血管内皮生长因子165、神经营养因子3、血管生成素1基因转染诱导骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0909

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 3956-3962.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0909

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

血管内皮生长因子165、神经营养因子3、血管生成素1基因转染诱导骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞分化

蒋星海，赵彪，吴凯，肖仁顺，王晓梅

南昌大学第二附属医院，江西省南昌市 330000

修回日期:2018-02-25 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 宋玉林，博士，主任医师，南昌大学第二附属医院，江西省南昌市 330000
作者简介:蒋星海，男，1991年生，江西省上饶市人，汉族，2018年南昌大学毕业，硕士，医师，主要从事脊髓损伤修复组织工程材料研究。
基金资助:
国家自然科学基金(30801158，81360271)；江西省自然科学基金计划(20151BAB205051)；江西省教育厅课题(GJJ09086，GJJ14054)；江西省卫生厅课题(20081078)

Transfection with vascular endothelial growth factor 165, neurotrophin 3 and angiopoietin 1 induces the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neurons and vascular endothelial cells

Jiang Xing-hai, Zhao Biao, Wu Kai, Xiao Ren-shun, Wang Xiao-mei

Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330000, Jiangxi Province, China

Revised:2018-02-25 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Song Yu-lin, M.D., Chief physician, Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330000, Jiangxi Province, China
About author:Jiang Xing-hai, Master, Physician, Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330000, Jiangxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30801158, 81360271; the Natural Science Foundation of Jiangxi Province, No. 20151BAB205051; the Project of Jiangxi Provincial Department of Education, No. GJJ09086, GJJ14054; the Project of Jiangxi Provincial Department of Health, No. 20081078

