preparation and inflammation suppression of pH sensitive chitosan/dexamethasone sodium phosphate nano-drug delivery system

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