吡咯烷二硫氨基甲酸干预脂多糖刺激下牙周膜干细胞RANKL和OPG的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0901

摘要/Abstract

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文题释义：
RANKL：核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB Ligand)是肿瘤坏死因子配体超家族成员之一。RANKL在诱导破骨细胞分化、调节其功能方面发挥着重要作用。RANKL与破骨细胞前体细胞膜表面的核因子κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)结合后可促进破骨细胞分化和激活，并抑制其程序性死亡，进而促进骨吸收。
骨保护蛋白(osteoprotegerin，OPG)：是RANKL的天然抗体，可以直接与RANKL结合，竞争性抑制RANKL与RANK的结合，进而抑制破骨细胞的分化、成熟，抑制骨吸收。生理状态下，体内OPG和RANK表达量保持一定的比例，参与维持成骨与破骨的动态平衡。如果二者比例失衡，则会引起骨代谢紊乱，造成骨相关疾病的发生。

摘要
背景：研究表明，调控破骨细胞、成骨细胞形成与分化的多种细胞因子，如RANKL和OPG主要是由成骨细胞和骨髓基质细胞分泌的，而与骨髓基质细胞同源的牙周膜干细胞在炎症免疫调控过程中也发挥着显著作用，因此极有可能在毒力因子刺激下也参与RANKL和OPG的表达调控，从而介导牙槽骨吸收。
目的：探讨采用吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)抑制核因子κB活性能否缓解炎症状态下牙周膜干细胞中RSNKL/RANK/OPG系统的失衡状态。
方法：将第4代牙周膜干细胞分为4组：①对照组：含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基；②脂多糖组：培养基中加入10 mg/L脂多糖；③10 μmol/L PDTC组：用10 μmol/L的PDTC处理细胞30 min，弃去培养基，再加入含10 mg/L脂多糖的培养基；④100 μmol/L PDTC组：用100 μmol/L的PDTC处理细胞30 min，弃去培养基，再加入含10 mg/L脂多糖的培养基。后两组在PDTC处理30 min后倒置显微镜下观察细胞形态，培养24 h后，收集细胞采用RT-PCR检测各组细胞OPG、RANKL mRNA表达量及RANKL/OPG比值变化。
结果与结论：①PDTC预处理浓度达100 μmol/L即可引起细胞形态学改变：细胞贴壁部分回缩，变圆，胞体缩小；②与对照组比较，脂多糖组RANKL表达显著升高(P < 0.05)，10 μmol/L PDTC组RANKL表达较脂多糖组无显著性变化(P > 0.05)，100 μmol/L PDTC组RANKL表达较脂多糖组显著降低(P < 0.05)；③与对照组比较，脂多糖组OPG表达略低(P > 0.05)，10 μmol/L PDTC组OPG表达较脂多糖组显著升高(P < 0.05)，100 μmol/L PDTC组OPG表达与脂多糖组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④与对照组比较，其余各组RANKL/OPG比值均有显著升高(P < 0.05)，脂多糖组升高最明显，随着PDTC浓度升高，RANKL/OPG比值逐渐降低(P < 0.05)；⑤结果表明，牙周膜干细胞可能在炎症状态下通过改变RANKL及OPG表达量参与调控破骨细胞分化成熟，而PDTC能够通过抑制核因子κB活性缓解炎症状态下牙周膜干细胞中RANK/ RANKL/OPG系统的失衡状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8866-3228(王娉婷)