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
诱导血管再生的细胞因子：血管再生形成过程中需要各种细胞因子调节，血管内皮生长因子是已知的诱导血管再生作用最强的生长因子，其中血管内皮生长因子165的活性最强，分布最为广泛，是在体内发挥生理作用的主要形式。血管内皮生长因子通过与Flk1结合，促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化及内皮细胞浸润，诱导血管再生。然而，血管内皮生长因子可引起微血管通透性增加、神经组织水肿等副作用。血管生成素1可对抗血管内皮生长因子介导的血管通透性增高，调节内皮细胞存活，抑制炎性递质渗出及减轻水肿；神经营养因子3则可通过酪氨酸激酶受体-3(NTPK-3/TrkC)诱导神经前体细胞分化为神经元，通过转分化诱导骨髓间充质干细胞分化为功能性神经元。
感染复数：传统的感染复数概念起源于噬菌体感染细菌的研究，其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为感染复数是一个比值，没有单位。后来感染复数被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。通过摸索合适的感染复数值使病毒转染达到满意的效率。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞是一种多功能间充质干细胞，具有多向分化潜能，可通过腺病毒转染等方法对其进行基因修饰，使其能够产生多种生长因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、神经营养因子3(neurotrophin 3，NT-3)、血管生成素1(angiopoietin 1，Ang-1)等，从而应用于组织工程研究中。
目的：探讨VEGF165、NT-3、Ang-1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞诱导分化的可能性。
方法：采用差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，进行流式细胞术和成骨、成脂诱导分化能力鉴定。以巨细胞病毒(CMV)作为启动子，构建2个腺病毒载体，其一为双顺反子载体，携带hVEGF165及Ang-1基因(Adv-Bic)；其二为携带NT-3基因载体，即AdvNT-3。以不同感染复数值将Adv-Bic(绿色荧光)及AdvNT-3(红色荧光)同时转染大鼠骨髓间充质干细胞，转染2 d后根据荧光显微镜下绿色及红色荧光蛋白表达情况确定最佳感染复数值。将生长良好的第3代骨髓间充质干细胞分为2组，实验组以最适感染复数值转染Adv-Bic(无荧光标记)及AdvNT-3(无荧光标记)；对照组以相同感染复数值转染空白对照病毒。两组分别于体外培养7 d后进行免疫荧光及qPCR检测。
结果与结论：①间质干细胞表面分子CD29、CD44呈阳性表达，造血干细胞表面分子CD34、CD45呈阴性表达。骨髓间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞及脂肪细胞；②病毒转染骨髓间充质干细胞48 h后荧光显微镜下观察有绿色及红色荧光蛋白表达，随着感染复数值增大荧光表达量逐渐增强，感染复数值为100时荧光表达最强烈；③免疫荧光及qPCR结果显示，实验组VEGF165、NT-3、Ang-1表达水平高于对照组，且血管内皮特异性标记物CD31、CD34表达水平高于对照组，神经元特异性标记物NSE、Nestin表达水平高于对照组；④结果提示，VEGF165、NT-3、Ang-1基因转染骨髓间充质干细胞，使其过表达VEGF165、NT-3、Ang-1生长因子，能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为神经元及血管内皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0469-4148(蒋星海)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 基因转染, 血管内皮生长因子165, 神经营养因子3, 血管生成素1, 神经化, 血管化, 脊髓损伤, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are a kind of multifunctional mesenchymal stem cells that have multi-directional differentiation potential. These cells can be genetically modified by methods such as adenovirus transfection, to produce a variety of growth factors such as neurotrophin-3 (NT-3), angiopoietin-1 (Ang-1), and vascular endothelial growth factor (VEGF). BMSCs have been applied as seed cells in tissue engineering research.
OBJECTIVE: To transfect VEGF165, NT-3 and Ang-1 gene into rat BMSCs and to induce them to differentiate into neuronal cells and vascular endothelial cells.
METHODS: BMSCs were isolated using differentia velocity adherent method and identified by flow cytometry. Differentiation potential of BMSCs into osteogenesis and adipogenesis was also identified. We constructed two adenoviral vectors with cytomegalovirus (CMV) as a promoter. One of the two vectors was a bicistronic vector (Adv-Bic), carrying hVEGF165 and Ang-1 gene; the other vector was an AdvNT-3 vector, carrying NT-3 gene. Adv-Bic (green fluorescence) and AdvNT-3 (red fluorescence) were simultaneously transferred into rat BMSCs at various multiplicities of infection (MOIs). Two days after the transfection, the optimal MOI value was determined based on the expression of green and red fluorescent proteins under a fluorescence microscope. Then, well-grown BMSCs at passage 3 were divided into two groups. The experimental group was transfected with Adv-Bic (without fluorescence) and AdvNT-3 (without fluorescence) at the optimal MOI. The control group was transfected with blank control virus at the same MOI. The two groups were cultured in vitro for 7 days and then were detected with immunofluorescence and qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of CD29 and CD44, which are identifications of BMSCs, was positive, while the expression of CD34 and CD45, which are identifications of hematopoietic stem cells, was negative. BMSCs could be differentiated into osteoblasts and adipocytes. After BMSCs were transfected with adenovirus for 48 hours, the expression of green and red fluorescent proteins was observed under a fluorescence microscope. With the increase of MOIs, the intensity of fluorescence gradually increased, and peaked when MOI was equal to 100. Immunofluorescence and qPCR results showed that the expression of VEGF165, NT-3 and Ang-1 in the experimental group was higher than that in the control group. The expression level of CD31 and CD34, the markers of vascular endothelium, in the experimental group was higher than that in the control group. The expression level of neuron-specific markers NSE and Nestin in the experimental group was higher than that in the control group. These results suggested that VEGF165, NT-3 and Ang-1 genes were successfully transfected into BMSCs. This transfection made BMSCs overexpress growth factors of VEGF165, NT-3 and Ang-1, which could induce BMSCs to differentiate into neuronal cells and vascular endothelial cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Vascular Endothelial Growth Factors, Neurotrophin 3, Angiopoietin-1, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

蒋星海，赵彪，吴凯，肖仁顺，王晓梅. 血管内皮生长因子165、神经营养因子3、血管生成素1基因转染诱导骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 3956-3962.

Jiang Xing-hai, Zhao Biao, Wu Kai, Xiao Ren-shun, Wang Xiao-mei. Transfection with vascular endothelial growth factor 165, neurotrophin 3 and angiopoietin 1 induces the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neurons and vascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 3956-3962.

图/表（结果） 2

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞形态及鉴定结果 细胞接种培养48 h后，倒置显微镜下可见少量梭形细胞开始贴壁生长，接种第3天显微镜下观察可见由大量长梭形细胞组成的多个细胞集落散在分布于培养皿底(图1A)，培养7 d后细胞大量增殖并融合，呈梭形、多角形或扁平形(图1B)。传至第2，3代的单个细胞形态呈典型的长梭形或纺锤状，融合后呈放射状或漩涡状排列(图1C，D)。

大鼠骨髓间充质干细胞免疫表型鉴定：见图2。流式细胞术检测结果显示间充质干细胞表面分子CD29、CD44阳性表达率为97.1%，99.8%(图2C，D)，造血干细胞表面分子CD34、CD45阳性表达率为1.61%，1.71%(图2E，F)。

大鼠骨髓间充质干细胞成骨、成脂诱导分化能力：骨髓间充质干细胞在成骨诱导2周时进行茜素红染色，倒置显微镜下可观察到大量钙结节(图3A)；成脂诱导2周时进行油红O染色，倒置显微镜下可观察到细胞出现脂滴(图3B)。

2.2 病毒转染最佳MOI值 以不同MOI值将Adv-Bic(绿色荧光)及AdvNT-3(红色荧光)同时转染大鼠骨髓间充质干细胞，培养2 d后，荧光显微镜下观察。随着MOI值增高，绿色及红色荧光表达量均相应增多，当MOI=100时两种荧光到达高峰(图4A-H)。MOI为300时部分细胞死亡，MOI为1 000时大量细胞死亡。因此，MOI=100时能达到最佳的转染效果。

2.3 免疫荧光检测结果 转染VEGF165、NT-3、Ang-1基因的骨髓间充质干细胞在体外培养7 d后，通过免疫荧光检测VEGF165、NT-3、Ang-1均阳性表达(图5A-C)。血管内皮标记物CD31，CD34均阳性表达(图5D，E，H)；神经元相关标记物NSE、Nestin均阳性表达(图5F-H)。

2.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果 实验组中转染的目的基因VEGF165、NT-3、Ang-1表达水平均明显高于对照组(P < 0.05)；实验组血管内皮细胞相关基因CD31、CD34表达水平明显高于对照组(P < 0.05)；实验组神经元相关基因NSE、Nestin表达水平明显高于对照组(P < 0.05)，见图6。

参考文献

[1] Fan WL, Liu P, Wang G, et al. Transplantation of hypoxic preconditioned neural stem cells benefits functional recovery via enhancing neurotrophic secretion after spinal cord injury in rats. J Cell Biochem. 2017 Sep 8. doi: 10.1002/jcb.26397. [Epub ahead of print]

[2] Suzuki H, Ahuja CS, Salewski RP, et al. Neural stem cell mediated recovery is enhanced by Chondroitinase ABC pretreatment in chronic cervical spinal cord injury. PLoS One. 2017;12(8):e0182339.

[3] Ao Q, Wang AJ, Chen GQ, et al. Combined transplantation of neural stem cells and olfactory ensheathing cells for the repair of spinal cord injuries. Med Hypotheses. 2007;69(6):1234-1237.

[4] Stewart AN, Kendziorski G, Deak ZM, et al. Co-transplantation of mesenchymal and neural stem cells and overexpressing stromal-derived factor-1 for treating spinal cord injury. Brain Res. 2017; 1672:91-105.

[5] He X, Li L, Tang M, et al. Biomimetic electrical stimulation induces rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into cardiomyocyte-like cells via TGF-beta 1 in vitro. Prog Biophys Mol Biol. 2017 Sep 29. doi: 10.1016/j.pbiomolbio.2017.09.023. [Epub ahead of print]

[6] Guo S, Zhen Y, Wang A. Transplantation of bone mesenchymal stem cells promotes angiogenesis and improves neurological function after traumatic brain injury in mouse. Neuropsychiatr Dis Treat. 2017;13: 2757-2765.

[7] Cai S, Tsui YP, Tam KW, et al. Directed Differentiation of Human Bone Marrow Stromal Cells to Fate-Committed Schwann Cells. Stem Cell Reports. 2017;9(4):1097-1108.