关键词: 牙周膜干细胞, 骨保护蛋白, 核因子κB受体活化因子配体, 脂多糖, 吡咯烷二硫氨基甲酸, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: It is generally believed that various cytokines, such as receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG), which regulate osteoclast and osteoblast formation and differentiation, are mainly secreted by osteoblasts and bone marrow stromal cells. Whereas in the periodontal tissues, homologous periodontal ligament stem cells (PDLSCs) also play a significant role in the regulation of inflammation and immunity. Thus, virulence factors are very likely to mediate alveolar bone resorption by involvement in the regulation of RANKL and OPG.
OBJECTIVE: To explore whether the inhibition of nuclear factor-κB activity by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) can relieve the imbalance of RANKL/RANK/OPG system in PDLSCs in inflammatory state.
METHODS: After isolation, culture and differentiation in vitro, passage 4 PDLSCs were divided into four group: control group, cultured in the DMEM medium containing 10% fetal bovine serum; lipopolysaccharide (LPS) group, cultured in the DMEM medium containing 10 mg/L LPS; 10 μmol/L PDTC group, pretreated with 10 μmol/L PDTC for 30 minutes followed by removal of the medium and addition of the medium containing 10 mg/L LPS; 100 μmol/L PDTC group, pretreated with 100 μmol/L PDTC for 30 minutes followed by removal of the medium and addition of the medium containing 10 mg/L LPS. In the latter two groups, cell morphology was observed under inverted microscope at 30 minutes after PDTC pretreatment. After 24 hours of culture, expression of OPG and RANKL mRNA and the ratio of RANKL/OPG in cells were detected in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) PDTC pretreatment at a concentration of 100 μmol/L could cause cell morphological changes: some cells were adherent and retracted, and became round with the cell body shrinking in size. (2) Compared with the control group, the expression of RANKL in the PDLSCs was significantly increased in the LPS group (P < 0.05), and the expression of RANKL in the PDLSCs pretreated with 10 μmol/L PDTC had no significant change (P > 0.05), while compared with the LPS group, the expression of RANKL in the PDLSCs pretreated with 100 μmol/L PDTC was significantly lowered (P < 0.05). (3) Compared with the control group, the expression of OPG in the PDLSCs was slightly lowered in the LPS group (P > 0.05). After pretreatment with 10 μmol/L PDTC, the expression of OPG in the PDLSCs was significantly increased (P <0.05) compared with the LPS group, while the expression of OPG in the PDLSCs pretreated with 100 μmol/L PDTC had no significant difference from that in the LPS group (P > 0.05). (4) Compared with the control group, the ratios of RANKL/OPG in the other groups were significantly increased (P < 0.05), especially in the LPS group. With the increase of PDTC concentration, the ratio of RANKL/OPG decreased gradually(P < 0.05). These results reveal that PDTC can relieve the imbalance of RANK/RANKL/OPG system in the PDLSC in inflammatory state by inhibiting nuclear factor-κB activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Periodontal Ligament, Stem Cells, Osteoprotegerin, RANK Ligand, Pyrrolidines, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王娉婷，周盼，郑国莹，刘大勇. 吡咯烷二硫氨基甲酸干预脂多糖刺激下牙周膜干细胞RANKL和OPG的表达[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3365-3370.

Wang Ping-ting, Zhou Pan, Zheng Guo-ying, Liu Da-yong. Intervention with pyrrolidine dithioearbamate stimulates expression of RANKL and OPG in lipopolysaccharide-stimulated periodontal ligament stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3365-3370.

图/表（结果） 2

2.1 牙周膜干细胞的培养与鉴定 分离培养所得细胞生长、传代良好。经成脂诱导7 d后，油红O染色可见红色油状脂滴(图1A)，提示牙周膜干细胞具有成脂分化潜能；经成骨诱导21 d后，茜素红染色可见有橘红色矿化结节(图1B)，提示牙周膜干细胞具有成骨分化潜能。

2.2 不同浓度PDTC对牙周膜干细胞形态的影响 倒置显微镜下观察可见，10 μmol/L PDTC预处理组多数细胞形态与对照组相比变化不大，个别细胞形态改变明显，细胞贴壁部分回缩，呈圆形，体积缩小；而100 μmol/L PDTC预处理组大多数细胞形态改变明显，呈凋亡状态(图2)。

2.3 不同浓度PDTC对脂多糖刺激下牙周膜干细胞中RANKL和OPG mRNA表达的影响 各组细胞RANKL mRNA表达见图3。

与对照组比较，仅加入脂多糖组的RANKL mRNA表达显著升高(P < 0.05)；使用10 μmol/L PDTC预处理组的RANKL mRNA表达较脂多糖组有所升高，但差异无显著性意义(P > 0.05)；使用100 μmol/L PDTC预处理组的RANKL mRNA表达较脂多糖组显著降低(P < 0.05)，但高于对照组(P < 0.05)。

各组细胞OPG mRNA表达情况见图4。与对照组比较，仅加入脂多糖组的OPG mRNA表达略低(P > 0.05)；10 μmol/L PDTC预处理组的OPG mRNA表达较脂多糖组显著升高(P < 0.05)；100 μmol/L PDTC预处理组的OPG mRNA表达较脂多糖组有所降低，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

各组细胞RANKL/OPG比值见图5。与对照组相比，其余各组RANKL/OPG均有显著升高(P < 0.05)；仅加入脂多糖组升高最明显，随着PDTC浓度的逐渐升高，RANKL/ OPG比值逐渐降低(P < 0.05)。