[8] Zhang H, Wang L, Wen S, et al. Magnetic resonance imaging tracking and assessing repair function of the bone marrow mesenchymal stem cells transplantation in a rat model of spinal cord injury. Oncotarget. 2017;8(35):58985-58999.

[9] Pu Y, Meng K, Gu C, et al. Thrombospondin-1 modified bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) promote neurite outgrowth and functional recovery in rats with spinal cord injury. Oncotarget. 2017; 8(56):96276-96289.

[10] 莫翠萍,王家传,周光前,等.骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的神经分化研究[J].中华细胞与干细胞杂志:电子版, 2015,5(4):33-39.

[11] Ye Y, Feng TT, Peng YR, et al. The treatment of spinal cord injury in rats using bone marrow-derived neural-like cells induced by cerebrospinal fluid. Neurosci Lett. 2018;666:85-91.

[12] 司翠平,卞合涛,闫中瑞,等.Wnt信号在骨髓间充质干细胞神经分化中的研究进展[J].中华脑科疾病与康复杂志:电子版, 2015,5(3):192-195.

[13] Zhang W, Zeng YS, Zhang XB, et al. Combination of adenoviral vector-mediated neurotrophin-3 gene transfer and retinoic acid promotes adult bone marrow cells to differentiate into neuronal phenotypes. Neurosci Lett. 2006;408(2):98-103.

[14] Polisetti N, Chaitanya VG, Babu PP, et al. Isolation, characterization and differentiation potential of rat bone marrow stromal cells. Neurol India. 2010;58(2):201-208.

[15] Zhang W, Zhang F, Shi H, et al. Comparisons of rabbit bone marrow mesenchymal stem cell isolation and culture methods in vitro. PLoS One. 2014;9(2):e88794.

[16] Zhu X, Du J, Liu G. The comparison of multilineage differentiation of bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells. Clin Lab. 2012;58(9-10):897-903.

[17] Song K, Huang M, Shi Q, et al. Cultivation and identification of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Mol Med Rep. 2014;10(2): 755-760.

[18] Niu CC, Lin SS, Yuan LJ, et al. Identification of mesenchymal stem cells and osteogenic factors in bone marrow aspirate and peripheral blood for spinal fusion by flow cytometry and proteomic analysis. J Orthop Surg Res. 2014;9:32.

[19] Zhang HT, Liu ZL, Yao XQ, et al. Neural differentiation ability of mesenchymal stromal cells from bone marrow and adipose tissue: a comparative study. Cytotherapy. 2012;14(10):1203-1214.

[20] Hofstetter CP, Schwarz EJ, Hess D, et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(4):2199-2204.

[21] Han S, Wang B, Li X, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional culture promote neuronal regeneration by neurotrophic protection and immunomodulation. J Biomed Mater Res A. 2016;104(7):1759-1769.

[22] Feng L, Gan H, Zhao W, et al. Effect of transplantation of olfactory ensheathing cell conditioned medium induced bone marrow stromal cells on rats with spinal cord injury. Mol Med Rep. 2017;16(2): 1661-1668.

[23] Bronckaers A, Hilkens P, Martens W, et al. Mesenchymal stem/stromal cells as a pharmacological and therapeutic approach to accelerate angiogenesis. Pharmacol Ther. 2014;143(2):181-196.

[24] Lin RZ, Melero-Martin JM. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 2012;56(3):440-451.

[25] Ng YS, Krilleke D, Shima DT. VEGF function in vascular pathogenesis. Exp Cell Res. 2006;312(5):527-537.

[26] Kim HM, Hwang DH, Lee JE, et al. Ex vivo VEGF delivery by neural stem cells enhances proliferation of glial progenitors, angiogenesis, and tissue sparing after spinal cord injury. PLoS One. 2009;4(3): e4987.

[27] Ng MT, Stammers AT, Kwon BK. Vascular disruption and the role of angiogenic proteins after spinal cord injury. Transl Stroke Res. 2011; 2(4):474-491.

[28] Herrera JJ, Sundberg LM, Zentilin L, et al. Sustained expression of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 improves blood-spinal cord barrier integrity and functional recovery after spinal cord injury. J Neurotrauma. 2010;27(11):2067-2076.

[29] Bai Y, Yin G, Huang Z, et al. Localized delivery of growth factors for angiogenesis and bone formation in tissue engineering. Int Immunopharmacol. 2013;16(2):214-223.

[30] Zhang YJ, Zhang W, Lin CG, et al. Neurotrophin-3 gene modified mesenchymal stem cells promote remyelination and functional recovery in the demyelinated spinal cord of rats. J Neurol Sci. 2012; 313(1-2):64-74.

引言

脊髓损伤的修复是临床医生面临的一大难题，脊髓损伤后脊髓微血管崩解，血脊髓屏障完整性遭到破坏，产生缺血缺氧环境，导致局部细胞死亡及空洞形成，缺乏神经细胞及诱导因子等导致神经修复困难。近年来许多研究表明神经干细胞移植对神经修复有促进作用^[1-4]。然而有活力的神经干细胞主要从胚胎或新生哺乳动物脑或脊髓中获取，其取材不易且受到伦理限制。骨髓间充质干细胞是一种多功能间充质干细胞，能够自我更新，可在合适的诱导条件下分化为心肌细胞、血管内皮细胞、神经元等细胞^[5-7]。它可以从哺乳动物自身骨髓获取，易于提取分离，可行自体移植，具有强大的增殖能力和多向分化潜能。因此，骨髓间充质干细胞是脊髓损伤研究中较为理想的种子细胞^[8-9]。研究发现在体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后，移植到大鼠损伤脊髓，能促进损伤脊髓修复^[10-11]。

目前，体外实验常用的骨髓间充质干细胞神经定向分化诱导方法有化学试剂诱导法、神经细胞生长因子诱导法、神经细胞共培养诱导法、基因转染诱导法等。化学试剂诱导分化率较高，但分化后神经样细胞存活时间很短，不能满足临床的需要；神经生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化后的神经样细胞存活时间明显延长，但分化率却偏低；基因转染能使骨髓间充质干细胞持续分泌多种生长因子，增加分化率，具有高效可行性^[12]。另外，基因转染的骨髓间充质干细胞作为种子细胞，与组织工程支架结合，可直接移植到损伤脊髓，为损伤脊髓的修复提供细胞及生长因子。

实验通过基因转染的方法，对骨髓间充质干细胞进行基因修饰^[13]，使其过表达血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF165)、神经营养因子3(neurotrophin 3，NT-3)、血管生成素1(angiopoietin 1，Ang-1)等生长因子，观察其对细胞分化的影响，为后期实验构建血管化神经修复模块提供种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察。

1.2 时间及地点 实验于2016年10月至2017年11月在南昌大学第二附属医院分子中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4-6周龄雄性SD大鼠20只，体质量80-100 g，由南昌大学医学院动物中心提供。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM/F12培养基(Hyclon公司)；澳洲胎牛血清(Gibco公司)；成骨诱导分化培养基、成脂诱导分化培养基(Cyagen公司)；引物序列(生工生物工程(上海)股份有限公司)；胰酶-EDTA消化液(Solarbio公司)；TRIzol(Invitrogen公司)；HiScript Q RT SuperMix for Qpcr (Vazyme公司)；RealStar Green Fast Mixture(Genstar公司)；BSA、DAPI(Servicebio公司)；免疫荧光一抗：VEGF165(小鼠多克隆抗体)、NT-3(兔多克隆抗体)、Ang-1 (小鼠多克隆抗体)、CD31(小鼠多克隆抗体)、CD34(小鼠多克隆抗体)、NSE(兔多克隆抗体)、Nestin(小鼠多克隆抗体)(Servicebio公司)；免疫荧光二抗：CY3标记山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor488标记山羊抗兔IgG(Servicebio公司)；流式抗体：CD29、CD34、CD45、CD44(Biolegend公司)；倒置显微镜、正置荧光显微镜(日本Nikon公司)；实时荧光定量PCR仪(ABI Stepone plus)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞分离培养 4-6周龄SD大鼠脱颈处死，体积分数为75%乙醇浸泡5 min，无菌条件下分离双侧股骨和胫骨，PBS清洗2次后去除股骨和胫骨末端显露髓腔，用含体积分数为12%胎牛血清的DMEM/F12培养基冲洗髓腔并收集细胞悬液，再经过细胞过滤筛滤过后接种于100 mm细胞培养皿，放入含体积分数为5%CO₂、37 ℃的细胞培养箱中培养，48 h后首次换液，换液时用PBS冲洗2次，去除不贴壁细胞，以后每2 d换液1次。当培养皿内细胞均匀铺满融合至80%-90%时按1∶2的比例传代。