各组细胞OPG、RANKL mRNA表达量及RANKL/OPG比值见表2。

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引言

骨组织是一类结构复杂且代谢活跃的组织，在整个生命周期都在不断进行更新与改建，破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成之间的平衡维持着骨量的稳定，而破骨细胞、成骨细胞的形成与分化受多种激素及细胞因子的调控^[1-2]。肿瘤坏死因子配体超家族成员骨保护蛋白(osteoprotegerin，OPG)、核因子κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)以及核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB Ligand，RANKL)在诱导破骨细胞分化、调节其功能方面发挥着重要作用^[3]。RANKL与破骨细胞前体细胞膜表面的RANK结合后可促进破骨细胞分化和激活，并抑制其程序性死亡，进而促进骨吸收^[4-5]；OPG是RANKL的天然抗体，可以直接与RANKL结合，竞争性抑制RANKL与RANK的结合，进而抑制破骨细胞的分化、成熟，抑制骨吸收^[6-8]。生理状态下，体内OPG和RANK表达量保持一定的比例，参与维持成骨与破骨的动态平衡。如果二者比例失衡，则会引起骨代谢紊乱，造成骨相关疾病的发生^[9]。在牙周病致病过程中，以革兰阴性菌脂多糖为代表的毒力因子即通过刺激细胞分泌白细胞介素1、白细胞介素6、前列腺素E2等破骨因子，进而上调牙周局部组织细胞中RANKL的表达，下调OPG的表达，从而启动破骨过程，造成牙槽骨的吸收萎缩^[10-12]。一般认为RANKL和OPG主要是由成骨细胞和骨髓基质细胞分泌的，与骨髓基质细胞同源的牙周膜干细胞在炎症免疫调控过程中也发挥着显著作用^[13]，因此极有可能在毒力因子刺激下也参与RANKL和OPG的表达，从而介导牙槽骨吸收。

核因子κB是细胞中一个对环境改变快速应激的转录因子，调控多种基因的表达^[14-16]。在炎症反应中，核因子κB既在破骨细胞前体细胞中受RANKL/RANK/OPG系统的调控，同时又有研究显示其在RANKL分泌细胞中可能通过与转录因子Sp1协同作用激活RANKL的表达^[17]。而吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是目前最常用的核因子κB活性抑制剂，可以通过发挥其抗氧化功能，减少活性氧的产生，从而抑制IκB降解，进而阻止核因子κB进入细胞核调控基因表达^[15^，^18]。

实验检测PDTC对脂多糖刺激下牙周膜干细胞中RANKL和OPG表达的影响，其研究目的有两点：一是证实牙周膜干细胞是否具有通过改变RANKL和OPG表达进而调节炎症反应的功能，二是探讨采用PDTC抑制核因子κB活性能否缓解炎症状态下牙周膜干细胞中RANK/RANL/ OPG系统的失衡状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年1至11月在天津医科大学口腔医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂和材料 DMEM培养基、双抗、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS(美国HyClone公司)；PDTC、E.coli LPS、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、茜素红染液(美国Sigma公司)；TRIZOL总RNA提取试剂、HiFi-MMLV二步法RT-PCR试剂盒、2×GoldStar Best MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.3.2 实验设备和仪器 CO₂恒温培养箱、超净工作台(Thermo，美国)；超低温冰箱(Forma scientific，美国)；台式高速冷冻离心机、微量移液器(Eppendorf，德国)；光学显微镜、倒置相差显微镜(Olympus，日本)；PT-PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司)；DYY-7C型电泳仪、凝胶成像分析仪WD-9413B(北京六一仪器厂)；DYCP-31D型水平式电泳槽(北京宾达英创科技有限公司)；紫外分析仪(北京尚柏生物)；紫外分光光度计UV-2000(尤尼柯仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 牙周膜干细胞的分离培养 取因正畸原因新鲜拔除的成人双尖牙，刮取牙根中1/3的牙周膜组织，采取组织块法进行原代培养。课题组已形成成熟的培养方法，详见课题组已发表文献^[19]。取第3代细胞用于后续实验。

1.4.2 牙周膜干细胞分化潜能鉴定 取生长状况良好的纯化的第3代牙周膜干细胞，以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于6孔板，待细胞生长至80%融合后，培养基更换为成脂诱导培养液(含体积分数为10%优质胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L链霉素、0.5 mmol/L异丁基-甲基黄嘌呤，60 μmol/L消炎痛，0.5 μmol/L氢化可的松，10 μg/L胰岛素的α-MEM培养基)。每2 d换液1次，倒置显微镜下每日观察脂滴形成情况。诱导7 d后进行油红O染色。