1.4.2 骨髓间充质干细胞鉴定 取第3代大鼠骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶室温下消化2.0-3.0 min，显微镜下观察见到贴壁细胞大部分变圆时加入完全培养液终止消化，收集细胞悬液，离心1 000 r/min×5 min，加少量PBS吹打均匀，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1。于EP管中每管中加入100 μL细胞混悬液，分别加入流式单克隆抗体CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC，CD44-PE各5 μL；对照组加入PBS，避光室温孵育30 min，PBS洗涤2次以去除未结合的抗体，离心弃上清后，以每管500 μL PBS重悬均匀，流式细胞仪进行检测分析。

1.4.3 体外定向成骨诱导分化 取培养的第3代骨髓间充质干细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，以2×10⁵/皿的细胞密度加入6孔板，待细胞汇合达80%，加入成骨诱导液(含体积分数10%胎牛血清，0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠的低糖DMEM培养液)，每3 d换液1次，培养2周后茜素红染色鉴定。

1.4.4 体外定向成脂诱导分化 取培养的第3代骨髓间充质干细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，以2×10⁵/皿的细胞密度加入6孔板，待细胞汇合达80%，吸弃培养液，加入成脂诱导液(含体积分数为10%胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，200 μmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，10 μmol/L胰岛素的低糖DMEM培养液)，每3 d换液1次，培养2周时镜下观察见透亮脂滴形成即可进行油红O染色鉴定。

1.4.5 病毒构建与转染 以巨细胞病毒(CMV)作为启动子，构建2个腺病毒载体，其一为双顺反子载体，携带hVEGF165及Ang-1基因(Adv-Bic)，内部有核糖体进入位点区域；其二为携带NT-3基因载体，即AdvNT-3。在293细胞中扩增，以氯化铯梯度超速离心法进行纯化，将载体母液滴度范围调控为每毫升1×10¹²-1×10¹³病毒基因组拷贝，以相同方法构建携带GFP绿色荧光标记的Adv-Bic及携带RFP红色荧光标记的AdvNT-3，将载体母液滴度范围调控为每毫升1×10¹²-1×10¹³病毒基因组拷贝。

将第3代生长良好的骨髓间充质干细胞消化计数后稀释至1×10⁸ L^-1加入96孔板，每孔100 μL(1×10⁴个细胞)，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养过夜。在EP管中配制6个梯度的含Adv-Bic(绿色荧光)及AdvNT-3(红色荧光)的培养液(均稀释到100 μL完全培养基)，取MOI=3，10，30，100，300，1 000。把稀释好的病毒和细胞孵育4-8 h，吸取带有病毒的培养液，在每个孔中再加入100 μL完全培养基。培养2 d后倒置显微镜观察细胞形态，荧光显微镜观察荧光。根据荧光细胞的比例估算最合适的MOI值。

1.4.6 免疫荧光检测 将第3代生长良好的骨髓间充质干细胞消化计数后稀释至1×10⁹ L^-1加入24孔板，每孔200 μL (2×10⁵个细胞)，最佳MOI值(MOI=100)转染无荧光标记的Adv-Bic及AdvNT-3。培养7 d后，40 g/L多聚甲醛固定样本30 min。采用免疫细胞化学双标记技术，室温下血清封闭20 min(山羊来源一抗用体积分数为10%正常兔血清封闭，其他来源的一抗用3%BSA封闭)，滴入一抗后4 ℃过夜，PBS洗涤3次，加入二抗室温孵育50 min，PBS洗涤3次，滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min，于荧光显微镜下观察并采集图像。一抗为小鼠多克隆抗体VEGF165(稀释比1︰200)、兔多克隆抗体NT-3(稀释比1︰200)、小鼠多克隆抗体Ang-1(稀释比1︰500)、小鼠多克隆抗体CD31(稀释比1︰500)、小鼠多克隆抗体CD34(稀释比1︰500)、兔多克隆抗体NSE(稀释比1︰300)、小鼠多克隆抗体Nestin(稀释比1︰300)，二抗为CY3标记山羊抗小鼠IgG(稀释比1︰300)，Alexa Fluor488标记山羊抗兔IgG(稀释比1︰400)。

1.4.7 实时荧光定量PCR 将第3代生长良好的骨髓干细胞消化计数后稀释至1×10⁹ L^-1加入6孔板，每孔2 mL (2×10⁶个细胞)。实验分为2组，实验组以最佳MOI值(MOI=100)转染无荧光标记的Adv-Bic及AdvNT-3；对照组以同样MOI值转染对照空白病毒，于体积分数为5%CO₂、37 ℃的细胞培养箱中培养7 d，PBS洗涤2遍，加入1 mL TRIzol试剂立即吹打将细胞裂解，转入无菌的1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心10 min，收集上清转入新的无菌EP管中，加入0.2 mL氯仿，12 000 r/min 4 ℃离心15 min，分3层，将上层的RNA转移至另一无菌的EP管中，加入等量异丙醇后12 000 r/min离心10 min，弃去上清，用体积分数为75%的无水乙醇洗涤RNA沉淀，离心后倒出乙醇，加入无RNA酶水20 μL溶解。用分光光度计分析其浓度和纯度，用2%的琼脂糖电泳检验RNA。利用HiScript Q RT SuperMix for qPCR(Vazyme)为原料将总RNA反转录为cDNA。运用实时荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)检测，引物见表1。利用ABI7500RT-PCR系统(Applied Biosytems)行定量PCR。PCR循环的程序如下：95 ℃，10 min；40个循环95 ℃15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s。每个扩增反应体系为20 μL，每组样本重复检测3次。以GAPDH为内参，采用2^-^??Ct方法计算mRNA相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的形态观察与鉴定结果，以及转染2种腺病毒的荧光检测结果；②基因转染的骨髓间充质干细胞在体外培养7 d后，血管内皮细胞特异性标记物及神经元特异性标记物的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行处理，所有计量数据均以x(_)±s表示。两两比较采用独立样本t 检验，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

大鼠骨髓干细胞属间充质干细胞，其培养技术己成熟，如密度梯度离心法、贴壁筛选法、免疫磁珠法、流式细胞仪分离法^[14-15]。间充质干细胞虽然表达CD29、CD44、CD71、CD90等表面抗原，而不表达CD11a、CD14、CD34、CD38和CD45等表面抗原^[16]，但是细胞表面缺乏特异性，目前没有特定的某一种表面标记物能作为鉴定骨髓间充质干细胞的“金标准”。一般认为细胞呈类纤维细胞形态，培养可以贴壁分裂增生，表达CD44、CD29等阳性标记物，而不表达CD34、CD45等阴性标记物，且具有多向分化潜能，可初步判断为间充质干细胞^[17-18]

实验采用差速贴壁法成功分离并培养骨髓间充质干细胞，形态学观察可见细胞呈现典型的间充质干细胞形态，呈长梭形、漩涡状或纺锤状。应用流式细胞仪检测结果显示，CD34和CD45等造血干细胞和内皮细胞表面标志抗原表达阴性，阳性率小于5%；而间充质干细胞表面标志抗原CD29、CD44表达阳性，阳性率超过95%，细胞均一性较好，纯度较高。细胞在成骨、成脂培养基的诱导下，可以向成骨细胞、脂肪细胞分化，结果证实了其具有间质干细胞的多向分化潜能^[19]。