以相同的细胞浓度接种于6孔板中，待细胞融合达80%后，培养基更换为成骨诱导液(含体积分数为10%胎牛血清、10 mmoI/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C、0.25 μmol/L地塞米松、0.36 mol/L磷酸二氢钾、1∶200谷氨酰氨的α-MEM培养基)。每2 d换液1次，观察钙结节在光学显微镜下的形成情况。成骨诱导21 d后进行茜素红染色。

1.4.3 脂多糖刺激牙周膜干细胞及不同浓度PDTC预处理 取对数生长期的第4代牙周膜干细胞，以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于35 mm培养皿，待细胞融合达80%后，弃上清，加入不含血清的DMEM培养基过夜，再弃去原培养基，按以下分组加入新鲜培养基：①对照组：含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基；②脂多糖组：培养基中加入10 mg/L脂多糖；③10 μmol/L PDTC组：用10 μmol/L的PDTC处理细胞30 min，弃去培养基，再加入含10 mg/L脂多糖的培养基；④100 μmol/L PDTC组：用100 μmol/L的PDTC处理细胞30 min，弃去培养基，再加入含10 mg/L脂多糖的培养基。后两组在PDTC处理30 min后倒置显微镜下观察细胞形态，并与对照组比较。培养24 h后，收集细胞进行后续检测。

1.4.4 总RNA提取及RT-PCR反应 各组细胞总RNA的提取按TRIZOL试剂盒说明书进行。紫外分光光度计检测RNA提取质量。采用反转录试剂盒，将总RNA反转录为cDNA做模板进行RT-PCR反应。以β-actin为内参。实验所涉及的引物序列见表1。

1.4.5 琼脂糖凝胶电泳实验 用PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，取产物5 μL加样于凝胶点样孔，行潜水槽平板电泳，电压80 V条件下电泳50 min。结束后取出凝胶，置于紫外投射仪下，采用quality one凝胶成像分析系统扫描分析各光带灰度值。以各组样本OPG，RANKL目的基因条带与β-actin参照基因条带灰度值之比作为OPG，RANKL mRNA表达的相对含量。

1.5 主要观察指标 ①牙周膜干细胞成脂、成骨分化诱导效果；②不同浓度PDTC预处理后牙周膜干细胞的形态学改变；③牙周膜干细胞在脂多糖刺激下RANKL、OPG的表达量变化；④不同浓度PDTC预处理后牙周膜干细胞在脂多糖刺激下RANKL、OPG的表达量及RANKL/OPG比值的变化。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13. 0软件对数据x(_)±s进行统计分析，两组之间的差异比较采用两独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近年来，干细胞的免疫调节功能日益收到学者们的重视。牙周膜干细胞作为牙周组织中的主要干细胞群体，其免疫调节作用和定向分化能力一样，与牙周病炎症过程中牙槽骨的吸收有着密切而复杂的联系^[20-21]。探究牙周膜干细胞在炎症状态下对破骨细胞分化成熟的调节作用以及该作用通过何种机制得以发挥，对全面理解牙周膜干细胞的病理生理功能具有重要意义，同时也将为抑制病理性骨吸收，提高牙周病临床治疗效果提供新的线索。

脂多糖是牙周病过程中的一种重要的毒力因子，能够直接对牙周组织细胞产生细胞毒作用，抑制其对根面的趋动附着^[22]；同时也可作为活化因子，刺激炎性递质和破骨因子的释放，改变RANK/RANKL/OPG系统的表达平衡，从而在牙槽骨的吸收过程中发挥重要作用^[10-12]。实验采用脂多糖刺激牙周膜干细胞，模拟了牙周病炎症状态下牙周膜干细胞的反应，结果发现，经脂多糖刺激后，牙周膜干细胞的RANKL表达量显著升高，OPG表达量无显著性变化，说明在炎症状态下，牙周膜干细胞通过改变RANK/ RANKL/OPG系统的平衡状态，参与了破骨细胞的激活过程。在该实验中，RANKL/OPG比值增高为正常状态的5倍，失去OPG有效拮抗的高表达RANKL可以与破骨细胞前体细胞表面的RANK结合，促进破骨细胞的分化成熟，进而加速骨吸收进程。