向神经元分化的种子细胞、营养因子和支架材料是脊髓损伤后再生需要的3个基本条件。干细胞移植能为损伤局部提供足够的向神经元分化的种子细胞，骨髓干细胞能通过旁分泌的形式分泌多种细胞因子发挥作用，被广泛应用于脊髓损伤的研究中。Hofstetter等^[20]将小鼠骨髓干细胞移植入同种鼠受损脊髓中，通过BBB评分及组织学检测，证明骨髓干细胞移植后可以向神经元分化，并促进脊髓损伤后截瘫动物的恢复。Han等^[21]通过移植含骨髓干细胞的胶原支架，对小鼠损伤脊髓的修复起促进作用。Feng等^[22]将嗅鞘细胞培养基诱导的大鼠骨髓干细胞移植于同种大鼠损伤脊髓中，显著减少了脊髓损伤腔的面积，促进脊髓损伤后神经纤维的再生，促进运动功能的恢复。然而骨髓干细胞虽然能分泌多种生长因子具有保护神经组织及诱导血管新生的潜能^[23]，但是向血管、神经分化的生长因子相对不足。脊髓损伤理想的种子细胞应是能够向脊髓修复所需要的方向转化或分化。实验通过对骨髓间充质干细胞进行基因转染，使其能够表达脊髓损伤修复所需的生长因子，能直接移植入受损脊髓中，而无需在体外诱导后移植，且该种子细胞能够向神经及血管方向分化，是脊髓组织工程研究中理想的种子细胞。

脊髓损伤修复过程中，微血管再生是一个重要的环节。新生血管网的形成、完整血脊髓屏障的建立，能为损伤局部细胞提供营养及排泄废物^[24]。血管再生形成过程中需要各种细胞因子调节，其中VEGF是已知的诱导血管再生作用最强的生长因子^[25]。VEGF是家族有4种亚型存在，分别为VEGF121、165、189和206，其中VEGF165的活性最强，分布最为广泛，是在体内发挥生理作用的主要形式。VEGF通过与Flk1结合，促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化及内皮细胞浸润，诱导血管再生^[26]。然而，VEGF可引起微血管通透性增加、神经组织水肿等副作用^[27]。Ang-1可对抗VEGF介导的血管通透性增高，调节内皮细胞存活，抑制炎性介质渗出及减轻水肿^[28-29]；NT-3则可通过酪氨酸激酶受体3 (NTPK-3/TrkC)诱导神经前体细胞分化为神经元，通过转分化诱导骨髓间充质干细胞分化为功能性神经元^[30]。

实验通过基因转染技术，将3种基因通过腺病毒同时转染至骨髓间充质干细胞。转染2 d后显微镜下可观察到红色及绿色荧光，证实转染成功。当MOI为100时，细胞状态最佳且荧光表达最强。当MOI≥300时显微镜下可观察到细胞死亡。根据最适MOI值，将无荧光标记的Adv-Bic及AdvNT-3转染骨髓干细胞在体外培养1周，免疫荧光及实时荧光定量PCR检测结果显示，VEGF165、NT-3、Ang-1均阳性表达，说明通过病毒转染的方法成功使骨髓间充质干细胞过表达VEGF165、NT-3、Ang-1。此外，血管内皮细胞特异性标志物CD31、CD34，神经元相关特异性标志物NSE、Nestin检测结果均为阳性，说明骨髓间充质干细胞在VEGF165、NT-3、Ang-1的诱导下能向血管内皮细胞、神经元分化。因此，VEGF165、NT-3、Ang-1基因转染的骨髓间充质干细胞，能为后续实验构建脊髓损伤修复支架提供种子细胞。但是将该种子细胞和组织工程支架共同移植到损伤脊髓局部，骨髓间充质干细胞能否真正的向内皮细胞或神经元分化需提供进一步的实验证据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血管内皮生长因子165、神经营养因子3、血管生成素1基因转染诱导骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞分化

Transfection with vascular endothelial growth factor 165, neurotrophin 3 and angiopoietin 1 induces the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neurons and vascular endothelial cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	闵友江, 姚海华, 孙洁, 周璇, 余航, 孙前谱, 洪恩四. 磁共振评价“三通针法”对脊髓损伤患者脑功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-8.
[3]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[4]	蒋红英, 朱亮, 余曦, 黄靖, 向小娜, 兰正燕, 何红晨. 富血小板血浆干预脊髓损伤患者压力性损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1149-1153.
[5]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[8]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[9]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[10]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[11]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[12]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[13]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[14]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[15]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.