核因子κB与RANK/RANKL/OPG系统功能密切相关。如前所述，炎症状态下，核因子κB既在破骨细胞前体细胞中受RANK/RANKL/OPG系统的调控，又在RANKL分泌细胞中通过与转录因子Sp1协同作用激活RANKL表达。因此，抑制核因子κB的活性可能逆转或缓解RANK/RANKL/ OPG系统的失衡状态。该实验采用核因子κB活性抑制剂PDTC作用于即将被脂多糖刺激的牙周膜干细胞，以观察其是否能够改变RANKL和OPG的表达水平。

PDTC是常见的抗氧化治疗药物，同时也被广泛用作核因子κB的抑制剂。上述两方面作用理论上均有利于控制牙周病过程中的牙槽骨吸收。一方面，PDTC通过螯合金属离子、清除活性氧中间体以及减少活性氧总量抑制脂多糖、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等诱导的炎性细胞因子释放以及内皮细胞凝血酶合成^[23-26]，从而缓解炎症发展^[27-28]；另一方面，PDTC通过特异性抑制核因子κB活性亚单位P65表达、阻止IκB磷酸化降解以及阻碍活性亚基核向转移等途径^[29-31]，阻断核因子κB信号通路下游基因的激活(其中即包括RANKL表达)。如能在牙周病相关细胞内证实并充分利用上述两方面作用，则有望确定PDTC在牙周病治疗中的应用潜能。该实验中选用10 μmol/L和100 μmol/L两种不同浓度的PDTC预处理即将被脂多糖刺激的牙周膜干细胞，旨在针对其抑制核因子κB活性的作用进行研究，探讨其通过该途径逆转或缓解RANKL/RANK/OPG系统失衡的能力和效果。实验结果主要说明了以下3个方面问题。第一，细胞形态学观察显示，经PDTC处理后可见细胞呈现凋亡形态。在作者的前期研究中也发现PDTC能明显抑制细胞的增殖，而较高浓度的PDTC能够促进细胞的凋亡，这与该实验结果一致。PDTC这种促进凋亡的作用可能与其抑制核因子κB活性有关。有研究证明，细胞凋亡现象是炎症消退的重要表现^[32]，牙周组织炎症情况下，核因子κB的激活可以诱导抗凋亡基因的表达而抑制肿瘤坏死因子α介导的细胞凋亡。因此，PDTC通过抑制核因子κB活性促进细胞凋亡有助于启动炎症消退过程，提示其在牙周病抗炎治疗中应用的可能。第二，PDTC对脂多糖刺激下牙周膜干细胞中RANKL及OPG表达量均产生影响，其对二者的影响均显示出剂量依赖特征。在10 μmol/L的较低浓度下，牙周膜干细胞中RANKL表达较脂多糖刺激组无显著性差异，而OPG表达较脂多糖刺激组有所升高，显示该浓度下PDTC缓解RANK/RANKL/OPG系统失衡的作用主要通过上调OPG表达量得以实现，具体信号通路目前尚不明确，有待深入探究。在100 μmol/L的较高浓度下，牙周膜干细胞中RANKL表达均较脂多糖刺激组显著降低，而OPG表达均较脂多糖刺激组无显著性差异，表明该浓度下PDTC缓解RANK/RANKL/OPG系统失衡的作用主要通过抑制牙周膜干细胞中核因子κB活性、下调RANKL表达量得以实现。从该实验结果来看，RANKL表达与PDTC的剂量依赖关系易于理解，即PDTC需达到一定浓度方可发挥下调RANKL表达的作用，浓度较低时不显示此项作用；然而，OPG表达与PDTC的剂量依赖关系较为复杂，较低浓度的PDTC发挥了上调OPG的作用，而较高浓度的PDTC反而有抑制OPG表达的趋势(差异无显著性意义)。这一现象以现有对PDTC作用的认知尚无法解释，还有待进一步明确PDTC对OPG的调控机制后深入研究。第三，由于PDTC对RANKL和OPG的调控作用呈现不同趋势的复杂剂量依赖关系，因此探讨其对RANK/RANKL/OPG系统的调控作用不能单纯观察RANKL及OPG的表达量，而必须考虑不同浓度下RANKL/OPG表达量的比值。该实验结果显示，随着PDTC浓度的升高，RANKL/OPG比值逐渐下降，表明PDTC能够有效缓解炎症状态下牙周膜干细胞中RANK/RANKL/OPG系统的失衡状态，有利于抑制破骨细胞分化成熟，因而具有抑制牙周病过程中牙槽骨吸收的应用潜质。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程